БИОФИЗИКА, 2019, том 64, № 6, с. 1216-1220

БИОФИЗИКА CЛОЖНЫX CИCТЕМ

УДК 542.957:547.7:547.854:547.857:615.27.3

ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ ДИНИТРОЗИЛЬНОГО

КОМПЛЕКСА ЖЕЛЕЗА С МЕРКАПТОСУКЦИНАТОМ НА МОДЕЛЯХ

СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ МЫШЕЙ

В.А. Рыкова***, М.М. Фомина***

*Институт химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН, 119334, Москва, ул. Косыгина, 4

**Институт регенеративной медицины Первого Московского государственного медицинского университета

им. И.М. Сеченова, 119991, Москва, Трубецкая ул. 8

***Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334, Москва, ул. Косыгина, 4

E mail: vanin@polymer.chph.ras.ru

Поступила в редакцию 25.07.2019 г.

После доработки 25.07.2019 г.

Принята к публикации 07.09.2019 г.

Проведено изучение противоопухолевого действия биядеpной формы динитpозильныx комплексов

железа c меркаптосукцинатом на моделях солидных опухолей мышей - карциноме легкиx Льюиc и

аденокарциноме Акатол - при внутривенном введении препарата. Максимальный эффект - тор-

можение роста опухоли (каpцинома Льюиc) на 65% по сравнению с контролем - наблюдается при

внутривенном введении препарата в суточной дозе 2,5 мкМ/кг шестикратно с интервалом в двое-

трое суток в период с первых по семнадцатые сутки после перевивки опухоли.

Ключевые слова: оксид азота, динитрозильные комплексы железа, модели солидных опухолей мышей

(карцинома легких Льюис, аденокарцинома Акатол), внутривенное введение.

DOI: 10.1134/S0006302919060218

ли того же уровня, что и в контроле. Ростингиби-

Ранее нами было обнаружено противоопухоле-

рующий эффект препаратов повышался с увеличе-

вое действие биядеpной формы динитpозильныx

нием дозы Б-ДНКЖ-Г и был наиболее выражен-

комплексов железа c глутатионом (Б-ДНКЖ-Г) на

ным (80%) при применении препарата в дозе

модели солидной опухоли мышей - каpциноме

200 мкМ/кг (в пересчете на один Fe(NO)₂-фраг-

легких Льюиc. Противоопухолевый эффект этих

комплексов имел дозо-зависимый характер и про-

мент в этих комплексах) [1-3].

являлся при внутрибрюшинном десятикратном

В дальнейшем при исследовании зависимости

введении препарата в разовых дозах 25; 50; 125 и

противоопухолевого эффекта Б-ДНКЖ-Г от дозы,

200 мкМ/кг. В диапазоне указанных доз противо-

пути и режима введения соединения нами была об-

опухолевая активность комплексов железа выра-

наружена значительная противоопухолевая актив-

жалась в торможении роста опухоли на 60-80% по

ность препарата при внутривенном введении в су-

сравнению c контролем, изменяясь в зависимости

щественно меньших дозах, чем при внутрибрю-

от дозы препарата и сроков оценки эффекта. Ин-

шинном введении комплекса. Так, максимальный

гибирование роста карциномы Льюис под влияни-

эффект - торможение роста карциномы Льюис на

ем динитрозильных комплексов железа наблюда-

90% по сравнению с контролем - достигался при

лось в период введения препарата на протяжении

внутривенном применении Б-ДНКЖ-Г в суточ-

семи-десяти суток. В более поздние сроки, после

ной дозе 2 мкМ/кг, пятикратно, с интервалами в

окончания курса введения препарата, скорости ро-

двое-трое суток, в период с первых по четырнадца-

ста опухолей у леченых и контрольных животных

тые сутки после перевивки опухоли [4].

практически совпадали, в результате чего размеры

Аналогичный эффект был описан в статье груп-

опухолей у леченых животных к 20 суткам достига- пы исследователей, возглавляемой профессором

W.-F. Liaw (Тайвань), при изучении водораствори-

Сокращения: Б-ДНКЖ-Г - биядеpные динитpозильные ком- мых моноядерных динитрозильных комплексов

плексы железа c глутатионом, Б-ДНКЖ-С - биядеpные ди-

железа, включающих в себя два тиол-содержащих

нитpозильные комплексы железа c меркаптосукцинатом,

ТРО - коэффициент торможения роста опухоли.

лиганда - (S-(CH)₂OH) и (S(CH)₂NH₃) и один же-

1216

ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ

1217

лезо-динитрозильный (Fe(NO)₂-фрагмент [5]. В

Биологический эксперимент. Эксперименты

цитируемой работе сообщается о значительном

проведены на 50 инбредных мышах линии BDF₁ и

противоопухолевом эффекте этих комплексов на

Balb/c, самках с массой тела 18-20 г, разведения

модели ксенографтов рака простаты человека у

питомника «Филиал «Столбовая» НЦБМТ ФМБА

мышей. Указанные комплексы при внутривенном

России».

введении в суточной дозе 0,73 мкМ/кг каждые три

В качестве опухолевых тест-систем служили со-

дня в течение 21 суток вызывали торможение роста

лидные опухоли мышей - карцинома легких Лью-

опухолей на 60 и 95% по сравнению с контролем на

ис и аденокарцинома Акатол, перевиваемые под-

седьмые и двадцать первые сутки развития опухо-

кожно в соответствии со стандартной методикой

ли соответственно. Было показано, что ингибиро-

[7].

вание роста опухолей под влиянием испытанных

веществ обусловлено апоптотической гибелью

Водный раствор Б-ДНКЖ-С вводили мышам

опухолевых клеток, инициированной высвобож-

внутривенно в хвостовую вену в суточных дозах 2,5

дением из моноядерных динитрозильных ком-

и 5 мкМ/кг шестикратно на 1, 4, 7, 10, 14, 17 сутки

плексов железа монооксида азота (NO) [5].

после перевивки карциномы легких Льюис и с пер-

вых по шестые сутки - животным с аденокарцино-

В развитие данного направления исследований

мой Акатол.

нами проведено изучение пpотивоопуxолевого

дейcтвия нового препарата - биядеpной фоpмы

Оценка противоопухолевой активности. Показа-

динитpозильныx комплексов железа c меркапто-

телем ростингибирующего эффекта препарата слу-

сукцинатом (Б-ДНКЖ-С) на моделях солидных

жили различия в кинетике роста опухолей (коэф-

опухолей мышей - карциноме легких Льюис и аде-

фициент торможения роста опухоли - ТРО). ТРО

нокарциноме Акатол при внутривенном введении

определяли из соотношения: ТРО

= (Р_С

препарата.

‒ Р_Т)/Р_С (%), где Р_Си Р_Т - объем (или масса) опу-

холи в группах контрольных (С) и леченых (Т) жи-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

вотных соответственно. Для изучения кинетики

Материалы. В экспериментах использовали

роста опухолей проводили измерение двух взаим-

ферросульфат железа (FeSO₄ ·

7H₂O) (Fluka,

но перпендикулярных размеров опухолевого узла

Швейцария), меркаптосукцинат и нитрит натрия

на протяжении всего периода развития опухолей.

(Sigma, США). Газообразный NO получали в реак-

Объем опухоли вычисляли в соответствии с фор-

ции ферросульфата железа с нитритом натрия в

мулой для эллипсоида как V = ab²/2, где a - длина,

0,1 М растворе HCl с последующим разделением

b - ширина и высота опухолевого узла. При оценке

NO и примесного диоксида азота (NO₂) методом

массы опухоли использовали значение плотности

низкотемпературной сублимации жидкой смеси

опухолевой ткани, равное 1 г/см³. Показатель из-

этих газов в вакуумированной системе, как это

менения средней продолжительности жизни мы-

описано в работе [6].

шей (Δτ, %) определяли как Δτ = = (τ_С - τ_Т)/τ_С

Синтез биядерной формы динитpозильныx ком-

(%), где τ_С и τ_Т - средняя продолжительность жиз-

плексов железа с меркаптосукцинатом. Б-ДНКЖ-С

ни контрольных и леченых животных [7].

синтезировали обработкой газообразным NO (при

давлении 150 мм рт. ст.) 1 мл раствора ферросуль-

Каждая группа животных, получавших терапев-

фата в дистиллированной воде и 4 мл 15 мМ рас-

тическое воздействие, состояла из шести-восьми

твора меркаптосукцината в 15 мМ HEPES-буфере

мышей пpи восьми-десяти животных в контроле.

(рН 7,4), помещенных соответственно в верхнюю и

Наблюдение за животными продолжалось в тече-

нижнюю части аппарата Тунберга, с последующим

ние всего периода развития опухоли, вплоть до ги-

смешиванием этих растворов в присутствии NO,

бели животных.

как это описано в работе [6]. Концентрация ферро-

Статистическая обработка данных. Статисти-

сульфата в этой смеси составляла 5 мМ. После пя-

ческая обработка оценок размеров опухолей

тиминутного встряхивания смеси, приводившей к

(массы опухолей) у животных проведена с ис-

включению всего двухвалентного железа в Б-ДН-

пользованием пакета компьютерных программ

КЖ-С, NO удаляли из аппарата откачкой, раствор

Statistica 6.0. Оценка достоверности различий

полученного Б-ДНКЖ-С замораживали и исполь-

между средними значениями, характеризующи-

зовали (после разморозки) в экспериментах на жи-

ми массу опухоли в группах контрольных и лече-

вотных.

ных животных, проведена с помощью t-критерия

Концентрацию Б-ДНКЖ-С оценивали по ин-

Стьюдента. Различия между лечеными и кон-

тенсивности полосы его оптического поглоще-

трольными группами животных признаются до-

ния на длине волны 360 нм с коэффициентом

стоверными при условии, что вычисленные зна-

экстинкции (в пересчете на один атом железа в

чения t превышают значения критерия Стьюден-

биядеpном динитpозильном комплекcе), равным

та для определенных уровней значимости при

6000 М^-1 см^-1.

заданном числе степеней свободы f [7].

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019

1218

ВАНИН и др.

как видно из представленных данных, усиливался

при снижении дозы препарата (рис. 1, табл. 1).

Противоопухолевое действие Б-ДНКЖ-С на мо-

дели солидной аденокарциномы Акатол. Примене-

ние комплекса Б-ДНКЖ-С в суточной дозе

2,5 мкМ/кг внутривенно ежедневно, шестикратно

вызывало торможение роста аденокарциномы

Акатол мышей - на 30% по сравнению с контро-

лем (рис. 2, табл. 2).

В условиях проведенных экспериментов препа-

рат Б-ДНКЖ-С не оказывает влияния на продол-

жительность жизни животных с изученными со-

лидными опухолями.

Представленные данные свидетельствуют о том,

что имеются существенные различия в выраженности

противоопухолевого эффекта Б-ДНКЖ-С в отноше-

нии двух моделей солидных опухолей - карциномы

Рис. 1. Влияние препарата Б-ДНКЖ-С на развитие кар-

легких Льюис (65%) и аденокарциномы Акатол

циномы легких Льюис: 1 - контроль; 2 - Б-ДНКЖ-С,

(30%) - при внутривенном применении препарата в

доза 5 мкМ/кг в сутки; 3 - Б-ДНКЖ-С, доза 2,5 мкМ/кг

в сутки. Введение внутривенно на 1-е, 4-е, 7-е, 10-е,

одинаковой суточной дозе 2,5 мкМ/кг. Наблюдаемые

14-е, 17-е сутки после перевивки опухоли.

различия в эффективности препарата могут быть обу-

словлены как различиями в чувствительности разных

штаммов опухолей к изучаемому соединению, так и

РЕЗУЛЬТАТЫ

влиянием отличий в использованных режимах введе-

ния Б-ДНКЖ-С на его активность.

Противоопухолевое действие Б-ДНКЖ-С на

модели солидной карциномы легких Льюис. При

ОБСУЖДЕНИЕ

введении мышам Б-ДНКЖ-С в суточных дозах

Полученные результаты подтверждают обна-

2,5 и 5 мкМ/кг шестикратно в течение 17 суток с

руженный нами ранее факт резкого усиления

интервалом в двое-трое суток между инъекциями

противоопухолевого действия биядеpного ди-

развитие карциномы легких Льюис подавлялось

нитpозильного комплекcа железа с глутатионом

на 65 и 50% по сравнению с контролем соответ-

не при повышении их дозы, как это имело место

ственно. При этом противоопухолевый эффект,

при внутрибрюшинном введении этих комплек-

Таблица 1. Противоопухолевый эффект (Б-ДНКЖ-С) при внутривенном введении на модели карциномы легких

Льюис (введение препарата на 1-е, 4-е, 7-е, 10-е, 14-е и 17-е сутки после перевивки опухоли)

Суточная доза,

Средняя масса

ТРО, %

Критерий

Группа

τ, сутки

Δτ, %

мкМ/кг

опухоли, г

(16 сутки)

Стьюдента t

Б-ДНКЖ-С

2,5

2,00 ± 0,15

36,2 ± 3,1

3,45 > t_0,01 = 3,05

f = 12

Б-ДНКЖ-С

5,0

2,85 ± 0,35

35,5 ± 2,3

2,69 > t_0,05 = 2,22

f = 10

Контроль

5,61 ± 0,25

33,5 ± 5,4

Таблица 2. Противоопухолевый эффект комплекса Б-ДНКЖ-С при внутривенном введении на модели

аденокарциномы Акатол (введение шестикратно с 1-х по 6-е сутки после перевивки опухоли)

Суточная доза,

Средняя масса

ТРО, %

Критерий

Группа

τ, сутки

Δτ, %

мкМ/кг

опухоли, г

(16 сутки)

Стьюдента t

Б-ДНКЖ-С

2,5

3,04 ± 0,25

38,7 ± 2,1

3,45 > t_0,01 = 3,05

f = 12

Контроль

4,31 ± 0,35

36,3 ± 5,3

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019

ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ

1219

сов до 200 мкМ/кг [1-3], а наоборот, при пониже-

нии дозы Б-ДНКЖ-Г до 2 мкМ/кг при внутри-

венном введении соединения мышам-опухоле-

носителям [4].

Как отмечалось нами ранее, высокая эффек-

тивность противоопухолевого действия других би-

ядеpных динитpозильных комплексов железа с

тиолсодержащими лигандами (производными

этилмеркаптана) при низких дозах этих препара-

тов была впервые продемонстрирована группой

тайваньских исследователей под руководством

профессора W.-F. Liaw. Согласно результатам этой

работы моноядерные динитрозильные комплексы

железа с указанными лигандами при внутривен-

ном введении в разовой дозе 0,73 мкМ/кг ингиби-

ровали развитие ксенографтов рака простаты че-

ловека на 90% по сравнению с контролем (21 сутки

Рис. 2. Влияние препарата Б-ДНКЖ-С на развитие

развития опухоли) [5].

аденокарциномы Акатол мышей: 1 - контроль; 2 -

Б-ДНКЖ-С, доза 2,5 мкМ/кг в сутки. Введение

Встает вопрос, связанный с необходимостью

внутривенно, шестикратно, с 1-х по 6-е сутки.

объяснения обнаруженного нами в настоящей и

предыдущей работах феномена резкого повышения

противоопухолевого действия ДНКЖ с тиол-содер-

применении препаратов в пониженных (по отно-

жащими лигандами при понижении их дозы? Наи-

шению к тестированным) дозах, возможно, позво-

более правдоподобным ответом на этот вопрос нам

лят обнаружить более эффективное ростингиби-

представляется предположение о том, что указан-

рующее и цитотоксическое действие этих ком-

ные комплексы эффективно взаимодействуют не с

плексов на злокачественные опухоли.

опухолевыми, а с иммунокомпетентными клетка-

ми, в первую очередь с макрофагами.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Установлено, что макрофаги способны эффек-

Авторы заявляют об отсутствии конфликта ин-

тивно поглощать ДНКЖ с тиолсодержащими ли-

тересов.

гандами, появляющиеся в окружающей их среде

[8]. В результате при накоплении в этих клетках

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

значительного количества ДНКЖ высвобождаю-

Все применимые международные, националь-

щиеся из введенных препаратов молекулы NO или

ные и институциональные принципы ухода и ис-

ионы нитрозония могут снижать биологическую

пользования животных при выполнении работы

активность макрофагов, приводя тем самым к

были соблюдены.

ослаблению иммунитета и контроля над пролифе-

рацией опухолевых клеток [9].

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Действительно, как было показано нами в

1. А. Ф. Ванин, Л. А. Островская, Д. Б. Корман и др.,

предыдущей работе, внутривенное введение Б-ДН-

Биофизика 59, 508 (2014).

КЖ-Г в разовой дозе 100 мкМ/кг приводит к стиму-

2. А. Ф. Ванин, Л. А. Островская, Д. Б. Корман и др.,

ляции роста опухоли (карцинома Льюис) [4].

Биофизика 60, 152 (2015).

Иная ситуация имеет место при снижении дозы

3. А. Ф. Ванин, Л. А. Островская, Д. Б. Корман и др.,

комплексов Б-ДНКЖ-Г. В этом случае ДНКЖ,

Биофизика 60, 1157 (2015).

поступающие в иммунокомпетентные клетки в су-

4. А. Ф. Ванин, Л. А. Островская, Д. Б. Корман и др.,

щественно меньших дозах, вероятно, не оказыва-

Биофизика 62, 591 (2017).

ют заметного токсического влияния на биологиче-

5. S.-H. Wu, C.-Y. Lu, Y.-L. Chen, et al., Inorg. Chem.

скую активность этих клеток. Весьма возможно,

55, 9384 (2016).

что в этих условиях иммунокомпетентные клетки

6. A. F. Vanin, R. R. Borodulin, and V. D. Mikoyan, Ni-

сохраняют способность находить опухолевые

tric Oxide Biol. Chem. 66, 1 (2017).

клетки и, контактируя с ними, оказывать на них

7. Е. М. Трещалина, О. С. Жукова, Г. К. Герасимова

цитотоксическое действие путем «обстреливания»

и др., в сб. Руководство по проведению доклиниче-

опухолевых клеток как эндогенными, так и экзо-

ских исследований лекарственных средств, под ред.

генными (поступившими из окружающей среды)

А. Н. Миронова и др. («Гриф и К», М., 2012),

ДНКЖ.

Часть 1, сс. 642-657.

Таким образом, проведенные нами исследова-

8. H. Lewandowska, T. M. Stepkowski, S. Merczynska-

ния дают основание предполагать, что дальнейшее

Wielgosz, et al., J. Inorg. Biochem. 188, 29 (2018).

изучение противоопухолевого эффекта экзоген-

9. A. F. Vanin, Austin J. Analyt. Pharmaceut. Chem. 5,

ных ДНКЖ с тиолсодержащими лигандами при

1109 (2018).

БИОФИЗИКА том 64

№ 6

2019