БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 3, с. 524-529

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 577.3

ВЛИЯНИЕ СЛАБОГО ПОСТОЯННОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ

В ДИАПАЗОНЕ ВЕЛИЧИН ОТ «НУЛЕВОГО» ПОЛЯ (0,01 мкТл)

ДО 100 мкТл НА ПРОДУКЦИЮ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА

В НЕАКТИВИРОВАННЫХ НЕЙТРОФИЛАХ

Институт биофизики клетки РАН - обособленное подразделение ФИЦ «Пущинский научный центр биологических

исследований РАН», 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3

E-mail: docmag@mail.ru

Поступила в редакцию 16.12.2019 г.

После доработки 16.12.2019 г.

Принята к публикации 24.12.2019 г.

Показано, что 40-минутное экспонирование перитонеальных нейтрофилов в гипомагнитных усло-

виях (при величине остаточного поля 0.01 мкТл) вызывает значительное (на 25%) уменьшение ин-

тенсивности флуоресценции внутриклеточного дихлорфлуоресцеина. При увеличении постоянно-

го магнитного поля до 1 мкТл величина этого эффекта ослабленного магнитного поля сохраняется.

При дальнейшем увеличении поля до 2.5 мкТл эффект действия поля исчезает и снова проявляется

при 5 мкТл в редуцированном виде, достигая максимума при 7 мкТл. При последовательном увели-

чении индукции постоянного магнитного поля (9, 15, 19.5 мкТл) отмечается столь же выраженный

и устойчивый ингибирующий эффект, степень выраженности которого значительно снижается

только при 30 мкТл. Далее, при величине постоянного магнитного поля 45 мкТл значения интен-

сивности флуоресценции продуктов окисления 2,7-дихлордигидрофлуоресцеина уже не отличают-

ся от контрольных. При дальнейшем увеличении поля до 74 мкТл и 100 мкТл также не отмечено

влиияние на эти процессы.

Ключевые слова: гипомагнитное поле, геомагнитное поле, нейтрофилы, активные формы кислорода,

флуоресценция.

DOI: 10.31857/S0006302920020114

ристат-13-ацетата) и, следовательно, не обуслов-

В литературе имеется ряд сообщений о сниже-

лен нарушением ответа нейтрофилов на эти

нии продукции активных форм кислорода (АФК)

стимулы, нами с целью определения возможных

в гипомагнитных условиях в различных типах

молекулярных механизмов этого действия «нуле-

клеток и при различной экспозиции [1-4]. Ранее

вого» поля был проведен комплекс специальных

нами было показано, что полуторачасовое экспо-

исследований на неактивированных нейтрофи-

нирование перитонеальных нейтрофилов мышей

лах [6]. Было показано, что снижение интенсив-

при магнитном экранировании в гипомагнитных

ности процессов окисления 2,7-дихлордигидро-

условиях (остаточное постоянное магнитное поле

флуоресцеина в неактивированных нейтрофилах

менее 20 нТл) вызывает снижение базовой внут-

в гипомагнитных условиях не зависит от каль-

риклеточной продукции активных форм кисло-

ций-опосредованных регуляторных механизмов,

рода, регистрируемое по изменению интенсивно-

о чем свидетельствует отсутствие действия внут-

сти флуоресценции продуктов окисления 2,7- ди-

риклеточного хелатора ионов кальция (ацетокси-

хлордигидрофлуоресцеина и дигидрородамина

метилового эфира

1,2-бис(2-аминофенок-

123 [5, 6]. Учитывая то, что эффект действия ги-

си)этан-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты) на

помагнитного поля проявлялся в опытах на ней-

интенсивность этого процесса [6]. Это снижение

трофилах без дополнительной их стимуляции хи-

вряд ли обусловлено влиянием гипомагнитных

мическими активаторами респираторного взрыва

условий на фосфорилирование компонентов

(формилированным пептидом N-formyl-Met-

НАДФН-оксидазы, так как добавка ингибитора

Leu-Phe или форболовым эфиром форбол-12-ме-

протеинкиназы С (Ro 31-6233) практически не

Сокращения: АФК - активные формы кислорода, МП -

отразилась на интенсивности флуоресценции

магнитное поле, ГМП - геомагнитное поле.

внутриклеточного дихлордигидрофлуоресцеина

524

ВЛИЯНИЕ СЛАБОГО ПОСТОЯННОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ

525

Рис. 1. Блок магнитной обработки: 1 - магнитные экраны; 2 - соленоид; 3 - термостастабилизированная кювета; 4 -

экспериментальные образцы.

[6]. Добавка ингибитора фосфолипазы С (U73122)

Хенкса и оставляли на 1 ч при 4°C. Количество

немного и приблизительно одинаково снизила

выделенных клеток подсчитывали в камере Горя-

продукцию АФК как в контроле, так и в опыте

ева. Жизнеспособность клеток определяли, ис-

[6]. О возможном участии электрон-транспорт-

пользуя витальный краситель трипановый синий.

ной цепи митохондрий в механизме этого эффек-

Содержание живых клеток при этом составляло

та «нулевого» поля свидетельствует снижение

не менее 98%. Для опытов образцы получали, раз-

продукции АФК при добавке ротенона, значи-

водя суспензию нейтрофилов стандартной сре-

тельно более выраженное в опытных образцах,

дой Хенкса (138 мM NaCl, 6 мM KCl, 1 мМ Mg-

подвергшихся

действию

гипомагнитного

SO₄, 1 мM Na₂HPO₄, 5 мM NaHCO₃, 5,5 мM глю-

поля [6].

козы, 1 мM CaCl₂, 10 мМ HEPES, pH 7.4; Sigma,

В связи с этими результатами возникает во-

США) до концентрации 1 млн кл/мл.

прос о том, каким образом данный эффект гипо-

Экспонирование суспензии нейтрофилов в по-

магнитного поля зависит от величины остаточно-

стоянном магнитном поле заданной величины. Ней-

го магнитного поля и, более широко, от величи-

трофилы инкубировали при 37.0 ± 0.2°С в кон-

ны постоянной компоненты магнитного поля

центрации 1 млн/мл по 250 мкл в полипропиле-

(МП) в диапазоне ослабленного геомагнитного

новых пробирках типа Эппендорф. Заданная

поля (ГМП), параметров ГМП (34-68 мкТл и да-

температура поддерживалась циркуляционным

лее до 100 мкТл). Ответить на этот вопрос предпо-

термостатом. Типичное время инкубации состав-

лагается в данном исследовании.

ляло 40 мин. Образцы контрольных групп нахо-

дились в локальном геомагнитном поле с посто-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

янной составляющей ∼45 мкТл и уровнем маг-

нитного фона на 50 Гц 15-50 нТл.

Получение суспензии нейтрофилов. Работа вы-

полнена на перитонеальных нейтрофилах мы-

В опытах была использована специальная, не-

шей. Для получения нейтрофилов использовали

обходимая для корректного выполнения работ с

лабораторных мышей самцов линии CD-1 массой

ослабленным геомагнитным полем и со слабыми

24-26 г, полученных из питомника лабораторных

МП, исследовательская аппаратура - установка

животных ФИБХ РАН (Пущино, Московская об-

для формирования гипомагнитных условий, ко-

ласть). В перитонеальную полость мыши инъеци-

торая позволяла получить высокую степень

ровали 150 мкл суспензии опсонизированного

ослабления ГМП - до 10000 раз (остаточное по-

зимозана с концентрацией 5 мг/мл (Zymozan A из

стоянное поле не превышало 10 нТл) и суще-

Saccharomyces carevisiae, Sigma, США). После это-

ственно ослабляла переменные техногенные по-

го через 12 ч животных умерщвляли методом цер-

мехи (до единиц нТл). Эта установка состояла из

викальной дислокации, их брюшную полость

трех вставленных соосно один в другой цилин-

промывали четырьмя миллилитрами охлажден-

дрических магнитных экранов из пермаллоя

ного раствора Хенкса без кальция. Экссудат соби-

(толщиной 1 мм), закрытых крышками с отвер-

рали пипеткой и центрифугировали в течение

стиями для подводки измерительной и термоста-

5 мин при 600 g. Супернатант декантировали, а

билизирующей аппаратуры (рис. 1). Определение

осадок разводили в 4 мл бескальциевого раствора

остаточных полей в установке проводили пря-

БИОФИЗИКА том 65

№ 3

2020

526

НОВИКОВ и др.

125

100

Номер группы

Рис. 2. Влияние постоянного магнитного поля на интенсивность флуоресценции дихлорфлуоресцеина в суспензии

нейтрофилов. По оси ординат - максимальная интенсивность флуоресценции в процентах по отношению к контролю

(средние значения и стандартные отклонения, n = 8); по оси абсцисс - номер группы: 1 - контроль, 2 - постоянное

МП 0.01 мкТл, 3 - 1.0 мкТл, 4 - 2.5 мкТл, 5 - 5.0 мкТл, 6 - 7.0 мкТл, 7 - 9.0 мкТл, 8 - 15.0 мкТл, 9 - 19.5 мкТл, 10 -

30 мкТл, 11 - 45 мкТл, 12 - 74 мкТл, 13 - 100 мкТл. Звездочкой отмечены достоверные отличия между группами

(P < 0.05).

мым измерением с помощью феррозондового

клетки флуоресцентного зонда на АФК - 2,7-ди-

магнитометра Mag-03 MS 100 (Bartington, Вели-

хлордигидрофлуоресцеина диацетата

[7-10].

кобритания). Для формирования эксперимен-

H₂DCF-DA проникает в клетку, где под действи-

тального слабого однородного постоянного МП

ем внутриклеточных эстераз переходит в форму

различной интенсивности (1.0, 2.5, 5.0, 7.0, 9.0,

H₂DCF. H₂DCF

- слабо флуоресцирующий

15.0, 19.5, 30, 45, 74, 100 мкТл) внутри этой систе-

агент, который в реакциях с окислителями пре-

мы был установлен специальный индуктор (соле-

вращается в сильно флуоресцирующий продукт -

ноид), подключенный к источнику постоянного

дихлорфлуоресцеин.

тока. Размеры экспериментального участка внут-

ри экранов (диаметр 20 см, длина 40 см) позволя-

Результаты статистически обработаны с при-

ли поместить одновременно в зону однородного

менением t-критерия Стьюдента. Часть резуль-

слабого магнитного поля достаточное для опытов

татов представлена в процентах, как отношение

число экспериментальных образцов (не менее 8).

максимальной интенсивности флуоресценции

Опыты повторяли не менее трех раз.

при длине волны 528 нм в опытах к значению в

контроле, принятому за 100%.

Флуоресцентная детекция внутриклеточных

АФК. После 40-минутной инкубации к суспензии

нейтрофилов добавляли флуоресцентный зонд на

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

внутриклеточные АФК - 2,7-дихлордигидрофлу-

оресцеин диацетат (H₂DCF-DA) (Sigma, США)

Экспонирование перитонеальных нейтрофи-

лов в гипомагнитных условиях (при величине

до конечной концентрации 0.01 мг/мл. Пробы

остаточного поля 0.01 мкТл) вызывает значитель-

продолжали инкубировать в течение 30 мин при

ное (на 25%) уменьшение интенсивности флуо-

37°С в темноте, чтобы минимизировать фотоок-

ресценции внутриклеточного дихлорфлуоресце-

сидацию красителя. Затем клетки отмывали, цен-

ина (рис. 2, 3). При увеличении постоянного МП

трифугируя при 600 g в течение 5 мин при комнат-

до 1 мкТл величина этого эффекта ослабленного

ной температуре в растворе Хенкса. Далее к осад-

МП сохраняется (рис. 2). При дальнейшем увели-

ку добавляли 1 мл среды, ресуспендировали и

чении поля до 2.5 мкТл эффект действия поля ис-

регистрировали спектры флуоресценции образ-

чезает и снова проявляется при 5 мкТл в редуци-

цов на приборе Lumina Fluorescence Spectrometer

рованном виде, достигая максимума при 7 мкТл

(Thermo Fisher Scientific, США), при возбужде-

(рис. 2). Любопытно, что при последовательном

нии на длине волны 488 нм.

увеличении индукции МП на следующих трех

Следует отметить, что нами был применен ме-

значениях величины постоянного МП (9.0, 15.0,

тод флуоресцентной спектроскопии с использо-

19.5 мкТл) отмечается столь же выраженный и

ванием хорошо изученного проникающего в

устойчивый ингибирующий эффект, степень вы-

БИОФИЗИКА том 65

№ 3

2020

ВЛИЯНИЕ СЛАБОГО ПОСТОЯННОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ

527

(а)

(б)

35000

25000

30000

20000

25000

15000

20000

15000

10000

5000

500

550

600

650

500

550

600

650

Длина волны, нм

(в)

(г)

25000

35000

30000

20000

25000

15000

20000

15000

10000

5000

500

550

600

650

500

550

600

650

Длина волны, нм

Рис. 3. Спектры флуоресценции дихлорфлуоресцеина в суспензии нейтрофилов в контроле (1) и в опыте (2) после

действия некоторых величин постоянного магнитного поля: (а) - 0.01 мкТл, (б) - 2.5 мкТл, (в) - 7.0 мкТл, (г) -

100 мкТл.

раженности которого значительно снижается

При анализе результатов важно отметить, что

только при 30 мкТл. В этой связи важно отметить,

форма спектров и положение максимума интен-

что величина постоянного поля 30 мкТл прибли-

сивности использованного флуоресценции зонда

в «нулевом» магнитном поле, в ослабленном и в

зительно соответствует нижнему уровню диапа-

усиленном постоянном МП (по отношению к

зона ГМП (34-68 мкТл). Далее, при величине по-

ГМП) не изменялись относительно этих парамет-

стоянного МП 45 мкТл, соответствующей ло-

ров в контроле (рис. 3).

кальному значению ГМП в зоне, где были

расположены контрольные образцы в наших

Нам представляется информативной обнару-

опытах, значения интенсивности флуоресценции

женная зависимость интенсивности флуоресцен-

продуктов окисления

2,7-дихлордигидрофлуо-

ции продуктов окисления H₂DCF-DA в нейтро-

ресцеина не отличаются от контрольных образ-

филах от величины постоянного магнитного поля

цов (рис. 2). При дальнейшем увеличении поля до

в изученном диапазоне его индукции (0.01-

величин 74 мкТл и 100 мкТл, уже выходящих за

100 мкТл), которая свидетельствует о высокой

верхний уровень диапазона ГМП, не отмечено

чувствительности этих процессов к изменению

действия поля на эти процессы. В этом случае по-

магнитных условий. Выявленная анизотропия

казатели флуоресценции продукта окисления

ответа биологической системы на такое воздей-

H₂DCF-DA -дихлорфлуоресцеина - уже не от-

ствие может дать конкретную информацию для

личаются от контрольных (рис. 2).

анализа физических механизмов неспецифиче-

БИОФИЗИКА том 65

№ 3

2020

528

НОВИКОВ и др.

ской магниторецепции. В настоящий момент на-

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

бирает популярность модель неспецифической

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

(не связанной с определенными рецепторами)

интересов.

магниторецепции [11], основанная на анализе

прецессии магнитных моментов и молекулярных

вращениях в слабом МП, в которой для реали-

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

стичных оценок полученные нами данные могли

Все применимые международные, националь-

бы быть полезны. Также нельзя исключить из

ные и институциональные принципы ухода и ис-

рассмотрения ион-резонансные механизмы дей-

пользования животных при выполнении работы

ствия слабого поля [12]. В этом случае можно

были соблюдены.

предположить, что при различных величинах по-

стоянного магнитного поля система генерации

внутренних электрических процессов в клетке

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

или в межклеточной среде будет попадать или нет

H. Zhang, Z. Zhang, W. Mo, et al., Prot. Cell 8 (7), 527

в резонансные условия [13, 14], что могло бы от-

(2017).

разиться на интенсивности процессов внутрикле-

точного окисления.

C. F. Martino and P. R. Castello, PLoS One 6 (8),

e22753 (2011).

С практической точки зрения крайне важным

P. Politanski, E. Rajkowska, M. Brodecki, et al., Bio-

представляется результат отсутствия биологиче-

electromagnetics 34, 333 (2013).

ского действия слабого постоянного МП при ве-

личине 2.5 мкТл, в то время как при меньших

V. N. Binhi and F. S. Prato, PLoS One 12 (6), e0179340

(2017).

(1 мкТл) и при больших (7 мкТл) значениях поля

суспензия нейтрофилов реагирует на воздей-

В. В. Новиков, Е. В. Яблокова и Е. Е. Фесенко,

ствие. Это тем более интересно, что ранее на дру-

Биофизика 63 (3), 484 (2018).

гой экспериментальной модели - делении плана-

В. В. Новиков, Е. В. Яблокова, Э. Р. Валеева и

рий Dugesia tigrina - был получен аналогичный

Е. Е. Фесенко, Биофизика 64 (4), 720 (2019).

результат (отсутствие действия) при близкой ве-

J. P. Crow, Nitric Oxide: Biology and Chemistry 1 (2),

личине постоянного МП - 3 мкТл [15, 16]. Край-

145 (1997).

не любопытно то, что процессы окисления

H₂DCF в нейтрофилах оказались чувствительны

S. L. Hempel, G. R. Buettner, Y. Q. O’Malley, et al.,

Free Radic. Biol. Med. 27 (1-2), 146 (1999).

к действию ослабого постоянного магнитного по-

ля в широком диапазоне его величин, от

G. Bartosz, Clin. Chim. Acta 368, 53 (2006).

0.01 мкТл вплоть до практически нижней грани-

10.

M. Freitas, J. L. Lima, and E. Fernandes, Anal. Chim.

цы ГМП - 30 мкТл (исключая одно значение -

Acta 649, 8 (2009).

2.5 мкТл). Эти данные, наряду с ранее получен-

11.

V. N. Binhi and F. S. Prato, Sci. Rep. 8, 13495 (2018).

ными о том, что слабые комбинированные маг-

нитные поля

- постоянное магнитное поле

12.

A. R. Liboff, Electromagn. Biol. Med. 38 (2), 143

(60 мкТл) и коллинеарное ему переменное низко-

(2019).

частотное магнитное поле на частоте 49.5 Гц

13.

В. В. Новиков и М. Н. Жадин, Биофизика 39 (1), 45

(близкой к промышленной частоте 50 Гц) при ам-

(1994).

плитудах в диапазоне 60-180 нТл - вызывают,

14.

M. N. Zhadin, V. V. Novikov, F. S. Barnes, and

при превентивном

40-минутном воздействии,

N. F. Pergola, Bioelectromagnetics 19, 41 (1998).

значительное снижение интенсивности респира-

торного взрыва в суспензии нейтрофилов в ответ

15.

В. В. Новиков, И. М. Шейман и Е. Е. Фесенко,

на активатор - пептид N-формил-Met-Leu-Phe

Биофизика 52 (5), 912 (2007).

[17], а также последними данными о сильном

16.

V. V. Novikov, I. M. Sheiman, and E. E. Fesenko, Bio-

влиянии имитаций геомагнитных бурь на биоло-

electromagnetics 29, 387 (2008).

гические объекты [18, 19], указывают на высокую

17.

В. В. Новиков, Е. В. Яблокова и Е. Е. Фесенко,

чувствительность биологических процессов к ва-

Биофизика 65 (1), 97 (2020).

риациям слабых магнитных полей. Следует отме-

тить, что возможность выявления этих реакций

18.

И. Л. Голованова, А. А. Филиппов, Ю. В. Чебота-

рева и др., Вопросы ихтиологии 55 (4), 476 (.

появилась только в последнее время благодаря

использованию специальной экранирующей и

19.

А. В. Pомановcкий, Д. C. Пеcня, Е. И. Извеков

цифровой техники.

и др., Биофизика 59 (6), 1151 (2014). .

БИОФИЗИКА том 65

№ 3

2020

ВЛИЯНИЕ СЛАБОГО ПОСТОЯННОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ

529

The Effect of Weak Static Magnetic Field Ranging from 0.01 μT

(a “Zero” Magnetic Field Level) to 100 μT on the Production

of Reactive Oxygen Species in Nonactivated Neutrophils

V.V. Novikov, E.V. Yablokova, I.A. Shaev, and E.E. Fesenko

Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

It was shown that after 40-min exposition of peritoneal neutrophils to a hypomagnetic field (at 0.01 μT, re-

sidual magnetic field) the fluorescence intensity of intracellular dichlorofluorescein significantly decreased

(by 25%). The effect of weak magnetic field persists while increasing static magnetic field up to 1 μT. This

effect disappears when the level of exposure increases further up to 2.5 μT and appears again in the range of

5 μT in a reduced form achieving a maximum effect at field amplitude of 7 μT. The equally pronounced and

inhibitory effect, the magnitude of which significantly decreases only at the amplitude of 30 μT, is observed

when the intensity of static magnetic field increases gradually (9.0, 15.0, 19.5 μT). Then, when static mag-

netic field is 45 μT in magnitude, the values of the fluorescence intensity of the products of oxidation of 2,7-

dichlorodihydrofluorescein do not really differ from a control. No effects of magnetic field in the range of

74 μT and 100 μT on the oxidation processes were observed either.

Keywords: hypomagnetic field, geomagnetic field, neutrophils, reactive oxygen species, fluorescence

БИОФИЗИКА том 65

№ 3

2020