БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 2, с. 250-258

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.3

ИССЛЕДОВАНИИ ИЗМЕНЕНИЙ КОНФОРМАЦИИ ГЕМА

И ГЛОБИНА ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ТЕМПЕРАТУРЫ

И НОРМОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ

, Г.В. Максимов

С.Н. Орлов

Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова,

119892, Москва, Ленинские горы, 1/12

E-mail: gmaksimov@mail.ru, slatolya@mail.ru

Поступила в редакцию 29.11.2019 г.

После доработки 29.11.2019 г.

Принята к публикации 31.01.2020 г.

С помощью метода спектроскопии комбинационного рассеяния в диапазоне 1000-3000 см^-1 иссле-

дованы изменения конформации гема и глобина гемоглобина эритроцитов человека при различных

температурах и содержании кислорода. Показано, что при гипоксии меняется конформация гемо-

глобина за счет увеличения вклада пиррольных колец гемопорфирина и валентных колебаний

групп винилов, а также выявлены изменения вклада валентных симметричных и ассиметричных

колебаний СН₂- и СН₃-радикалов аминокислот гистидина (2850, 2860, 2900 см^-1) и лизина (2880,

2860 см^-1). Обсуждаются механизмы связывания кислорода гемоглобином, локализованным в при-

мембранной области и цитоплазме клетки.

Ключевые слова: гемоглобин, эритроцит, комбинационное рассеяние, рамановская спектроскопия,

гипоксия.

DOI: 10.31857/S0006302920020052

но, эти изменения лежат в основе механизма не

Известно, что одной из причин развития пато-

только изменения структурной целостности мем-

логии в тканях является гипоксия, которая зави-

браны, выброса аденозинтрифосфата, но и изме-

сит от ряда факторов - скорости кровотока, диа-

нения упорядоченности молекул Гб в цитоплазме

метра сосудов, взаимодействия эритроцитов с

клетки [6, 7].

клетками эндотелия, а также свойствами гемо-

глобина (Гб) [1]. В частности, скорость кровотока

Очевидно, что для понимания развития гипо-

зависит от деформируемости эритроцитов и вы-

ксии на клеточном уровне необходимо исследо-

хода аденозинтрифосфата, стимулирующего пу-

вать изменения конформации гема и глобина ге-

ринергические рецепторы и каскад реакций в эн-

моглобина при переносе O₂в эритроцит. Одним

дотелиальных клетках сосудов, сопровождаю-

из методов, позволяющих оценить одновремен-

щийся выходом вазорелаксантов [2]. Ключевым

ное изменение конформации гема и структуры

звеном регуляции внутриклеточных процессов в

глобина Гб, является метод спектроскопии ком-

самом эритроците является Гб, который в ком-

бинационного рассеяния (КР), используемый

плексе с цитоплазматическим доменом белка по-

как для исследования деформации метиновых

лосы 3 фиксирует О₂ в мембране [3, 4]. Так как ге-

групп порфиринового макроцикла гема, так и для

моглобин является единственным О₂-связываю-

оценки вклада валентных колебаний СН-групп

аминокислот гемоглобина и белков плазматиче-

щим белком в эритроцитах, то обратимая

ской мембраны эритроцита (табл. 1) [8-11].

ассоциация дезоксигенированного Гб с последу-

ющими звеньями внутриклеточной сигнализа-

В работе исследовали изменения конформа-

ции может рассматриваться как механизм запус-

ции гема и его ближайшего белкового окружения

ка O₂-зависимых процессов в эритроците [5].

в глобине при нормобарической гипоксии и воз-

действии температуры.

Важно, что при гипоксии было обнаружено изме-

нение содержания других ассоциированных с

мембраной цитоплазматических белков. Возмож-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сокращения: Гб — гемоглобин, КР — комбинационное

Объектом исследования служили раствор гемо-

рассеяние.

глобина, суспензия эритроцитов и тени эритро-

250

ИССЛЕДОВАНИИ ИЗМЕНЕНИЙ КОНФОРМАЦИИ ГЕМА

251

Таблица 1. Полосы спектра КР гемопорфирина гемоглобина при возбуждении лазером 532 нм и соответствие

полос с колебаниями связей порфирина

Частотный сдвиг, см^-1

Тип симметрии колебаний

Причина изменения

v₃₀,

Редокс-состояние железа (Fe²⁺),

1172

симметричные колебания

присутствие лиганда

пиррольных полуколец

v₄, A1g,

Редокс-состояние железа (Fe²⁺),

1375

симметричные колебания

присутствие лиганда

пиррольных полуколец

Спиновое состояние железа (Fe³⁺),

1548-1552

A2g

диаметр гемоглобина

v₁₉, А2g асимметричные колебания

Низкоспиновое состояние железа (Fe³⁺),

1580-1588

метиновых мостиков между

диаметр гемоглобина

пирролами

2850

A1g

Симметричное растяжение CH

2880

A1g

Асимметричное растяжение CH

2930 (оксигемоглобин)

Симметричное СН₃ — растяжение,

также С-Н-колебания от СН-боковой цепи

A1g

свободной аминокислотной группы.

2940

(дезоксигемоглобин)

Зависят от изменения внешнего воздействия

или температуры

Примечание. Таблица составлена на основании данных работ [11, 12-16].

цитов, выделенные из крови здоровых доноров

12000 g в течение 30 мин при температуре 4°С. Со-

(n = 10, возраст 20-40 лет). Кровь забирали нато-

держание теней оценивали по концентрации

щак из локтевой вены в вакуумные пробирки Vac-

мембранных белков методом Лоури [17], оно со-

uette (Greiner Bio-One, Австрия). В качестве анти-

ставило 4.9 ± 0.4 мг/мл.

коагулянта использовали гепарин (20-50 Ед/мл

Вытеснение кислорода из суспензии эритроци-

крови). После забора кровь хранили при темпера-

тов и раствора гемоглобина проводили газовой

туре 4°С. Осаждение форменных элементов кро-

смесью, содержащей азот и 0.04% СО₂ (ООО

ви проводили центрифугированием при 1500 g в

течение 10 мин при температуре 4°С на лабора-

«ПГС-сервис», Россия). Вытеснение проводили

торной центрифуге Laborfuge 400R (Thermo Sci-

путем продувки газовой смесью через газовую

entific, США). Плазму и лейкоциты удаляли, оса-

фазу над пробой в течение 20 мин (скорость пото-

док трехкратно отмывали буфером А следующего

ка газовой смеси 0.1 л/мин [18] при постоянном

состава (145мМ NaCl, 5мМ KCl, 1мМ раствора

перемешивании и комнатной температуре. Ис-

CaCl₂, 4мM Na2HPO4, 1 мM NaH2PO4, 1мМ

пользуемые в работе параметры вытеснения кис-

MgSO₄, 5 мМ глюкозы, рН 7.0). Выделенную сус-

лорода позволяют получить пробы суспензии

эритроцитов и раствора гемоглобина в состоянии

пензию эритроцитов (Ht = 40%) хранили при тем-

нормобарической гипоксии, поскольку после

пературе 4°С и использовали в течение трех часов.

вытеснения в пробах присутствовал главным об-

Для выделения гемоглобина к суспензии эритро-

разом дезоксигемоглобин (определяли путем ре-

цитов добавляли фосфатный буфер

(4 мM

гистрации и анализа спектров КР, методику см.

Na₂HPO₄, 1 мM NaH₂PO₄, рН 7.4) в десятикрат-

ниже). Контрольные пробы суспензии эритроци-

ном объеме, после чего суспензию тщательно пе-

тов и раствора гемоглобина (нормоксия) были

ремешивали и центрифугировали при 6000 g в те-

приготовлены в таких же условиях, но вместо га-

чение 10 мин при температуре 4°С. Супернатант

зовой смеси без кислорода использовали воздух.

отделяли и хранили при 4°С. Концентрацию ге-

Образцы помещали в стеклянные гематокритные

моглобина в растворе определяли по оптической

капилляры с диаметром поперечного сечения

плотности, измеренной на спектрофотометре Hi-

1 мм (ООО «Агат-Мед», Россия). Все манипуля-

tachi 557 (Hitachi, Япония) при длине волны

ции при заполнении капилляров осуществляли в

415 нм.

герметичном боксе при постоянной подаче газо-

вой смеси (азот с 0.04% СО₂). Для нормализации

Тени эритроцитов получали трехкратной от-

мывкой осадка после гемолиза эритроцитов при

избыточного давления гипоксической смеси в

БИОФИЗИКА том 65

№ 2

2020

252

СЛАТИНСКАЯ и др.

боксе применяли воздушный клапан с порогом

(характеризует изменение полярности окруже-

срабатывания около 1 атм. Продувку предвари-

ния аминокислот).

тельно помещенных в бокс гематокритных ка-

Для регистрации ζ-потенциала суспензии эрит-

пилляров проводили в течение 2 мин. Контроль

роцитов, который характеризует изменение по-

парциального давления кислорода в газовой сме-

верхностного заряда клетки [20], использовали

си внутри бокса осуществляли при помощи элек-

Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Вели-

трода КЕ-25 (Figaro Engineering Inc., Япония).

кобритания). Для этого 1 мл суспензии эритроци-

После заполнения капилляры герметично запаи-

тов (Нt = 40%) помещали в пластиковую кювету с

вались и хранились при температуре 4°С не

золотыми электродами для регистрации ζ-потен-

более 3 ч.

циала и тщательно перемешивали во избежание

Исследование конформации гема и глобина ге-

образования пузырей воздуха или скопления

моглобина проводили методом спектроскопии

эритроцитов в одной из частей кюветы. Измере-

комбинационного рассеяния. Спектры КР реги-

ния проводили в термостатируемой ячейке при

стрировали с помощью конфокального микро-

температуре 25 и 36°С, время адаптации образца к

скоп-спектрометра NTEGRA-SPECTRA (NT-

температуре - 60 с, количество снятых измере-

MDT, Зеленоград, Россия) в диапазоне 1000-

ний - 100. Для обработки результатов использо-

3000 см^-1, с шагом измерения 0.8 см^-1, регистра-

вали программное обеспечение Malvern, постав-

ляемое в комплекте с прибором, и программу MS

тор

- ССD-детектор с пельтье-охлаждением

Excel.

‒50°С (объектив 5× с апертурой 0.15, решетка

600 штр./мм), мощность лазера на образце 3 мВт,

длина волны возбуждения 532 нм, время реги-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

страции одного спектра - 15 с, количество накоп-

лений сигнала - 3. Изменение температуры про-

В ходе исследования установлено, что спектры

водили в диапазоне 22-36°С в ячейке прибора,

КР гемоглобина в растворе и в суспензии эритро-

время адаптации образца к температуре - 5 мин.

цитов имеют характерные полосы в области

Спектры КР обрабатывали в программе Ori-

1000-3000 см^-1 (рис. 1). В отсутствие гемоглоби-

gin2017 (OriginLab Corp., США). Обработка сиг-

на в спектре КР теней эритроцитов были выявле-

нала включала в себя вычитание базовой линии и

ны только полосы в области 2800-3100 см^-1, обу-

сглаживание спектров. Лазер с длиной волны воз-

словленные валентными колебаниями связей

буждающего света 532 нм был выбран для мини-

СН-групп аминокислот (рис. 1 и 2а, табл. 1) [16,

мизации вклада в спектр КР сигналов от липидов

21]. Вероятно, полосы КР-спектра в области

и белков мембраны эритроцитов [11, 16, 17].

2800-3100 см^-1 обусловлены валентными сим-

Для оценки вклада различных групп молекулы

метричными и ассиметричными колебаниями

гемоглобина использовали величины соотноше-

СН₂- и СН₃-радикалов аминокислот гистидина

ний интенсивностей полос спектра КР (табл. 1)

[8, 11, 18, 19]:

(2850, 2860, 2900 см^-1) и лизина (2880, 2860 см^-1)

[16, 22-25].

•I₁₃₇₅/I₁₁₂₇ - вклад боковых -СН₃-групп коле-

баний полуколец пиррола в гемопорфирине, вы-

На наш взгляд, перенос молекулы кислорода

раженных при изменении конформации глобина

из внешней среды в эритроцит осуществляется в

в непосредственной близости от гема, характери-

несколько этапов: сначала кислород проникает в

зует выраженность симметричных и ассиметрич-

липидный бислой плазматической мембраны, за-

ных колебаний пиррольных полуколец (измене-

тем координируется в гемопорфириновом цикле

ние величины соотношения характеризует изме-

дезоксигемоглобина, фиксированным в белке

нение конформации гемоглобина из T

полосы 3, и, наконец, оксигемоглобин десорби-

(дезоксигемоглобин) в R (оксигемоглобин);

рует с молекулой кислорода в клетку, где осу-

ществляются белок-белковые взаимодействия,

•I₁₅₈₀/I₁₅₅₀ - вклад колебаний метиновых мо-

меняющие способность гема фиксировать моле-

стиков между пирролами в гемопорфирине, вы-

кулу кислорода. Таким образом, в ходе этого про-

раженных при деформации макроцикла (характе-

цесса должна сначала меняться конформация ге-

ризует сродство Гб к лигандам, в частности к кис-

ма, а затем конформация глобина.

лороду);

Для проверки данного предположения кон-

•I₂₈₅₀/I₂₈₈₀ - вклад симметричных колебаний

тролировали изменения конформации гема при

к несимметричным колебаниям метиленовых

вытеснении кислорода из среды инкубации с вы-

групп аминокислот;

деленным гемоглобином и суспензией эритроци-

тов, регистрируя КР-спектр в области 1000-

•I₂₉₃₀/I₂₈₅₀ - вклад колебаний симметричных

1800 см^-1. Были выявлены характерные различия

концевых метиленовых групп к симметричным

колебаниям метиленовых групп аминокислот

в изменениях амплитуды полос 1355 и 1375 см^-1 в

БИОФИЗИКА том 65

№ 2

2020

ИССЛЕДОВАНИИ ИЗМЕНЕНИЙ КОНФОРМАЦИИ ГЕМА

253

(а)

1552 1585

Суспензия эритроцитов

5.0

Раствор гемоглобина

Разностный спектр

4.0

1375

1355

3.0

1127

2.0

2880 2930

2850

2960

1.0

0.0

1000

1200

1400

1600

2800

2900

3000

Частотный сдвиг, см^-1

(б)

1552 1585

Суспензия эритроцитов

Раствор гемоглобина

5.0

Разностный спектр

2880

4.0

13551375

2850

2930

3.0

1127

2960

2.0

1.0

0.0

1000

1200

1400

1600

2800

2900

3000

Частотный сдвиг, см^-1

Рис. 1. Спектры КР гема и глобина в состоянии нормоксии (а) и гипоксии (б) суспензии эритроцитов и раствора Гб,

область 1000-3000 см^-1. Спектры нормированы на полосу 1220 см^-1 (в соответствии с работой [9]).

области 1300-1400 см^-1, 1552 и 1580 см^-1 - в об-

В области 2800-3000 см^-1 КР-спектра (об-

ласть валентных колебаний СН-связей амино-

ласти 1500-1650 см^-1 (рис. 3) [13, 22]. Так, при ги-

кислот глобина) были выявлены изменения вкла-

поксии изменения в области 1500-1650 см^-1 для

да полос 2850 и 2880 см^-1, более выраженные для

выделенного Гб были более выражены, чем у Гб в

выделенного гемоглобина (на 13.20 ± 0.23%), чем

эритроцитах (на 14.20 ± 0.52%). В то же время в

для гемоглобина в клетке [12, 21] (рис. 2 и 3;

области 1300-1400 см^-1 у выделенного Гб интен-

табл. 1). Известно, что при гипоксии изменения в

сивность спектра КР на 16.03 ± 0.45% выше, чем у

области КР-спектра от 200 до 500 см^-1 обусловле-

Гб в эритроцитах. Важно, что в области 1300-

ны связью Fe-His, что также подтверждается на-

1450 см^-1 при гипоксии у Гб в клетке наблюдает-

шими данными по изменениям вклада гистидина

ся сдвиг ряда полос КР-спектра, что характерно

в области 2800-3000 см^-1 [25, 27]. Отметим, что

для изменения длины сопряжения двойных свя-

зей пиррольных колец гемопорфирина гема.

при нормоксии и гипоксии полосы 2850 см^-1 и

БИОФИЗИКА том 65

№ 2

2020

254

СЛАТИНСКАЯ и др.

(а)

Суспензия эритроцитов (гипоксия)

Суспензия эритроцитов (нормоксия)

Раствор гемоглобина (гипоксия)

2880

Раствор гемоглобина (нормоксия)

1400

2900

2930

Тени эритроцитов

2855

1200

(б)

2845

22°С

-30

36°С

1000

2968

800

2942

-20

600

400

-15

200

-10

Нормоксия Гипоксия

2800

2840

2880

2920

2960

3000

Частотный сдвиг, см^-1

Рис. 2. (а) - Область спектра КР валентных колебаний в суспензии эритроцитов, растворе Гб и тенях эритроцитов в

состоянии нормоксии и гипоксии в области 1000-3000 см^-1, спектры не нормированы; (б) - ζ-потенциал мембраны

эритроцита в условиях нормоксии и гипоксии (* - р ≤ 0.05).

колец гема (снижение на 32.86 ± 0.45 %), которые

2930 см^-1 выделенного Гб смещены в более высо-

не обнаружены в суспензии эритроцитов.

кочастотную область по сравнению с Гб в клет-

ках, что может быть обусловлено изменением

При гипоксии (снижении доли комплексов

конформации глобина за счет увеличения упоря-

оксигемоглобина в пробе) гем меняет свою кон-

доченности расположения молекул в клетке по

формацию за счет вклада пиррольных колец (уве-

сравнению с раствором [21].

личение I₁₃₇₅/I₁₁₇₂, на 21.07 ± 0.18%) и валентных

колебаний групп винилов (увеличение I₁₅₈₀/I₁₅₅₀

В данной работе изменения конформации гло-

на 20.26 ± 0.17%) в суспензии эритроцитов и вы-

бина инициировали за счет увеличения темпера-

деленного Гб (на17.60 ± 0.68% и 15.08 ± 0.53% со-

туры раствора с гемоглобином или суспензией

ответственно). Отметим, что изменения в гемо-

эритроцитов. Известно, что в температурном

вой части Гб более выражены для суспензии

диапазоне 22-36°С отсутствуют фазовые перехо-

эритроцитов, чем для выделенного гемоглобина,

ды липидов в плазматической мембране эритро-

что, вероятно, свидетельствует об эффекте боль-

цита [15, 19]. В связи с этим возможно, что изме-

шей упорядоченности молекул гемоглобина в

нения спектра КР суспензии эритроцитов в

клетке, чем в растворе. Также в глобине гемогло-

области 2800-3000 см^-1 будут связаны исключи-

бина клетки при гипоксии возрастает вклад по-

тельно с изменением белков, в первую очередь ге-

лярного окружения аминокислот (увеличение со-

моглобина [18, 27] (табл. 2, рис. 4). При увеличе-

отношения I₂₉₃₀/I₂₈₅₀), но не меняется плотность

нии температуры на фоне нормоксии (рис. 5) вы-

упаковки белка (I₂₈₅₀/I₂₈₈₀) [11]. В аналогичных

явлены существенные различия в изменении

условиях у глобина выделенного Гб меняется как

конформации гема и глобина в зависимости от

плотность упаковки, так и полярность окружения

упаковки молекул Гб (суспензия эритроцитов

глобина.

или раствор гемоглобина): вклад пиррольных ко-

лец и винильных групп снижается в эритроците, а

в глобине существенно увеличивается плотность

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

упаковки белка и снижается полярность окруже-

ния. Так, нами показано, что увеличение темпе-

В данной работе исследовали молекулярный

ратуры существенно меняет величину соотноше-

механизм изменения конформации гема и глоби-

ния I₁₃₇₅/I₁₁₇₂ КР-спектра Гб в растворе, что соот-

на в эритроците, который чувствителен к измене-

ветствует изменению конформации пиррольных ниям парциального давления O2^{и определяет}

БИОФИЗИКА том 65

№ 2

2020

ИССЛЕДОВАНИИ ИЗМЕНЕНИЙ КОНФОРМАЦИИ ГЕМА

255

(а)

1552 1585

Гипоксия

Нормоксия

5.0

Разностный спектр

2880

4.0

13551375

2850

2930

3.0

1127

2960

2.0

1.0

0.0

1000

1200

1400

1600

2800

2900

3000

Частотный сдвиг, см^-1

(б)

Гипоксия

1552 1585

Нормоксия

5.0

Разностный спектр

2880

4.0

13551375

2850

2930

3.0

1127

2960

2.0

1.0

0.0

1000

1200

1400

1600

2800

2900

3000

Частотный сдвиг, см^-1

Рис. 3. Спектры КР суспензии эритроцитов (а) и раствора гемоглобина (б) в условиях нормоксии и гипоксии и их

разностный спектр. Спектры нормированы на максимум полосы 1220 см^-1 (в соответствии с работой [9]).

формирование комплекса Гб с белком полосы 3, а

[27]. Важно, что при гипоксии (снижение числа

также олигомеризацию гемоглобина в цитоплаз-

комплексов гема с О₂) меняется конформация ге-

ме. Известно, что Гб связывается с мембранами

мопорфирина за счет увеличения вклада пир-

эритроцитов с большим сродством, чем оксиге-

рольных колец гемопорфирина и валентных ко-

моглобин, при этом N-конец белка полосы 3 ло-

лебаний групп винилов [9, 28]. Нами выявлены

кализуется в центральной полости тетрамера Гб,

изменения вклада расположенных близко к гему

которая недоступна при оксигенации Гб. Извест-

аминокислот гистидина и лизина в глобине: сме-

но, что NH₂-терминальный участок белка

щение полосы 2930 см^-1 до 2940 см^-1, вероятно,

полосы 3 имеет анионный сегмент и может вхо-

за счет изменения конформации глобина и уве-

дить в катионную центральную полость дезокси-

личения вклада лизина [21]. Таким образом, со-

гемоглобина, которая значительно сужается при

стояние гипоксии характеризуется изменением

связывании O₂ (это снижает сродство O₂ к Гб)

конформации и способности гемопорфирина Гб

БИОФИЗИКА том 65

№ 2

2020

256

СЛАТИНСКАЯ и др.

Таблица 2. Изменение конформации гема и глобина при различном парциальном давлении О₂

Температура

22°С

22-36°С

Соотношение

Суспензия

Выделенный Гб

эритроцитов

При гипоксии вклад

Колебания пирролов в

пирролов возрастает,

пирролов снижается,

I₁₃₇₅/I₁₁₂₇

отсутствие О₂ менее

при нормоксии не

при гипоксии

выражена

меняется

неизменно

При гипоксии вклад

валентных колебаний

Колебания винильных

винильных групп

винильных групп не

I₁₅₈₀/I₁₅₅₀

групп в отсутствие О₂

возрастает, при

меняется, при

менее выражена

нормоксии не

нормоксии

меняется

увеличивается

Вклад валентных

колебаний СН-

радикалов

Вклад валентных

радикалов аминокислот

аминокислот при

аминокислот

колебаний СН-

I₂₈₅₀/I₂₈₈₀

более выражен,

дезоксигемоглобине

более выражен,

радикалов аминокислот

снижается плотность

не меняется, при

снижается плотность

не меняется

упаковки белка при

оксигемоглобине

упаковки белка при

отсутствии О₂

снижается плотность

отсутствии О₂

упаковки белка

Полярность

окружения при

Снижается в

Снижается в состоянии

нормоксии

Полярность окружения

I₂₉₃₀/I₂₈₅₀

состоянии гипоксии

гипоксии

снижается, при

не меняется

гипоксии

увеличивается

связывать О₂. При увеличении температуры

Все это происходит в плазматической мембра-

должны наблюдаться изменения конформации

не эритроцита, и изменение конформации гема и

глобина при связывании кислорода может отра-

белков клетки, в первую очередь глобина. В клет-

жаться на величине поверхностного заряда мем-

ке (но не в выделенном Гб) при изменении темпе-

браны [20]. Действительно, ζ-потенциал в усло-

ратуры на фоне гипоксии увеличивается вклад

виях нормоксии составляет -20.8 ± 0.5 мВ и

колебания винильных групп и пиррольных колец

16.7 ± 1.3 мВ в условиях гипоксии (рис. 2б). Та-

гема. Отметим, что зависимые от температуры из-

ким образом, в условиях гипоксии происходит

менения конформации глобина при гипоксии,

увеличение поверхностного потенциала мембра-

вероятно, возможны за счет полярного окруже-

ны, что может быть обусловлено взаимодействи-

ния аминокислот (I₂₉₃₀/I₂₈₅₀) [11]. Мы связываем

ем дезоксигемоглобина с мембраной через белок

это с изменениями структуры белков мембраны и

полосы 3 и возможными структурными измене-

цитоплазмы, так как при этих температурах фазо-

ниями мембраны.

вые переходы в липидах мембраны клетки не вы-

явлены [17]. Вероятно, при связывании кислоро-

Другим элементом внутриклеточной сигналь-

да изменения конформации гема и расположения

ной системы эритроцитов является обусловлен-

близлежащих к гему аминокислот Гб (например,

ное гипоксией изменение сродства к мембране не

гистидина и лизина) меняют локализацию ани-

только Гб, но и целого ряда цитоплазматических

онного сегмента белка полосы 3 вследствие изме-

белков [7, 18]. В зависимости от упорядоченности

нения расположения аминокислот или увеличе-

молекул Гб в цитоплазме по сравнению с выде-

ния плотности отрицательного заряда в цен-

ленным в раствор гемоглобином меняется как

тральной полости Гб.

конформация гема (за счет валентных колебаний

БИОФИЗИКА том 65

№ 2

2020

258

СЛАТИНСКАЯ и др.

пиррольных колец, связей винильных групп), так

10.

G. V. Maksimov, N. V. Maksimova, A. A. Churin,

и глобина (за счет плотности его упаковки).

et al., Biochemistry (Moscow) 66 (3), 295 (2001)

11.

S. C. Goheen, L. J. Lis, O. Kucuk, et al., J. Raman

Spectroscopy 24 (9), 275 (1993)

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

12.

N. Parthasarathi, C. Hansen, S. Yamaguchi, et al., J.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

Am. Chem. Soc. 109 (13), 3865 (1987)

интересов.

13.

B. R. Wood, P. Caspers, G. J. Puppels, et al., Anal.

Bioanal. Chem. 387 (5), 1691 (2007)

14.

S. Nagatomo, M. Nagai, Y. Mizutani, et al., Biophys. J.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

89 (2), 1203 (2005)

Все процедуры, выполненные в исследовании

15.

S. Choi, T. G. Spiro, K. C. Langry, et al., J. Am. Chem.

с участием людей, соответствовали этическим

Soc. 104 (16), 4345 (1982)

стандартам Хельсинкской декларации 1964 г. и ее

16.

N. K. Howell, G. Arteaga, S. Nakai, et al., J. Agricult.

последующим изменениям. От участников иссле-

Food Chem. 47 (3), 924 (1999)

дования было получено информированное доб-

17.

H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr, et al., J. Biol.

ровольное согласие.

Chem. 193, 265 (1951)

18.

S. V. Sidorenko, R. H. Ziganshin, O. G. Luneva, et al.,

J. Proteomics 184, 25 (2018)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

19.

I. P. Torres Filho, J. Terner, R. N. Pittman, et al., J.

1. D. Holly and B. Glenn, Am. J. Physiol. Heart Circ.

Appl. Physiol. 104 (6), 1809 (2008)

Physiol. 293, 2193 (2007)

20.

I. A. Tikhomirova, A. V. Murav’ev, L. A. Mikhailichen-

2. M. R. Hardeman, P. T. Goedhart, and S. K. Shin, in

ko, et al., Human Physiol. 32(6), 748 (2006)

Handbook of Hemorheology and Hemodynamics (IOS

21.

K. M. Marzec, D. Perez-Guaita, M. De Veij, et al.,

Press Ebooks, 2007), pp. 242-266.

ChemPhysChem 15 (18), 3963 (2014)

3. J. A. Walder, R. Chatterjee, T. L. Steck, et al., J. Biol.

Chem. 259 (16), 10238 (1984).

22.

B. R. Wood, L. Hammer, and D. McNaughton, Vibra-

tional Spectroscopy 38 (1-2), 78 (2005)

4. R. A. Reithmeier, J. R. Casey, A. C. Kalli, et al. Bio-

chim. Biophys. Acta - Biomembranes 1858 (7), 1507

23.

J. Surmacki, R. Musial, R. Kordek, et al., Mol. Cancer

(2016

12 (1), 48 (2013)

5. R. R. Tuck, J. D. Schmelzer, and P. A. Low, Brain 107

24.

M. Nagai, N. Mizusawa, T. Kitagawa, et al., Biophys.

(3), 935 (1984)

Rev. 10 (2), 271 (2018)

6. O.G. Luneva, S. V. Sidorenko, O. O. Ponomarchuk,

25.

J. M. Friedman, T. W. Scott, R. A. Stepnoski, et al.,

et al., Cell. Physiol. Biochem. 39 (1), 81 (2016)

J. Biol. Chem. 258 (17), 10564 (1983)

7. S. V. Sidorenko, O. G. Luneva, T. S. Novozhilova,

26.

S. Nagatomo, M. Nagai, and T. Kitagawa, J. Am.

et al., Biochemistry, Suppl. Ser. A 12 (2), 114 (2018)

Chem. Soc. 133 (26), 10101 (2011)

8. N. A. Brazhe, S. Abdali, A. R. Brazhe, et al., Biophys.

27.

С. Н. Орлов, Бюл. сибирской медицины 18 (2), 234

J. 97 (12), 3206 (2009)

(2019)

9. B. R. Wood and D. McNaughton, Biopolymers 67 (4-

28. A. A. Semenova, A. P. Semenov, E. A. Gudilina, et al.,

5), 1691 (2002)

Mendeleev Communications 26 (3), 177 (2016)

Study of Conformational Changes in Heme and Globin in Temperature Variation

and Normobarical Hypoxia

O.V. Slatinskaya, O.G. Luneva, L.I. Deev,

, and G.V. Maksimov

S.N. Orlov

Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskie Gory 1/12, Moscow, 119892 Russia

Combined dynamic light scattering and Raman spectroscopy approach in the 1000-3000 cm^-1 spectral range

was applied in the study of conformational and structure changes in the heme group and globin of the hemo-

globin protein in human red blood cells at various temperatures and oxygen content. It is shown that in hy-

poxia, the conformation of hemoglobin changes as the contribution of the pyrrole rings of hematoporphyrin

and vibrational motions of the molecules in the vinyl groups increase. Also, we revealed modification in the

contribution of symmetric and asymmetric vibrations of the CH₂/CH₃ radicals of histidine (2850, 2860,

2900 cm^-1) and lysine (2880, 2860 cm^-1) amino acids. Mechanisms of binding of oxygen by hemoglobin, lo-

calized in the submembrane region and cytoplasm of cells are discussed.

Keywords: hemoglobin, red blood cells, combined dynamic light scattering, Raman spectroscopy, hypoxia

БИОФИЗИКА том 65

№ 2

2020