БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 2, с. 259-262

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.3

АНАЛИЗ РЕЦЕПТОРНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ШТАММОВ

ВИРУСА ГРИППА А МЕТОДОМ ПОВЕРХНОСТНОГО

ПЛАЗМОННОГО РЕЗОНАНСА

А.С. Гудымо, А.Б. Рыжиков

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора,

р. п. Кольцово Новосибирской обл.

E-mail: onhonova_gs@vector.nsc.ru

Поступила в редакцию 29.11.2019 г.

После доработки 29.11.2019 г.

Принята к публикации 28.01.2020 г.

Изучена рецепторная специфичность для штаммов вируса гриппа птиц A/rook/Chany/32/2015

(H5N1), A/common gull/Saratov/1676/2018 (H5N6) и A/chicken/PrimorskyKrai/03/2018 (H9N2). С по-

мощью метода поверхностного плазмонного резонанса для выбранных штаммов получены значе-

ния равновесных констант диссоциации с аналогами рецепторов типа α2-3 и α2-6. Обнаружено, что

для штаммов A/rook/Chany/32/2015 (H5N1) и A/common gull/Saratov/1676/2018 (H5N6) определяет-

ся связь с человеческим типом рецепторов (α2-6) в отличие от штамма A/chicken/PrimorskyK-

rai/03/2018 (H9N2), который специфичен только к птичьему типу рецепторов (α2-3).

Ключевые слова: вирус гриппа, рецепторная специфичность, равновесная константа диссоциации,

поверхностный плазмонный резонанс.

DOI: 10.31857/S0006302920020064

Мониторинг вируса гриппа является частью

вую специфичность хозяина по отношению к ви-

глобальной системы надзора и имеет важную на-

русной инфекции.

учно-практическую значимость с точки зрения

Для оценки специфичности связывания ви-

предупреждения и контроля ежегодных эпиде-

русного белка гемагглютинина с рецепторами су-

мий, а также повышения готовности к пандеми-

ществуют различные стационарные и кинетиче-

ям. Вирусологические и серологические методы

ские методы: иммуноферментный анализ, глика-

исследования позволяют подтверждать клиниче-

новый скрининг, интерферометрия биослоя,

ские диагнозы, дифференцировать грипп от ост-

микроскопический термофорез и др. Метод по-

рых респираторных вирусных инфекций другой

верхностного плазмонного резонанса также при-

этиологии, изучать эволюцию штаммов, а также

меняется для исследования рецепторной специ-

отслеживать уровень коллективного иммунитета.

фичности, но в исследованиях в основном ис-

Оценка рецепторной специфичности на сего-

пользуют гемагглютинин вируса гриппа,

дняшний день не входит в перечень обязательных

полученный генно-инженерным способом. Це-

исследований, хотя ее практическая значимость

лью данной работы было получение и изучение

очень высока. Одним из определяющих этапов в

специфичности цельновирионных образцов, что

процессе жизненного цикла вируса гриппа явля-

является достаточно сложной задачей для иссле-

ется рецепторное связывание оболочечного ви-

дователя.

русного белка гемагглютинина с сиаловыми кис-

лотами на поверхности клеток-мишеней [1]. Это

ТЕОРИЯ

взаимодействие определяет весь дальнейший ход

событий: проникновение в клетку, репликацию,

Основными белками на поверхности вирио-

почкование и последующую передачу вируса.

нов гриппа являются гемагглютинин и нейрами-

Возможность вирусного белка гемагглютинина

нидаза. Гемагглютинин отвечает за связь с сиало-

связываться с рецепторами клеток организма яв-

вой кислотой, а также участвует в процессе

ляется одним из факторов, определяющим видо-

слияния вирусной и клеточной мембран. Нейра-

259

260

ОНХОНОВА и др.

минидаза имеет противоположную активность,

центрацию белка в конечном продукте измеряли

отщепляя сиаловую кислоту с поверхности мем-

методом Бредфорда. В качестве аналогов рецеп-

браны, тем самым не дает заражать уже инфици-

торов α2-3 и α2-6 использовали сиалозиды 3'-Si-

рованную клетку.

alyl-N-acetyllactosamine

(3’SLN) и

6'-Sialyl-N-

acetyllactosamin (6’SLN) производства Lectinity

Строение человеческих рецепторов отличает-

(Москва), меченные биотином. Для работы ис-

ся от птичьих и для оптимального взаимодей-

пользовали чип NLC, покрытый нейтравидином,

ствия с клеткой-мишенью необходимо наличие

характеризующимся высокой специфичностью и

соответствующих белков на поверхности вирио-

эффективностью взаимодействия с биотином,

на. Гемагглютинин птичьих штаммов распознает

которым мечены аналоги рецепторов. Сорбция

сиаловые кислоты, связанные с предпоследней

аналога рецепторов на поверхность чипа прово-

галактозой через связь α2-3, а человеческие

дилась при следующих условиях: раствор сиало-

штаммы преимущественно связываются с α2-6

зида в фосфатно-солевом буфере с концентраци-

сиалозидами [2, 3]. Изменения в рецепторсвязы-

ей 10-200 мкг/мл подавался со скоростью потока

вающих свойствах белков достигаются мутация-

25-30 мкл/мин и временем контакта от двух до

ми в рецепторном сайте связывания. В некоторых

шести минут. После достижения необходимого

случаях подобные мутации приводят к тому, что

уровня сорбции подавался исследуемый образец:

штамм становится способен пересекать видовой

вирус в фосфатно-солевом буфере с концентра-

барьер и адаптироваться к другим видам, включая

циями от 2 до 30 мкг/мл со скоростью потока 80-

людей. Такие случаи особо важны для монито-

100 мкл/мин и временем контакта от пяти до ше-

ринга по причине высокой вероятности возник-

сти минут до выхода на насыщение. Далее начи-

новения вспышек заболевания.

нали диссоциацию путем подачи рабочего

Принцип поверхностного плазмонного резо-

буфера в течение 10-15 мин. Обработку данных

нанса основан на явлении полного внутреннего

проводили с помощью программного обеспече-

отражения, возникающего на границе раздела

ния ProteOn Manager 3.1.0.

стеклянной призмы и нанесенной на нее золотой

Также было проведено дополнительное иссле-

пленки. На поверхности пленки генерируется за-

дование выбранных штаммов на основе иммуно-

тухающая волна, которая возбуждает свободные

ферментного анализа с использованием кинети-

колеблющиеся электроны. При определенном уг-

ческого метода по принципу, описанному раннее

ле падения возникает резонанс, что приводит к

[4]. В качестве аналогов рецепторов использовали

снижению интенсивности отраженного света.

сиалозиды 3'-Sialyl-N-acetyllactosamine (3’SLN) и

Резонансный угол является функцией показателя

6'-Sialyl-N-acetyllactosamin (6’SLN) производства

преломления на границе раздела металлической

Dextra (Великобритания), меченные биотином.

пленки и раствора. Таким образом, сдвиг угла ре-

зонанса отражает события на границе раздела, та-

кие как адсорбция белка на поверхности и взаи-

РЕЗУЛЬТАТЫ

модействие антиген-антитело. Так как взаимо-

В ходе работы на развивающихся куриных эм-

действие вириона с клеткой-мишенью хорошо

брионах были наработаны три образца птичьих

описывается кинетикой лиганд-рецепторного

штаммов вируса гриппа типа А: A/rook/Cha-

взаимодействия [4], метод поверхностного плаз-

ny/32/2015 (H5N1), A/common gull/Sara-

монного резонанса может быть использован для

tov/1676/2018 (H5N6) и A/chicken/PrimorskyK-

исследования специфичности связывания штам-

rai/03/2018 (H9N2). Для выбранных штаммов бы-

мов вируса гриппа.

ли

получены

равновесные

константы

диссоциации с двумя типами рецепторов - α2-3 и

α2-6. Данные представлены в таблице. Для штам-

ЭКСПЕРИМЕНТ

мов H5N1 и H5N6 значения, измеренные двумя

Оценку рецепторной специфичности прово-

методами, совпали по порядку. Для штамма

H9N2 в случае с рецепторами α2-3 значения так-

дили с помощью системы ProteOn XPR36 (Bio-

же совпали, в то время как значения для связи с

Rad, США). Выбранные штаммы вируса гриппа

рецепторами α2-6 сильно разнятся. Значения,

были наработаны на развивающихся куриных эм-

полученные методом поверхностного плазмон-

брионах [5]. Далее аллантоисную жидкость, со-

ного резонанса, указывают на очень слабое взаи-

держащую вирионы, инактивировали и очищали

модействие со штаммом H9N2 либо же на полное

с помощью комбинации методов фильтрования и

отсутствие такового. Результат иммунофермент-

хроматографии [6]. Чистота полученных образ-

ного анализа, напротив, показал наличие связи.

цов была проверена в ходе электрофореза в по-

Подобная ситуация может быть объяснена воз-

лиакриламидном геле по Лэммли. Общую кон-

можным неспецифическим взаимодействием,

БИОФИЗИКА том 65

№ 2

2020

АНАЛИЗ РЕЦЕПТОРНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ШТАММОВ

261

Равновесные константы диссоциации для выбранных штаммов вируса гриппа A с аналогами рецепторов α2-3 и

α2-6, полученные методами поверхностного плазмонного резонанса и иммуноферментного анализа

Поверхностный плазмонный

Иммуноферментный анализ

резонанс

Штамм

3’SLN

6’SLN

3’SLN

6’SLN

(Lectinity)

(Dextra)

A/rook/Chany/32/2015 (H5N1)

0.20 ± 0.02

6.3 ± 0.2

0.30 ± 0.02

1.7 ± 0.7

A/common gull/Saratov/1676/2018 (H5N6)

0.01 ± 0.001

0.040 ± 0.003

0.04 ± 0.02

0.050 ± 0.005

A/chicken/PrimorskyKrai/03/2018 (H9N2)

0.30 ± 0.02

>300

1.6 ± 1.1

17.5 ± 9.6

Примечание. Значения констант диссоциации выражены в мкМ.

свойственным иммуноферментному анализу,

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

или же результатом применения реагентов раз-

Работа выполнена в рамках Государственного

ных производителей.

задания № 13/19 «Разработка генетических и фе-

нотипических маркеров для количественной

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

оценки пандемического потенциала зоонозных

вирусов гриппа».

В ходе работы были исследованы следующие

штаммы вируса гриппа птиц: A/rook/Cha-

ny/32/2015 (H5N1), A/common gull/Sara-

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

tov/1676/2018 (H5N6) и A/chicken/PrimorskyK-

rai/03/2018 (H9N2). С помощью метода поверх-

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

ностного плазмонного резонанса получены

интересов.

равновесные константы диссоциации с клеточ-

ными рецепторами так называемого «птичьего»

типа (3'-Sialyl-N-acetyllactosamine) и «человече-

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

ского» типа (6'-Sialyl-N-acetyllactosamine). Для

сравнения было проведено дополнительное ис-

Настоящая работа не содержит описания ка-

следование на основе иммуноферментного ана-

ких-либо исследований с использованием людей

лиза. Полученные результаты показали, что не-

и животных в качестве объектов.

смотря на доминирующую специфичность к ре-

цепторам

типа

α2-3,

штаммы

A/rook/Chany/32/2015 (H5N1) и A/common

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

gull/Saratov/1676/2018 (H5N6) специфичны и к

рецепторам типа α2-6, что указывает на их потен-

1. Н. Ильичева, С. В. Нетесов и В. Н. Гуреев, Вирусы

циальную угрозу для человека. Штамм A/chick-

гриппа: методическое пособие (Новосибирский гос.

en/PrimorskyKrai/03/2018 (H9N2) специфичен

ун-т, Новосибирск, 2014), ч. 1.

только к рецепторам типа α2-3 по результатам из-

2. A. S. Gambaryan, S. S. Iamnikova, D. K. L’vov, et al.,

мерения на ProteOn XPR36 и по этой причине не

Mol. Biol. 36, 542 (2002).

относится к потенциально опасным штаммам ви-

руса гриппа в отношении человека, хотя иммуно-

3. K. Shinya, M. Ebina, S. Yamada, et al., Nature 440,

ферментный анализ определил связь с «человече-

435 (2006).

ским» типом рецепторов. Для уточнения резуль-

4. Г. С. Онхонова, С. В. Мальцев и А. Б. Рыжиков,

татов необходимо дальнейшее изучение.

Биофизика 64 (4), 661 (2019).

Полученные данные могут быть использованы

5. Т. Баррет, П. Берд, Дж. Клегг и др., Вирусология:

для анализа общей картины специфичности ви-

методы (Мир, М., 1988).

руса гриппа птиц по отношению к рецепторам

клеток верхнего дыхательного тракта человека и

6. Р. Скоупс, Методы очистки белков (Мир, М.,

принятия соответствующих мер защиты.

1985).

БИОФИЗИКА том 65

№ 2

2020