БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 2, с. 376-380

БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ

УДК 577.3; 57.04; 616.8; 615.27

ПРИМЕНЕНИЕ ЭПР-СПЕКТРОСКОПИИ В ИЗУЧЕНИИ МЕТАБОЛИЗМА

ЖЕЛЕЗА ПРИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА

*Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н.Семенова РАН,

119991, Москва, ул. Косыгина, 4

E-mail: grikhireva@bk.ru

**Донской государственный технический университет, 344000, Ростов-на-Дону, пл. Гагарина, 1

E-mail: mgm52@bk.ru

Поступила в редакцию 29.11.2019 г.

После доработки 22.12.2019 г.

Принята к публикации 24.12.2019 г.

Представлен краткий обзор работ авторов по применению низкотемпературной ЭПР-спектроско-

пии в исследованиях крови пациентов с болезнью Паркинсона и тканей органов крыс, взятых в экс-

периментах, моделирующих ранние стадии паркинсонизма. Анализ полученных и литературных

данных позволяет предположить, что процесс деградации гемоглобина можно включить в перечень

фундаментальных характеристик патогенеза болезни Паркинсона.

Ключевые слова: болезнь Паркинсона, ЭПР-спектроскопия, метаболизм железа, гемоглобин.

DOI: 10.31857/S0006302920020210

В работе биохимических систем органов и тка-

дыхательной цепи митохондрий, состояние со-

держащей цитохром Р-450 гидроксилирующей

ней животных и человека участвуют парамагнит-

системы, активацию процессов биосинтеза дез-

ные металлокомплексы и свободнорадикальные

соединения, которые характеризуются специфи-

оксирибонуклеотидов и др.

ческими спектрами электронного парамагнитно-

Болезнь Паркинсона - хроническое, мульти-

го резонанса (ЭПР). Метод низкотемпературной

факторное, возраст-зависимое прогрессирующее

ЭПР-спектроскопии является одним из сравни-

нейродегенеративное заболевание, характеризу-

тельно быстрых способов зарегистрировать изме-

ющееся потерей дофаминергических нейронов в

нения в метаболическом состоянии органов и

черной субстанции мозга и дефицитом дофамина

тканей. Он имеет ряд преимуществ перед трудо-

в нигростриатной системе. На клеточном уровне

емкими биохимическими методами в исследова-

болезнь Паркинсона характеризуется интенси-

нии молекулярно-клеточных механизмов функ-

фикацией окислительного стресса, снижением

ционирования организма, поскольку позволяет

уровня глутатиона, дисфункцией митохондрий и

исследовать цельные ткани органов без наруше-

метаболизма железа и увеличением его содержа-

ния их структуры, а быстрое и глубокое замора-

живание (до 77 К) обеспечивает фиксацию состо-

ния в черной субстанции мозга [1-6].

яния исследуемых объектов. Кроме того, на од-

Метаболитами железа, обладающими парамаг-

них и тех же образцах можно получить

нитными свойствами, являются метгемоглобин

информацию о сдвигах в нескольких биохимиче-

ских системах, что позволяет делать как конкрет-

(MetHb) и переносчики железа белки Cu²⁺-церуло-

ные, так и более общие заключения о реакции ор-

плазмин и Fe³⁺-трансферрин. Спектры ЭПР крови

ганизма на стрессорные воздействия различной

пациентов с болезнью Паркинсона и тканей экспе-

природы (патологии, облучение, химические со-

риментальных животных нами были измерены при

единения и т.д.) и о механизмах защиты при ис-

77 K на радиоспектрометре ER-220D фирмы Bruker

пользовании лекарственных препаратов. По

(Германия). Содержание парамагнитных белков

ЭПР-спектрам тканей можно оценить состояние

определяли как величину, пропорциональную ам-

плитуде сигналов ЭПР с g-фактором 2.05 для церу-

Сокращения: ЭПР - электронный парамагнитный резо-

лоплазмина, с g-фактором 4.3 для трансферрина и c

нанс, MetHb - метгемоглобин, МРТР - 1-methyl-4-phenyl-

1,2,3,6,-tetrahydropyridine.

g-фактором 6.0 для MetHb.

376

ПРИМЕНЕНИЕ ЭПР-СПЕКТРОСКОПИИ

377

К настоящему времени участие окислительно-

жания MetHb по сравнению с донорами той же

го стресса в развитии старения и возрастных ней-

возрастной группы.

родегенеративных заболеваний является обще-

Повышение уровня MetHb создает условия

принятым [2]. Редокс-активные ионы железа яв-

возникновения гипоксии в тканях. Установлено,

ляются одними из главных индукторов

что метгемоглобинемия в два раза сильнее по

окислительного стресса в тканях. Механизмы и

сравнению со снижением тканевого уровня кис-

источники накопления железа в черной субстан-

лорода подавляет дыхательную функцию крови

ции мозга при болезни Паркинсона до сих пор не

[10].

выяснены. Эти вопросы представляют особый

В ряде работ обсуждается роль MetHb в разви-

интерес для выяснения триггерных этапов пато-

тии нейродегенеративных заболеваний как био-

генеза заболевания, поскольку аномальное повы-

маркера и как индуктора окислительного стресса.

шение содержания железа в субстанции нигра у

Более того, есть наблюдения о связи риска нейро-

пациентов с болезнью Паркинсона наблюдается

дегенерации у потомства матерей с метгемогло-

на самых ранних стадиях заболевания [6]. Следу-

бинемией во время беременности [11].

ет отметить, что определенное повышение содер-

В литературе сообщались данные о падении

жания железа в субстанции нигра наблюдается и

содержания гемоглобина в крови пациентов с бо-

при естественном старении [7]. Пул железа в ор-

лезнью Паркинсона [12], что может быть связано

ганизме в значительной степени поддерживается

как со снижением уровня биосинтеза белка, так и

в результате вторичного использования железа

с усилением его катаболизма. Вопрос о том, сни-

после катаболических процессов при разрушении

жение синтеза гемоглобина или усиление его рас-

железосодержащих белков, главным образом, ге-

пада является причиной снижения уровня гемо-

моглобина. В физиологических условиях имеет

глобина у больных болезнью Паркинсона, диску-

место спонтанное окисление гемоглобина с обра-

тируется в литературе [6].

зованием активных форм кислорода. Образова-

В недавней работе [13] было обнаружено, что

ние метгемоглобина (MetHb) является начальной

более низкие уровни гемоглобина в крови паци-

стадией деградации гемоглобина. Восстановле-

ентов с болезнью Паркинсона связаны с тяже-

ние функционального оксигемоглобина, способ-

стью заболевания и с изменениями в метаболиз-

ного переносить газообразный кислород в ткани,

ме железа: по содержанию железа, ферритина и

в норме осуществляется с участием восстанов-

общей связывающей способностью железа.

ленного глутатиона, содержание которого сниже-

Установленный нами факт увеличения содер-

но у больных болезнью Паркинсона [6].

жания MetHb при добавлении в суспензию эрит-

Мыши с ускоренным темпом старения явля-

роцитов индукторов окислительного стресса (ак-

ются адекватной моделью для изучения патогене-

ролеин, дофамин) и предотвращения этого эф-

за возраст-зависимых нейродегенеративных за-

фекта с помощью эндогенного антиоксиданта

болеваний. В основе возрастных изменений ли-

карнозина позволил нам рассматривать MetHb

нии быстростареющих мышей SAMP1

как биомаркер окислительного стресса [14]. Сле-

(Senescence-Accelerated Mouse Prone) лежит нару-

дует отметить, что при болезни Паркинсона на-

шение антиоксидантного статуса в организме:

блюдается резкое увеличение содержания акро-

значительно уменьшена активность антиокси-

леина в субстанции нигра [15].

дантных ферментов (супероксиддисмутазы, ката-

В настоящее время фактически установлено,

лазы) и снижено содержание низкомолекуляр-

что окислительный стресс играет ведущую роль в

ных антиоксидантов (глутатиона, карнозина, тау-

индукции нейродегенеративных процессов. Счи-

рина и др.). Проведя сравнительное исследование

тается, что отношение церулоплазмин/трансфер-

влияния гипобарического стресса на двух линиях

рин отражает способность сыворотки крови улав-

мышей с обычным (SAMR1; Senescence-Acceler-

ливать и секвестировать металлы переменной ва-

ated Mouse Resistant) и ускоренным темпами ста-

лентности (железо и медь), которые активно

рения (SAMP1), мы обратили внимание на то, что

участвуют в развитии окислительного стресса

в крови быстростареющих мышей после эпизода

[16]. Исследуя содержание и отношение белков

стресса наблюдается значительное накопление

Сu²⁺-церулоплазмин/Fe³⁺-трансферрин в плаз-

MetHb (на 62%) по сравнению с мышами SAMR1,

ме крови пациентов с болезнью Паркинсона на

у которых такая реакция отсутствовала [8]. Этот

разных стадиях заболевания, мы обнаружили, что

факт побудил нас исследовать содержание MetHb

исследуемый показатель выше в крови пациентов

в крови пациентов с болезнью Паркинсона [9]. В

с болезнью Паркинсона по сравнению с контро-

эритроцитах больных с болезнью Паркинсона (на

лем той же возрастной группы за счет увеличива-

третьей-четвертой стадии) было выявлено значи-

ющегося содержания церулоплазмина и тенден-

тельное (в пять раз; p ≤ 0.001) увеличение содер-

ции к снижению насыщенности трансферрина

БИОФИЗИКА том 65

№ 2

2020

378

РИХИРЕВА, МАКЛЕЦОВА

железом. В группах больных, получавших и не

подвергнутых однократному интракраниальному

получавших заместительную L-ДОФА-терапию,

введению нейротоксина MPTP по схеме, анало-

прослеживалась тенденция к постепенному уве-

гичной описанной в работе [19]. Выбор селезенки

личению отношения исследуемых белков при

как объекта изучения был обусловлен тем, что в

прогрессировании заболевания: от 119% (р ≤ 0.01)

этом органе с помощью гем-оксигеназной систе-

на первой стадии до 189% (р ≤ 0.001) на четвертой

мы происходит окончательное разрушение гемо-

стадии по сравнению с контролем. Полученные

глобина (MetHb) с выделением свободных ионов

данные свидетельствуют о наличии при болезни

железа, монооксида углерода и билирубина.

Паркинсона изменений в функционировании

Эксперименты были проведены на 15 крысах-

системы, обеспечивающей снижение содержания

самцах линии Вистар [20]. Животных подвергали

токсичных ионов Fe²⁺в плазме, и эти изменения

однократному интракраниальному введению

являются одним из патогенетических факторов

MPTP для создания модели премоторной стадии

болезни Паркинсона на всех стадиях заболевания

болезни Паркинсона. Исследовали следующие

[17].

группы животных: группа 1 («Контроль») - жи-

Поскольку болезнь Паркинсона является не-

вотные, которым вводили однократно интракра-

излечимым и прогрессирующим заболеванием,

ниально 8 мкл физиологического раствора била-

то особое значение имеет его ранняя диагности-

терально в черную субстанцию (AP = 5.2 мм,

ка. Для исследования механизмов начальных так

ML ± 2 мм, DV = 7.7 мм); группа 2 («Введение

называемых «домоторных» стадий патогенеза бо-

МРТР») - животные, которым вводили одно-

лезни Паркинсона широко используются экспе-

кратно интракраниально МРТР (30 мкг в 8 мкл

риментальные модели болезни на животных, по-

физиологического раствора) билатерально в чер-

скольку клиническая симптоматика становится

ную субстанцию. На 23-и сутки после введения

очевидной только на развернутой стадии заболе-

МРТР животных декапитировали. Образцы кро-

вания, когда нейродегенерации подвергаются

ви и тканей селезенки, мозжечка и продолговато-

уже 60-80% дофаминергических нейронов. Во

го мозга замораживали в жидком азоте для после-

многих работах в качестве экспериментального

дующего измерения спектров ЭПР. Содержание

индуктора паркинсонизма используют низкие

гемоглобина в крови определяли по методу Драб-

дозы нейротоксина МРТР (1-methyl-4-phenyl-

кина (использовали реактивы ООО «Агат-Мед»,

1,2,3,6,-tetrahydropyridine). При участии фермен-

Москва) и выражали в мг на мл крови. Статисти-

та моноаминооксидазы типа В МРТР метаболи-

ческую обработку полученных результатов осу-

зируется в астроцитах в его активный нейроток-

ществляли в соответствии с общепринятыми ме-

сичный метаболит MPP+ (1-метил-4-фенил-2,3-

тодами статистики и выражали в средних значе-

дигидропиридин). Ион ММР+ избирательно по-

ниях ± стандартная ошибка среднего (M ± m).

глощается дофаминергическими нейронами бла-

Для оценки достоверности обнаруженных изме-

годаря его сродству к транспортеру дофамина,

нений применяли тесты Манна-Уитни.

что обусловливает селективность повреждающе-

Измерения показали, что однократное интра-

го действия этого соединения [18].

краниальное введение крысам нейротоксина

В работе [19] была описана и обоснована схема

МРТР через 23 суток вызывает падение концен-

получения модели ранней премоторной («домо-

трации гемоглобина и MetHb в периферической

торной») стадии паркинсонизма у крыс. Она со-

крови на 25% (р ≤ 0.06) и 43% (р ≤ 0.06) соответ-

здается после однократной интракраниальной

ственно, а также увеличение содержания MetHb в

инъекции MPTP (100 мкг) в черную субстанцию

селезенке на 92% (р ≤ 0.06) по сравнению с кон-

мозга, в результате чего имеет место частичная

тролем. Полученные результаты свидетельствуют

дегенерация дофаминергических нейронов с уме-

о том, что регистрируемое в исследуемой экспе-

ренным уменьшением уровня дофамина в нигро-

риментальной модели падение уровня гемогло-

стриатной системе. В описанной модели паркин-

бина в крови крыс по времени соответствует зна-

сонизма через три недели после операции наблю-

чительной активации процесса деградации гемо-

дали депрессивноподобное состояние животных

глобина (увеличение содержания MetHb в

и когнитивные нарушения. Двигательные нару-

селезенке почти вдвое по сравнению с контро-

шения отсутствовали. Таким образом, ранняя

лем). В спектрах ЭПР образцов тканей мозжечка

премоторная стадия болезни Паркинсона харак-

и продолговатого мозга, взятых у крыс с введен-

теризуется эмоциональными и когнитивными

ным MPTP, полностью отсутствовали отчетливо

нарушениями.

регистрируемые в норме [21] сигналы ЭПР ком-

Для выяснении состояния животных в премо-

понентов дыхательной цепи переноса электрона

торной стадии паркинсонизма мы провели изме-

в митохондриях. Этот факт является показателем

рение спектров ЭПР образцов крови, селезенки,

дисфункции митохондрий на ранних стадиях

мозжечка и продолговатого мозга, взятых у крыс,

экспериментального паркинсонизма.

БИОФИЗИКА том 65

№ 2

2020

ПРИМЕНЕНИЕ ЭПР-СПЕКТРОСКОПИИ

379

В качестве подтверждения вывода об актива-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ции катаболизма гемоглобина при болезни Пар-

H. Jiang, J. Wang, J. Rogers, and J. Xie, Mol. Neurobi-

кинсона, по-видимому, можно рассматривать ре-

ol. 54, 3078 (2017). DOI: 10.1007/s12035-016-9879-1.

зультаты недавних работ об изменении концен-

S. R. Danielson and J. K. Andersen, Free Radic. Biol.

трации общего билирубина в крови пациентов с

Med. 44, 1787 (2008).

болезнью Паркинсона [22, 23]. Исследуя не-

O. Hwang, Exp. Neurobiol. 22, 11 (2013).

сколько групп больных с различными стадиями

заболевания (по шкале HY всего пять стадий),

J. Blesa, I. Trigo-Damas, and A. Quiroga-Varela, Front

они обнаружили, что группы с HY ≤ 3 имеет более

Neuroanat. 9, 91 (2015).

высокий уровень билирубина по сравнению со

G. H. Kim, J. E. Kim, S. J. Rhie, et al., Exp. Neurobiol.

здоровым контролем. Авторы предполагают, что

24 (4), 325 (2015).

повышение уровня билирубина связано с активи-

J. Freed and L. Chakrabarti, npj Parkinson’s Disease 2,

зацией фермента гем-оксигеназы на ранних ста-

16021 (2016) DOI: 10.1038/npjparkd.2016.21.

диях болезни Паркинсона [24].

R. D. Abbott, G. W. Ross, C. M. Tanner, et al., Neuro-

Таким образом, применение низкотемпера-

biol. Aging 33, 914 (2012).

турной ЭПР-спектроскопии в изучении метабо-

М. Г. Маклецова, Г. Т. Рихирева, С. Л. Стволин-

лизма железа при болезни Паркинсона на образ-

ский и др., Бюл. эксперим. биологии и медицины

цах крови и суспензии эритроцитов пациентов с

152 (9), 330 (2011).

болезнью Паркинсона позволило установить, что

М. Г. Маклецова, Г. Т. Рихирева, В. В. Полещук

MetHb является биомаркером окислительного

и др., Биомед. химия 62 (2), 193 (2016).

стресса. По уровню MetHb в тканях можно судить

10.

Б. Л. Курляндский и В. А. Филов, Общая токсико-

о наличии окислительного стресса, о создании

логия (М., 2002).

гипоксических условий в организме и об интен-

сификации процесса деградации гемоглобина.

11.

L. Mohorovic, F. M. Lavezzi, S. Stifter, et al., Adv.

Данные, полученные в опытах с животными, ко-

Biosci. Biotechnol. 5 (1), 2014).

торые были подвергнуты воздействию индуктора

12.

R. Savica, B. R. Grossardt, J. M. Carlin, et al., Neurol-

паркинсонизма (MPTP), позволили установить,

ogy 73, 1381 (2009).

что на ранних премоторных стадиях пракинсо-

13.

Q. Deng, X. Zhon, J. Chen, et al., Brain Res. 1655, 145

низма регистрируется активация деградации ге-

(2017).

моглобина (кровь, селезенка) и отключение ми-

14.

М. Г. Маклецова, Т. Н. Федорова, В. В. Полещук

тохондриальной дыхательной цепи переноса

и Г. Т. Рихирева, Биофизика 62 (2), 319 (2017).

электрона в тканях мозга (мозжечок, продолгова-

15.

A. Moghe, S. Ghare, B. Lamoreau, et al., Toxicol. Sci.

тый мозг).

143 (2), 242 (2015).

Полученные данные представляют интерес

16.

А. В. Козлов, В. И. Серпиенко, Ю. А. Владимиров

для выяснения механизмов патогенеза болезни

и др., Бюл. эксперим. биологии и медицины 98,

Паркинсона.

668 (1984).

17.

М. Г. Маклецова, Г. Т. Рихирева, В. В. Полещук и

С. Н. Иллариошкин, Биофизика 62 (6), 1204 (2017).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

18.

С. Н. Иллариошкин, Л. Г. Хаспеков и И. А. Гриве-

венников, Моделирование болезни Паркинсона с ис-

Работа выполнена в рамках Государственного

пользованием плюрипотентных стволовых клеток

задания Минобрнауки России (тема 0082-2014-

(М., 2016).

0001 № АААА-А17-117040610310-6).

19.

А. В. Непоклонов, И. Г. Капица, Е. А. Иванова

и др., Нейрофармакология 75 (11), 3 (2012).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

20.

М. Г. Маклецова, Г. Т. Рихирева, К. В. Грякалов

и др., Асимметрия 12 (4), 336 (2018).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

21.

М. К. Пулатова, Г. Т. Рихирева и З. В. Куроптева,

интересов.

Электронный парамагнитный резонанс в молекуляр-

ной радиобиологии (Энергоатомиздат, М., 1989).

22.

M. Moccia, M. Picillo, R. Erro, et al., Eur. J. Neurol.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

22, 954 (2015).

Все применимые международные, националь-

23.

Macias-Garcia, C. Méndez-Del Barrio, S. Jesús, et al.,

ные и институциональные принципы ухода и ис-

Parkinsonism and Related Disorders 63, 213 (2019).

пользования животных при выполнении работы

DOI: 10.1016/j.parkreldis.2019.01.012.

были соблюдены.

24.

M. F. McCarty, Med. Hypotheses 81, 607 (2013).

БИОФИЗИКА том 65

№ 2

2020