БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 1, с. 17-23

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.322.9

К ВОПРОСУ О ВЫБОРЕ БЛОКИРУЮЩЕГО БЕЛКОВОГО АГЕНТА

ПРИ СОЗДАНИИ МЕТОДА ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОВЕРХНОСТНО-УСИЛЕННОЙ

РАМАНОВСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

С.П. Мамонтов, Л.В. Кулик*, Р.А. Хрусталёв

Государственный научно-исследовательский институт органической химии и технологии,

111024, Москва, шоссе Энтузиастов, 23

*Институт физики твердого тела РАН,

142432, Черноголовка Московской области, ул. Академика Осипьяна, 2

E-mail: kukushvi@mail.ru

Поступила в редакцию 10.07.2019 г.

После доработки 10.07.2019 г.

Принята к публикации 22.08.2019 г.

Целью работы является выбор блокирующего белкового агента для проведения быстрого и чувстви-

тельного иммунохимического анализа с использованием метода SERS (поверхностно-усиленной

рамановской спектроскопии). Для усиления сигнала рамановского рассеяния света от белковых

структур использована оптимизированная наноостровковая металл-диэлектрическая SERS-струк-

тура, а для измерения спектров усиленного оптического отклика использовался рамановский спек-

трометр с широким выходным лазерным пучком с длиной волны 532 нм. В результате проведенной

работы были оптимизированы SERS-подложки для получения высокоинтенсивного поверхностно-

усиленного рамановского рассеяния света от используемой в исследованиях метки (ТРИТЦ - тет-

раметилродамина изоцианат), также были изучены параметры адсорбции белков, традиционно ис-

пользуемых в твердофазном иммунохимическом анализе, и выбраны оптимальные - бычий сыво-

роточный альбумин и казеин. Показано, что при адсорбционном взаимодействии белка и SERS-по-

верхности действуют закономерности, описанные в классической адсорбционной теории.

Ключевые слова: рамановское рассеяние света, SERS, биосенсор, иммунохимический анализ, адсорбция

белков.

DOI: 10.31857/S0006302920010020

электрическом поле которой происходят осцил-

В последнее время области и объемы исполь-

ляции дипольного момента молекул. Все органи-

зования рамановской спектроскопии стреми-

ческие молекулы имеют характерные наборы

тельно расширяются. Этот вид оптической спек-

низкочастотных колебаний. Низкочастотное

троскопии является уникальным и мощным ин-

внутримолекулярное колебание атомов модули-

струментом для осуществления неразрушающего

рует высокочастотное колебание осциллирующе-

экспресс-метода в целях идентификации химиче-

го (и поэтому излучающего) дипольного момента

ских веществ и фармацевтических препаратов [1],

молекул. Из-за этого в спектре рассеянного света

обнаружения взрывчатых [2] и наркотических ве-

появляются частотные компоненты, сдвинутые

ществ [3], клинического исследования биологи-

относительно частоты лазерного излучения на ха-

ческих тканей и жидкостей [4], медицинской ди-

рактерные частоты внутримолекулярных колеба-

агностики состояния тканей [5] и др.

ний. Этот рамановский сдвиг позволяет одно-

Главная причина рамановского рассеяния све-

значно распознавать разнообразные вещества.

та в веществах заключается в том, что свет - это

электромагнитная волна, в высокочастотном

Однако чувствительность рамановских мето-

дов детектирования различных молекулярных

субстанций является чрезвычайно низкой, так

Сокращения: SERS - surface-enhanced Raman scattering (по-

верхностно-усиленная рамановская спектроскопия), как вероятность стоксовой компоненты раманов-

БСА - бычий сывороточный альбумин, ТРИТЦ - тетра-

метилродамина изоцианат.

ского рассеяния света составляет 10^-6, что ставит

CУБЕКИН и др.

под сомнение возможность использования рама-

500 нм помимо рамановского сигнала возникает

новской спектроскопии для детектирования низ-

интенсивная фотолюминесценция, которая пре-

ких концентраций веществ. Эту ситуацию можно

пятствует надежному измерению рамановского

радикально изменить, если исследуемые молеку-

рассеяния света. Самый простой способ подавле-

лы нанести, к примеру, вблизи границы раздела

ния сигнала фотолюминесценции заключается в

металла и диэлектрика, на которой формируются

уменьшении энергии фотонов накачки (ниже ха-

поверхностные плазмон-поляритоны и происхо-

рактерной ширины запрещенной зоны молеку-

дит фокусировка электромагнитного излучения

лы). И наконец, чувствительность рассматривае-

вблизи границы раздела этих сред. При взаимо-

мого метода может быть значительно увеличена

действии молекул веществ, находящихся на таких

за счет эффектов резонансной рамановской спек-

поверхностях, с усиленным электромагнитным

троскопии. Традиционные наноостровковые ме-

полем происходит значительное увеличение ин-

талл-диэлектрические SERS-подложки имеют

тенсивности рамановского рассеяния света - в

пик плазмонного поглощения на длинах волн

450-600 нм. По этим причинам наиболее целесо-

10⁵-10⁷ раз [6]. Это явление называется поверх-

образным представляется использование лазер-

ностно-усиленным рамановским рассеянием

ного излучения в диапазоне длин волн 500-

света (в англоязычной литературе SERS - surface-

550 нм для детектирования SERS-сигналов ис-

enhanced Raman scattering) и используется при со-

следуемых веществ.

здании биосенсоров. Эти биосенсоры являются

чрезвычайно перспективными для решения задач

После выбора длины волны лазерного излуче-

по высокочувствительному и быстрому детекти-

ния второй важной задачей в процессе создания

рованию белковых молекул при проведении им-

метода иммунохимического анализа на основе

мунохимического анализа

[7]. Применение

SERS-эффекта является подбор блокирующего

SERS-репортеров, т. е. молекул, обладающих ин-

агента. При проведении теста свободные сайты

дивидуальным высокоинтенсивным раманов-

на поверхности твердой фазы, не связанные с

ским спектром, в качестве маркеров исследуемых

анализируемым антигеном, могут неспецифиче-

белков способствует дополнительному усилению

ски фиксировать меченые антитела, что приводит

сигнала [8].

к повышению фонового сигнала. Для предотвра-

щения неспецифического связывания после им-

Оптимизация методов иммунного анализа с

мобилизации на твердую фазу аналита проводят

использованием SERS-биосенсоров особенно

обработку нейтральными для теста веществами -

актуальна для создания чувствительной, селек-

блокирующими агентами.

тивной и быстрой диагностики различных пато-

генов, что имеет первостепенное значение при

К блокирующим агентам предъявляются сле-

обеспечении экологической и биологической

дующие требования:

безопасности, а также в случаях, требующих не-

- отсутствие конкуренции с антигеном за цен-

отложной медицинской помощи. SERS-биосен-

тры адсорбции на поверхности;

соры можно рассматривать как хорошую альтер-

- отсутствие маскирующих для антител

нативу широко применяемым в настоящее время

свойств;

методам твердофазного иммуноферментного

- большая аффинность к поверхности по

анализа, которые, к сожалению, не являются экс-

пресс-методами.

сравнению с антителами;

- инертность по отношению к антителам, от-

При создании высокочувствительной методи-

сутствие перекрестного взаимодействия.

ки детектирования белков на основе поверхност-

но-усиленного рамановского рассеяния света в

Приемлемый блокирующий агент подбирает-

первую очередь необходимо выбрать длину вол-

ся для конкретного исследования в процессе оп-

ны лазерного излучения. Важность правильного

тимизации методики. Широкое распространение

выбора обусловлена несколькими причинами.

в иммуноферментном анализе получили такие

Возбуждение рамановского рассеяния света вы-

вещества, как бычий сывороточный альбумин

сокочастотным лазерным излучением по сравне-

(БСА) [9], казеин [2], обезжиренное молоко [10] и

нию с низкочастотным излучением имеет на по-

ряд других. В случаях, когда аналитический от-

рядок большую эффективность вследствие выра-

клик сильно зависит от расстояния между SERS-

женной частотной зависимости рамановской

репортером и поверхностью с плазмонными

активности молекул. Кроме этого, чувствитель-

свойствами [6], на которой образуется иммунный

ность (квантовая эффективность) кремниевых

комплекс, рекомендуется применять в качестве

матриц-детекторов является функцией длины

блокирующих агентов низкомолекулярные веще-

волны излучения. Максимум их чувствительно-

ства, например глутатион [11] и подобные ему со-

сти приходится на диапазон 450-550 нм. К тому

единения, содержащие амино- или сульфгид-

же при фотовозбуждении с длинами волн 350-

рильную группы.

БИОФИЗИКА том 65

№ 1

2020

К ВОПРОСУ О ВЫБОРЕ БЛОКИРУЮЩЕГО БЕЛКОВОГО АГЕНТА

Рис. 1. Возможные процессы взаимодействия белков с поверхностью с соответствующими им изотермами и

кинетическими кривыми адсорбции [14]. Г - количество адсорбированного белка; Δс - количество необратимо

адсорбированного белка; d - толщина белкового слоя.

Ключевым моментом при создании метода

ствует изотерме Лэнгмюра, однако толщина бел-

иммунного анализа является изучение адсорбции

кового слоя на поверхности твердой фазы вслед-

его компонентов. На сегодняшний день суще-

ствие переориентации молекул становится мень-

ствует множество работ, посвященных адсорбци-

ше. Изменение ориентации молекулы с

онному взаимодействию белков с различными

увеличением площади адсорбции приводит к уве-

поверхностями (кремнезем, силикагель, различ-

личению десорбции белка (рис. 1в), что соответ-

ные пластики для иммуноферментного анализа)

ствует наличию локального максимума на кине-

и влиянию условий адсорбции [12,13]. Известны

тической кривой и уменьшению толщины белко-

вого слоя на поверхности твердой фазы. И

модели адсорбции белков из одно- и многоком-

наконец, когда все адсорбированные молекулы,

понентных систем, созданные на основании тео-

изменяя конформацию, переходят в необратимо

ретических расчетов уравнения Лэнгмюра и на

адсорбированное состояние (рис. 1г), кинетиче-

многочисленных экспериментальных данных

ские кривые имеют не пологий наклон, как в

[14]. В этой работе представлена обширная теоре-

классической кривой, а скорее похожи на пря-

тическая база для понимания процессов адсорб-

мую, меняющую угол наклона [14]. Таким обра-

ции белков из растворов на поверхности твердых

зом, при создании метода анализа белковых

фаз различной природы (пластик, стекло и др.).

структур, в котором существенную роль играют

Выкладки с описанием возможных процессов

адсорбционные процессы, необходимо правиль-

взаимодействия белков с поверхностью, заслужи-

но выбрать эффективный блокирующий агент,

вающие особого внимания в рамках нашей ста-

изучить его адсорбцию как индивидуально, так и

тьи, представлены на рис. 1.

в присутствии других иммунореагентов для пони-

мания их взаимодействия друг с другом на по-

Из представленных на рис. 1 данных автор де-

верхности в условиях эксперимента.

лает вывод, что при отсутствии белок-белкового

взаимодействия на поверхности сорбента адсорб-

ция белка соответствует изотерме Лэнгмюра и

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

гладкой кинетической кривой (рис. 1а). В случае

если молекулы белка обратимо адсорбируются в

1. Для измерения спектров рамановского рассея-

одном конформационном (или ориентационном)

ния света использовали рамановский спектрометр

состоянии, но затем часть из них может перейти в

EnSpectr SERS R532 (Enhanced Spectrometry, США)

необратимо

адсорбированное

состояние

с широким выходным лазерным пучком, который за

(рис. 1б), кинетическая кривая также соответ-

одно измерение проводил усреднение сигнала со

БИОФИЗИКА том 65

№ 1

2020

CУБЕКИН и др.

Рис. 2. (а) - Микрофотография поверхности островковой SERS-подложки, полученная на сканирующем электронном

микроскопе; (б) - гистограмма распределения наночастиц по размерам; (в) - спектр поглощения SERS-подложки; (г) -

SERS-спектр ТРИТЦ на полученной подложке.

позиции проводили промывку дистиллирован-

всей площади SERS-зон (4 мм²) и тем самым мини-

ной водой, подложку высушивали на воздухе и

мизировал ошибку измерения, связанную с неодно-

измеряли SERS-сигнал (по пику ТРИТЦ при

родностью распределения молекул по поверхности

подложки. Длина волны лазерного излучения со-

1640 см^-1). Процедуру повторяли до достижения

ставляла 532 нм, мощность - 30 мВт, спектральный

суммарного времени адсорбции 60 мин.

диапазон - 100-4000 см^-1, спектральное разреше-

6. Десорбцию белков проводили погружением

подложки с иммобилизованным меченым белком

ние - 6 см^-1.

(сигнал предварительно измеряли) в раствор три-

2. SERS-структуру для детектирования белко-

тона Х-100 с концентрацией 0,2% в фосфатном

вых структур в низких концентрациях формиро-

физиологическом буфере, подложку выдержива-

вали на поверхности кремния с выращенным

ли определенное время, ополаскивали дистилли-

слоем оксида кремния SiO₂ с помощью установки

рованной водой от избытка буфера, высушивали

вакуумного термического напыления NANO 38

на воздухе, после чего проводили измерение сиг-

(скорость напыления серебра - 0,4 Å/с, толщина

нала. Процедуру повторяли до достижения сум-

эквивалентной пленки 60 Å) и последующим тер-

марного времени десорбции 60 мин.

мическим отжигом при температуре 120°С в тече-

ние 6 мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ

3. БСА, папаин и флуоресцентный краситель

тетраметилродамина изоцианат (ТРИТЦ) полу-

По разработанной нами методике были полу-

чены от компании Sigma-Aldrich (США), а казеин

чены и охарактеризованы серебряные SERS-суб-

от компании Serva (Германия).

страты на основе оксида кремния. Результаты

4. Меченые белки синтезировали в соответ-

этой работы представлены на рис. 2.

ствии со стандартной методикой [15].

Как видно на фотографии (рис. 2а), при напы-

5. Адсорбцию меченых белков (БСА, казеин,

лении серебра толщиной эквивалентной пленки

папаин) проводили погружением подложки в их

60 Å с последующим термическим отжигом под-

растворы с концентрацией 0,1 мг/мл в физиоло-

ложки при 120°C поверхность SERS-зон покры-

гическом фосфатном буфере (рН 7,4). После экс-

валась серебряными гранулами, средний размер

БИОФИЗИКА том 65

№ 1

2020

К ВОПРОСУ О ВЫБОРЕ БЛОКИРУЮЩЕГО БЕЛКОВОГО АГЕНТА

Рис. 3. (а) - Кинетические кривые адсорбции белков, (б) - кинетические кривые десорбции БСА, (в) - кинетические

кривые десорбции папаина, (г) - кинетические кривые десорбции казеина.

которых в плоскости подложки составлял 23 нм

традиционно используемых в твердофазном им-

(рис. 2б), средняя высота гранул - 8 нм, средний

муноферментном анализе. Результаты этого ис-

зазор между ними - 22,5 нм. Диэлектрические

следования представлены на рис. 3.

проницаемости серебра и оксида кремния обес-

Из данных рис. 3а следует, что БСА соответ-

печивают подстройку пика плазмонного погло-

щения (рис. 2в) данной SERS-структуры (560 нм)

ствует адсорбционной модели, представленной

на рис. 1в. Сначала под действием градиента кон-

вблизи длины волны выбранного нами лазерного

излучения (532 нм). Нанесенное на подложку ве-

центрации на подложку адсорбируется макси-

щество ТРИТЦ показало высокоинтенсивный

мальное количество белка. Однако большая часть

усиленный сигнал рамановского рассеяния света

белковых молекул адсорбирована обратимо. Да-

(рис. 2г).

лее следуют конформационные изменения бел-

ковых молекул на поверхности подложки или их

Таким образом, полученные SERS-подложки

переориентация относительно поверхности вви-

удовлетворяют требованиям по дисперсности ча-

ду геометрической анизотропии. В результате

стиц по форме и размеру, а также дают равномер-

действия того или иного процесса происходит де-

ное распределение кластеров по поверхности.

сорбция обратимо связанных молекул с поверх-

Спектр поверхностно-усиленного рамановского

ности подложки и на кинетической кривой ад-

рассеяния света от используемого в исследовани-

сорбции наблюдается локальный максимум. Па-

ях красителя показывает хорошую интенсив-

паин ведет себя по классической модели

ность.

адсорбции Лэнгмюра (рис. 1а), что говорит о том,

Для выбора блокирующего агента, пригодного

что большинство молекул связано с SERS-под-

для последующего создания метода иммунного

ложкой обратимо. Казеин ведет себя согласно

анализа с использованием SERS-детекции, изу-

модели, близкой к рис. 1в. Наличие локального

чали параметры адсорбции некоторых белков,

максимума на кинетической кривой адсорбции

БИОФИЗИКА том 65

№ 1

2020

CУБЕКИН и др.

казеина можно связать с конформационны-

По результатам работы можно сделать вывод о

ми/ориентационными перестройками белковых

том, что в качестве блокирующих агентов для им-

молекул, переходящих в необратимо связанное

мунного анализа с применением SERS-эффекта

состояние, и частичной десорбцией.

предпочтительнее использовать БСА или казеин,

так как высокое удельное содержание необратимо

Были поставлены опыты (рис. 3б-г) по де-

адсорбированных молекул дает основания пола-

сорбции каждого из белков (см. раздел «Материа-

гать, что при постановке метода применяемый бе-

лы и методы», п. 6). Из данных рисунков следует,

лок не будет частично или полностью вытеснен с

что десорбция присутствует в каждом опыте и с

поверхности антителами к исследуемому аналиту.

течением времени достигает своего предела, со-

ответствующего необратимо связавшемуся коли-

честву белка. На рис. 3б видно, что при адсорбции

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

БСА на SERS-подложку в течение 2 мин белок

Исследование выполнено при финансовой

смывается с подложки интенсивнее, чем при вре-

поддержке Российского научного фонда (проект

мени его адсорбции 20 мин. Остаточный сигнал

№ 19-72-30003).

соответственно составил 65 и 95% от исходного.

На рис. 3в видно, что папаин десорбируется с

подложки одинаково хорошо для обеих точек ад-

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

сорбционной кривой, остаточный сигнал по от-

ношению к исходному составил 59% в случае

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

2 мин и 62% - для 20 мин адсорбции. Из рис. 3г

интересов.

следует, что казеин, аналогично БСА, хорошо

смывается с подложки при времени его адсорб-

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

ции 2 мин и практически полностью остается

прикрепленным при времени его адсорбции

Настоящая работа не содержит описания ка-

20 мин. Остаточный сигнал составил 75 и 95 % со-

ких-либо исследований с использованием людей

ответственно.

и животных в качестве объектов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. A. Kudelski, Talanta 76 (1), 1 (2008).

В результате проделанной работы были полу-

2. R. Monjezi, S. Tan, B. Tey, et al., J. Virol. Methods 187

чены SERS-подложки, дающие значительное

(1), 121 (2013).

усиление рамановского сигнала выбранной для

аналитических целей метки (ТРИТЦ). На них

3. M. Sanles-Sobrido, L. Rodríguez-Lorenzo, and S. Lo-

renzo-Abalde, Nanoscale 1 (1), 153 (2009).

были изучены адсорбционные свойства белковых

веществ, наиболее часто употребляемых в каче-

4. S. Stockel, J. Kirchhoff, U. Neugebauer, et al., J. Ra-

стве блокирующих агентов в классическом имму-

man Spectroscopy 47 (1), 899 (2016).

ноферментном анализе. Показано, что при

5. G. W. Auner, S. K. Koya, C. Huang, et al., Cancer Me-

адсорбционном взаимодействии белка и SERS-

tastasis Rev. 37 (4), 691 (2018).

поверхности действуют закономерности, описан-

6. A. Wokaun, H.-P. Lutz, A. P. King, et al., J. Chern.

ные в классической адсорбционной теории.

Phys. 79 (1), 509 (1983).

7. A. Kaminska, E. Witkowska, K. Winkler, et al., Bios-

Из полученных данных следует, что при дости-

ens. Bioelectron. 66, 461 (2015).

жении равновесного состояния БСА и казеин яв-

8. K. Faulds, W. E Smith., and D. Graham, Anal. Chem.

ляются необратимо адсорбированными на по-

76 (2), 412 (2004).

верхности SERS-подложек. Интерпретация ки-

9. B. Dan, Zh. Huisheng, Y. Guangxin, and P. Xianyin,

нетических

кривых адсорбции хорошо

Anal. Methods 7 (1), 99 (2015).

коррелирует с данными по десорбции белков. В

10. T. Kuczius, K. Becker, A. Fischer, et al., Anal. Bio-

момент времени, когда еще не достигнута точка

chem. 431 (1), 4 (2012).

локального максимума (2 мин, рис. 3а), суще-

ственная часть белковых молекул адсорбирована

11. D. V. Rodrigo, J. Liu, C. Zhou, et al., ACS Appl. Mater.

обратимо, а после достижения равновесного со-

Interfaces 6 (15), 11829 (2014).

стояния практически все молекулы переходят в

12. Т. Д. Хохлова, Вестн. МГУ. Сер. Химия 43 (3), 144

необратимо связанное состояния. Приведенные

(2002).

выше данные по десорбции (рис. 3б,г) подтвер-

13. Н. А. Эльтекова и А. Ю. Эльтеков, Физикохимия

ждают это. При адсорбции папаина отношение

поверхности и защита материалов 46 (1), 56 (2010).

необратимо адсорбированных молекул к общему

14. В.И. Севастьянов, Биосовместимость (ИЦ

их числу примерно всегда одинаково и составляет

ВНИИгеосистем, М., 1999).

около 60% вне зависимости от того, достигнуто

15. Л. И. Казакова, А. В. Дубровский, И. М. Санталова

состояние равновесия или нет (рис. 3в).

и др., Биоорган. химия 38 (1), 64 (2012).

БИОФИЗИКА том 65

№ 1

2020