БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 2, с. 412-416

ДИСКУССИИ

УДК 577.1

ЭЛЕКТРОН-КОЛЕБАТЕЛЬНЫЕ ВОЗБУЖДЕННЫЕ КОМПЛЕКСЫ

В ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЯХ

Институт биофизики клетки РАН - обособленное подразделение ФИЦ «Пущинский научный центр биологических

исследований РАН», 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3

E-mail: nvekshin@rambler.ru

Поступила в редакцию 07.07.2018 г.

После доработки 04.09.2019 г.

Принята к публикации 19.09.2019 г.

Проведен анализ энергетического профиля процесса ферментативного катализа. Сделано заключе-

ние, что использование феноменологического уравнения Аррениуса и равновесных термодинами-

ческих параметров теории активированного комплекса Эйринга не позволяет адекватно объяснить

механизм катализа. В фермент-субстратном комплексе в ходе всех стадий в реальности резко нару-

шается максвелл-больцмановское распределение молекул по энергиям, что эквивалентно мгновен-

ному повышению локальной неравновесной температуры. Ферментативные стадии не являются

равновесными и изотермическими. Сорбция субстрата на ферменте приводит (за счет нейтрализа-

ции зарядов или диполей) к локальному высвобождению большой энергии, достаточной для разры-

ва ковалентной связи или переноса электрона с образованием переходного электрон-колебательно-

го возбужденного комплекса. Именно энергия этих комплексов обеспечивает протекание дальней-

ших, более медленных, стадий (перегруппировка или перенос атомов, десорбция продукта).

Ферментативные реакции идут через образование неравновесных электрон-колебательных возбуж-

денных комплексов, кинетически не подчиняющихся термодинамике в стиле Эйринга.

Ключевые слова: ферменты, катализ, энергия активации, уравнение Аррениуса, переходный комплекс,

теория Эйринга, электронно-возбужденные состояния.

DOI: 10.31857/S000630292002026X

ФЕНОМЕН КАТАЛИЗА

ОБ УРАВНЕНИЯХ АРРЕНИУСА И ЭЙРИНГА

Традиционные представления об энергетиче-

Феномен катализа - колоссального (в тысячи

ском профиле ферментативных процессов [1-4]

и миллионы раз) увеличения скорости - является

основаны на феноменологическом уравнении

одним из важнейших признаков ферментативных

Аррениуса, предложенном еще в позапрошлом

реакций [1, 2]. С термодинамической точки зре-

веке, и теории переходного активированного

ния катализ обусловлен двумя факторами - эн-

комплекса, предложенной Г. Эйрингом в середи-

тальпийным (энергетическим) и энтропийным

не прошлого века. В уравнении Аррениуса фигу-

(стерическим) [3, 4]. Первый из них заключается

рируют энергия активации и температура, экспо-

в энергетическом выигрыше при присоединении

ненциально связанные со скоростью реакции. В

субстрата к ферменту в ходе нейтрализации (ча-

уравнении Эйринга фигурируют термодинамиче-

стичной или полной) разноименных зарядов, а

ские параметры - свободная гиббсовская энер-

также в ходе образования ионных и водородных

гия, энтропия, энтальпия, а также температура,

связей. Второй заключается в том, что, соединя-

причем эти параметры приписаны субстрат-фер-

ясь с ферментом, субстрат в значительной степе-

ментному переходному комплексу [5]. В основе

ни очищается от водной «шубы» и располагается

теории Эйринга лежит, в частности, постулат о

в пространстве нужным образом. При этом фер-

том, что во время течения реакции не нарушается

максвелл-больцмановское распределение моле-

мент ограничивает число степеней свободы, на-

кул по энергиям. Иными словами, в активных

правляя реакцию вдоль определенной простран-

центрах ферментов не должно появляться нерав-

ственной координаты.

новесных «горячих» промежуточных комплексов

Сокращениe: ЭКВК - электрон-колебательный возбуж-

или продуктов, температура которых отличалась

денный комплекс.

бы от температуры среды [4, 5].

412

ЭЛЕКТРОН-КОЛЕБАТЕЛЬНЫЕ ВОЗБУЖДЕННЫЕ КОМПЛЕКСЫ

413

Формальная замена аррениусовской энергии

белковой глобулы и повышает ее конформацион-

активации на свободную энергию Гиббса, сде-

ную подвижность [17]. Указанные обстоятельства

ланная Эйрингом и соавторами [5], не имеет фи-

ни Аррениусом, ни Эйрингом в расчет не прини-

зического смысла, ибо термодинамика примени-

мались.

ма только для нахождения баланса процесса, но

не для описания пути реакции, ее механизма. Ис-

ЭНЕРГИЯ АКТИВАЦИИ

пользование уравнения Аррениуса и теории Эй-

ринга не позволяет адекватно объяснить пониже-

В уравнение Аррениуса принято подставлять

ние энергетического активационного барьера

температуру среды (T) и считать ее неизменной в хо-

ферментом.

де всех элементарных стадий ферментативного про-

цесса. Измеряя зависимость скорости реакции от T,

можно найти некоторую энергию активации Е_а. Как

ВОЗБУЖДЕННЫЕ СОСТОЯНИЯ

было показано в работе [18], эта Е_а является кажу-

Никаких экспериментальных доказательств

щейся и не имеет прямого отношения к истинной

постулата Аррениуса об особых «активных моле-

энергии активации - энергии, необходимой для на-

кулах» и постулата Эйринга о равновесном рас-

чала протекания реакций внутри субстрат-фермент-

пределении по энергии в ходе катализа не суще-

ного комплекса. Автор работы [18] правильно указал

ствует. Наоборот, во множестве каталитических

на некорректность аррениусовской интерпретации

реакций найдены неравновесные электронные и

и на неприменимость равновесной термодинамики

колебательные возбужденные состояния, детек-

для описания работы ферментов. Истинная энергия

тируемые по хемилюминесценции [6], биолюми-

активация - это энергия, необходимая для преодо-

несценции [7] и инфракрасному излучению [8-

ления активационного барьера реакции, т. е. для ак-

10]. В ходе обычных ферментативных процессов в

тивации субстрата, а кажущаяся - та, которая опре-

ряде случаев регистрируется сигнал электронного

деляется по уравнению Аррениуса из зависимости

парамагнитного резонанса [11, 12], что говорит о

скорости при разных температурах. Кажущаяся

наличии триплетных возбужденных состояний.

энергия активации обусловлена прежде всего диф-

Введя акцептор энергии, можно по его излуче-

фузионными факторами, вязкостью среды [14], а

нию выявить наличие таких состояний, как это

также микровязкостью самого фермента.

было сделано, например, для пероксидазы [13].

ЭЛЕКТРОННЫЕ И ЯДЕРНЫЕ ПЕРЕХОДЫ

ЧИСЛО АКТИВНЫХ МОЛЕКУЛ

Еще один недостаток теории Эйринга состоит

При повышении температуры на 10 градусов,

в том, что в качестве «координаты реакции» рас-

как известно, скорость ферментативных реакций

сматривается расстояние между ядрами, а нужно

возрастает как минимум вдвое [1, 2]. Аррениус и

брать расстояние между ядрами и электронами.

затем Эйринг объясняли это возрастанием доли

Ведь в первую очередь именно электронные ор-

«активных» молекул. Такое объяснение ошибоч-

битали участвуют во взаимодействиях [19]. Элек-

но. Например, при 300 К и 310 К различие состав-

тронные переходы происходят мгновенно, а ядра

ляет 1,03 раза, но никак не 2 раза. Это элементар-

затем медленно перестраиваются в новую конфи-

но находится при объединении двух аррениусов-

гурацию [20]. Авторы работы [20] четко указали

ских уравнений:

на роль возбужденных состояний в ферментатив-

a₁/a2 = exp{E_иа(T₂ - T₁)/(RT₁T₂)},

(1)

ных реакциях и даже рассчитали этот вклад для

некоторых реакций, но при этом они не рассмат-

где E_иа - истинная энергия активации, a₁ - коли-

ривали процессы как неравновесные, идущие

чество активных молекул при температуре T₁,

при высокой внутримолекулярной температуре.

a₂ - количество активных молекул при повышен-

Энергетический вклад ядерных (колебательных)

ной температуре T₂.

движений на порядок меньше, чем электронных.

При этом электрон-колебательные переходы

квантованы, дискретны, что принципиально от-

РОЛЬ ВЯЗКОСТИ

личается от непрерывной траектории движения в

теории Эйринга.

На самом деле увеличение скорости работы

ферментов при некотором повышении темпера-

туры в значительной степени обусловлено триви-

ЭНЕРГИЯ ХЕМОСОРБЦИИ

альным диффузионным фактором - понижением

При сорбции субстрата на ферменте высво-

вязкости растворителя [14, 15]. Например, при

бождается большой квант энергии хемосорбции

увеличении температуры от 10 до 30°С вязкость

Е_хем [4, 20], который заведомо превышает вели-

воды падает от 1.3 до 0.8 пуаз [16]. Кроме того, по-

вышение температуры уменьшает микровязкость

чину Е_а. Этот квант почти весь используется для

БИОФИЗИКА том 65

№ 2

2020

414

ВЕКШИН

безактивационного протекания дальнейших ста-

ческого профиля энзиматических реакций были

дий. При полной нейтрализации двух разноимен-

привлечены представления о том, что в активном

ных электрических зарядов величина Е_хем может

центре фермента происходит смешивание моле-

быть найдена по следующему уравнению:

кулярных орбиталей основного и возбужденного

состояния субстрата, изменяющие его геомет-

Е_хем = 2.15 × 10⁶Nq₁q₂/rε,

(2)

рию, дипольный момент и рК.

Нужно отметить, что отсутствие свечения в хо-

где q₁ и q₂ - величины положительного и отрица-

де большинства энзиматических реакций вовсе

тельного заряда, N - число Авогадро, r - конеч-

не означает отсутствия ЭКВК. В таких реакциях

ное расстояние между нейтрализующимися заря-

энергия ЭКВК не высвечивается (в ультрафиоле-

дами, ε - диэлектрическая проницаемость (при-

товой или видимой области), а запасается в про-

чем не внешней среды, а групп субстрата и

дукте и частично теряется в виде теплового ин-

активного центра фермента). При r = 1,5 Å (длина

фракрасного излучения, поглощаемого водой.

ковалентной связи) и ε = 1 получаем максималь-

ную Е_хем = 250 ккал/моль. Этой энергии доста-

точно для разрыва любой ковалентной связи. Для

ЛОКАЛЬНАЯ НЕРАВНОВЕСНАЯ

ферментов можно брать именно ε ~ 1, так как мо-

ТЕМПЕРАТУРА

лекулы воды (ε = 81) обычно не помещаются меж-

Ферментативные реакции не являются равно-

ду нейтрализующимися группами. При неполной

весными и изотермическими, поскольку в их ходе

нейтрализации зарядов (диполи и т. д.) и при ε > 1

возбуждаются электронные степени свободы (с

величина Е_хем может оказаться меньше, но все

энергиями порядка 100 ккал/моль) или (и) коле-

равно она выше энергии активации. Формулу по

бательные (с энергиями порядка 10 ккал/моль).

нейтрализации зарядов можно использовать для

Фермент понижает активационный барьер за

конкретных ферментативных реакций, если из-

счет возникновения ЭКВК. В ходе всех стадий

вестны заряды и дипольные моменты, расстоя-

сильно нарушается максвелл-больцмановское

ния и диэлектрическая постоянная.

распределение молекул по энергиям, повышается

локальная (неравновесная) температура в актив-

ЭЛЕКТРОН-КОЛЕБАТЕЛЬНЫЕ

ном центре. Фермент всегда ведет реакцию при

высокой неравновесной внутримолекулярной

ВОЗБУЖДЕННЫЕ КОМПЛЕКСЫ

температуре. Локальная температура субстрата и

Величина Е_хем связана с энтальпьным членом

активного центра совпадает с температурой сре-

ΔН гиббсовской свободной энергии ΔG. Не вся

ды только до и после каталитического акта, но в

Е_хем тратится для совершения полезной работы,

ходе акта - сильно не совпадает.

ибо небольшая часть теряется в тепло. Теплота

Здесь нужно особо заметить, что широко рас-

сорбции ΔН (энтальпия), измеряемая калоримет-

пространенное мнение о том, что температура яв-

рически, представляет собой малую потерянную

ляется мерой средней кинетической энергии, яв-

энергию:

ляется далеко не полным Это мнение верно для

ΔН = Е_хем - Е*,

(3)

газов, где межмолекулярные взаимодействия

пренебрежимо малы, а электронные и колеба-

где Е* - энергия переходного электрон-колеба-

тельные уровни не заселены. На самом же деле

тельного возбужденного комплекса (ЭКВК). По-

температура является мерой заселения всех сте-

теря небольшой (колебательной) части энергии в

пеней свободы молекул - вращательных, посту-

тепло при сорбции субстрата (С) на ферменте (Ф)

пательных, колебательных и электронных [15,

обеспечивает необратимость протекания даль-

21]. Например, при фотовозбуждении молекул в

нейших стадий. При этом обратимость фермента-

ультрафиолетовой и видимой области основной

тивной реакции, как таковой, сохраняется (пря-

вклад дают электронные переходы, соответству-

мой и обратный путь совпадают):

ющие неравновесным температурам в несколько

С + Ф = ЭКВК ⋅ СФ = П + Ф.

(4)

тысяч градусов [17, 21].

Возникший ЭКВК быстро перестраивается и

затем трансформируется в продукт (П). Это про-

ТЕМПЕРАТУРА, ЭНЕРГИЯ, ВОЛНОВОЕ

исходит раньше, чем ЭКВК успеет релаксировать

ЧИСЛО, ЧАСТОТА

в равновесное состояние. Именно энергия ЭКВК

При 300 К средняя энергия молекул составля-

в конечном счете обеспечивает протекание даль-

ет, как известно, всего 0.6 ккал/моль [15], т.е. со-

нейших стадий

- перегруппировку, перенос

ответствует энергии поступательных и враща-

электронов или групп, десорбцию продукта ре-

тельных степеней свободы. В шкале волновых чи-

акции.

сел 0.6 ккал/моль - это 200 см^-1, т. е. это дальний

Не случайно в монографии М.В. Волькен-

штейна с соавторами [20] для описания энергети-

инфракрасный диапазон; в шкале частот это 10^-12 с.

БИОФИЗИКА том 65

№ 2

2020

ЭЛЕКТРОН-КОЛЕБАТЕЛЬНЫЕ ВОЗБУЖДЕННЫЕ КОМПЛЕКСЫ

415

Если взять Ä = 2000 см^-1 (6 ккал/моль), то в шкале

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Автор заявляет об отсутствии конфликта инте-

частот это 10^-10 с, т. е. это колебательные перехо-

ресов.

ды. Если взять Ä = 20000 см^-1 (60 ккал/моль), то

получаем 10^-9 с - типичное время жизни элек-

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

тронно-возбужденного состояния [17]. Именно

Настоящая работа не содержит описания ка-

за такое время осуществляется элементарный акт

ких-либо исследований с использованием людей

ферментативного катализа. Скорость же всей

и животных в качестве объектов.

полной ферментативной реакции лимитируется

самой медленной стадией - десорбцией продукта

[1, 3, 17].

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

М. Диксон и Э. Уэбб, Ферменты (Мир, М., 1982).

Пользуясь простой формулой Вина для спек-

А. Ленинджер, Основы биохимии (Мир, М., 1985).

тра излучения при некоторой температуре [21]

Э. Фёршт, Структура и механизм действия фермен-

(или точнее - формулой Планка) и зная энергию

тов (Мир, М., 1980).

излучаемых квантов (Е = hÄ), можно найти нерав-

Г. И. Лихтенштейн, Многоядерные окислительно-

новесную температуру (Е = kT). Электронные пе-

восстановительные металлоферменты (Наука, М.,

реходы соответствуют неравновесным локаль-

1979).

ным температурам в несколько тысяч градусов.

С. Глесстон, К. Лейдлер и Г. Эйринг, Теория абсо-

Например, для биолюминесценции в желтой об-

лютных скоростей реакций (ИЛ, М., 1948).

ласти спектра неравновесная температура состав-

6. A. Kricka and J. Larry, Anal. Chem. 67 (12), 499R

ляет около 5000 К.

(1995).

O. Shimomura, Bioluminescence: Chemical Principles

and Methods (World Scientific, 2006).

ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

P. Woerkom and R. Groot, Appl. Optics 21 (17), 3114

(1982).

Во всех обычных «темновых» ферментативных

J. I. Steinfeld, J. S. Francisco, and W. L. Hase, Chemi-

реакциях (а не только в биолюминесцентных и

cal Kinetics and Dynamics (Prentice-Hall, 1998).

фотохимических) активный центр сильно «разо-

10.

S. Torres, H. Mella, C. Reyes, et al., Appl. Optics 54

гревается» субстратом, в результате чего облегча-

(8), 2057 (2015).

ется не только энергетическая составляющая, но

11.

B. Commoner, B. Lippincott, and J. Passonneau, Proc.

и стерическая, так как разогрев увеличивает ди-

Natl. Acad. Sci. USA 44, 1099 (1958).

намику, подвижность активного центра и облег-

12.

T. Hollocher and B. Commoner, Proc. Natl. Acad. Sci.

чает десорбцию продукта.

USA 46, 416 (1960).

13.

Y. Cilento, Photochem. Photobiol. 5, 199 (1980).

Скорость ферментативной реакции в растворе

14.

И. Б. Заводник, Биофизика 36 (1), 46 (1991).

лимитируется диффузией и стерическими факто-

15.

П. Эткинс, Физическая химия (Мир, М., 1980), т. 2.

рами, но элементарные стадии катализа являются

16.

Краткий справочник физико-химических величин

по сути мономолекулярными, похожими на из-

(Химия, Л., 1974).

вестные термохимические реакции, не подчиня-

17.

N. L. Vekshin, Photonics of Biopolymers (Springer, Ber-

ющимися теории Эйринга, ибо они идут по не

lin, 2002).

изотермическому пути и сопровождаются высво-

18.

Л. А. Блюменфельд, Проблемы биологической физи-

бождением квантов энергии 10-50 ккал/моль

ки (Наука, М., 1974).

[22, 23].

19.

Л. А. Грибов, От теории спектров к теории химиче-

ских превращений (УРСС, М., 2001).

Протекание структурных изменений на стади-

20.

М. В. Волькенштейн, И. Б. Голованов и В. М. Со-

ях ферментативных реакций удается описывать

болев. Молекулярные орбитали в энзимологии (Нау-

методами молекулярной динамики

[24]. При

ка, М., 1982).

этом энергетический профиль обычно имеет ста-

21.

Дж. Тригг, Решающие эксперименты в современной

дии с энергиями 5-20 ккал/моль, которые суще-

физике (Мир, М., 1974).

ственно выше равновесных (0.6 ккал/моль). Ре-

22.

B. Hartke and J. Manz, J. Am. Chem. Soc. 110, 3063

зультаты расчетов методами равновесной моле-

(1988).

кулярной динамики, как отмечено в работе [24],

23.

J. Polanyi, Science 236 (4802), 680 (1987).

часто не совпадают с экспериментальными дан-

24.

А. В. Немухин, Б. Л. Григоренко, С. В. Лущекина и

ными.

С. Д. Варфоломеев, Успехи химии 81, 1011 (2012).

БИОФИЗИКА том 65

№ 2

2020