БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 3, с. 530-533

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 57.03

УРАВНЕНИЕ АРРЕНИУСА В АНАЛИЗЕ МЕХАНИЗМА

ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ

Институт проблем химической физики РАН,

142432, Черноголовка Московской области, просп. Академика Семенова, 1

E-mail: neshev@icp.ac.ru

Поступила в редакцию 12.12.2019 г.

После доработки 12.12.2019 г.

Принята к публикации 13.03.2020 г.

Изучено влияние температуры на кинетику гемолиза эритроцитов под действием трет-бутилгид-

ропероксида и динитрозильного комплекса железа с тиосульфатными лигандами. В качестве оцен-

ки скорости гемолиза использовали величину, обратную времени достижения 50% гемолиза. Это

позволило представить полученные экспериментальные данные в виде линейных графиков Арре-

ниуса. Тангенс угла наклона для трет-бутилгидропероксида был выше в 2.4 раза. Это означает, что

гемолиз эритроцитов под действием трет-бутилгидропероксида является более термочувствитель-

ным и, возможно, протекает по другому химическому механизму. Гемолизу эритроцитов под дей-

ствием трет-бутилгидропероксида предшествовало концентрационнозависимое нарастание уров-

ня тиобарбитурат-реактивных продуктов в мембранах эритроцитов, что указывало на активацию

пероксидного окисления липидов. Данный эффект не наблюдался в случае динитрозильных ком-

плексов железа с тиосульфатными лигандами. Это подтверждает различие в механизмах гемолити-

ческого действия трет-бутилгидропероксида и динитрозильных комплексов железа и согласуется

с результатами анализа температурных зависимостей скорости гемолиза по Аррениусу.

Ключевые слова: эритроциты, химический гемолиз, уравнение Аррениуса.

DOI: 10.31857/S0006302920030126

Как известно, в основе многих сложных явле-

данного подхода для анализа механизма гемо-

лиза.

ний в биологических системах лежат химические

реакции. В связи с этим теоретическое описание

зависимости скорости химической реакции от

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

температуры, предложенное в конце XIX века Ар-

Получение эритроцитарной массы. В качестве

рениусом, стало использоваться в биофизике для

источника крови были использованы мыши ли-

анализа сложных процессов в биосистемах [1].

нии С 57 Bl/6f (возраст 3 месяца, масса 18—20 г),

Образование в мембране эритроцита разрыва

полученные из питомника ИПХФ РАН. Забор

или разрывов, достаточных по размеру для выхо-

крови проводили от предварительно наркотизи-

да в окружающий раствор гемоглобина, называют

рованной эфиром мыши посредством ее декапи-

гемолизом эритроцита. Причиной гемолиза мо-

тации. В качестве антикоагулянта использовали

жет быть физическое, химическое или биогенное

0.11 М раствор цитрата натрия. Кровь собирали в

воздействие на клетку. Предметом данного ис-

склянку, куда предварительно добавляли раствор

следования является химический гемолиз, кото-

цитрата натрия, соблюдая соотношение цит-

рый мы рассматриваем как макроскопическое

рат/кровь - 1 : 5.

следствие химических и биохимических процес-

Кровь центрифугировали в течение 7 мин при

сов, которые запускаются внешним химическим

1500 g. Плазму декантировали. Осадок эритроци-

эффектором.

тов осторожно ресуспендировали в изотониче-

Целью данной работы было исследовать влия-

ском растворе NaCl (0,85% NaCl, 5 мМ Na-фос-

ния температуры на скорость гемолиза в рамках

фатного буфера, pH 7.4). Центрифугирование

формализма Аррениуса и оценить возможности

повторяли троекратно. После каждого центрифу-

гирования супернатант декантировали, осадок

Сокращения: ТБК - тиобарбитуровая кислота, t-BuOOH -

трет-бутилгидропероксид, ТНКЖ

- динитрозильный

эритроцитов ресуспендировали в новой порции

комплекс железа с тиосульфатными лигандами.

изотонического раствора NaCl. Эритроцитарную

530

УРАВНЕНИЕ АРРЕНИУСА В АНАЛИЗЕ МЕХАНИЗМА

531

массу, полученную после последнего центрифу-

гирования, хранили в холодильнике при 4°C не

1.0

более 36 ч.

Гемолиз эритроцитов. В гемолитических экспе-

44 C

риментах использовали 0,2% (по объему) суспен-

40 C

зию эритроцитов в изотоническом растворе

32 C

NaCl. Эксперимент проводили при 37°С при не-

прерывном слабом помешивании. За ходом гемо-

0.5

лиза эритроцитов следили по изменению оптиче-

ской плотности суспензии при длине волны

700 нм. Указанная длина волны лежит за предела-

)

ми основной области электронного поглощения

гемоглобина, в связи с чем ослабление светового

потока практически полностью связано с рассея-

0.0

нием света на эритроцитах. Высокий уровень раз-

100

120

140

бавления суспензии позволяет радикально

t, мин

уменьшить влияние эффекта многократного

внутреннего отражения света на эритроцитах.

Рис. 1. Кинетика гемолиза эритроцитов под дей-

Это позволяет получать зависимость степени ге-

ствием t-BuOOH. Содержание эритроцитов

молиза от оптической плотности суспензии в

0.2 об. %; [t-BuOOH]₀ = 10^-4 M.

удовлетворительном линейном приближении [2,

3]. Степень гемолиза суспензии определяли из

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

соотношения:

γ =

где D₀ и D - оптиче-

В качестве гемолитических агентов использо-

вали известный инициатор пероксидного окис-

ские плотности контрольного и опытного образ-

ления липидов мембран трет-бутилгидроперок-

ца соответственно, D_Н2О^{- оптическая плотность}

сид (t-BuOOH) и биядерный динитрозильный

образца в условиях полного лизиса всех эритро-

комплекс железа с тиосульфатными лигандами

цитов дистиллированной водой. Во всех экспери-

(ТНКЖ), синтезированнный в ИПХФ РАН [5].

ментах оптическая плотность контрольного об-

На рис. 1 показаны кинетические кривые гемоли-

разца (D₀) составляла ~ 0.8, что соответствовало

за эритроцитов под действием t-BuOOH, полу-

содержанию клеток ~ 0.2% по объему. Экспери-

ченные при трех различных температурах. Прове-

ментальные значения, характеризующие измене-

дение эксперимента при температурах ниже 32°С

ние степени гемолиза во времени, аппроксими-

оказалось невозможным из-за резкого увеличе-

ровали в программе Origin сигмоидальной функ-

ния периода индукции гемолиза до предела гемо-

цией Больцмана. В качестве количественной

литической устойчивости контрольного образца.

характеристики активности эффектора гемолиза

Стрелками показано графическое определение

использовали время достижения 50%-й степени

величины t(γ₅₀), которой мы характеризовали ге-

гемолиза t(γ₅₀), которое определяли графически

молитическую активность эффектора гемолиза.

(рис. 1).

На рис. 2 показаны кинетические кривые гемоли-

за эритроцитов под действием ТНКЖ. В этом

Анализ продуктов перекисного окисления липи-

случае влияние температуры на кинетику гемоли-

дов. Пероксидное окисление липидов мембран

за было менее выраженным, и эксперимент уда-

эритроцитов характеризовали по уровню образо-

лось провести в более широком диапазоне темпе-

вания ТБК-реактивных продуктов (продуктов,

ратур.

реагирующих с тиобарбитуровой кислотой) по

методу, описанному в работе [4] с модификация-

Для построения графиков Аррениуса было не-

ми. К 2 мл суспензии эритроцитов добавляли 1 мл

обходимо оценить скорость гемолиза. Использу-

30%-го раствора трихлоруксусной кислоты. За-

емая нами характеристика t(γ₅₀) - это время в ми-

тем центрифугировали при 6000 g в течение

нутах от смешивания реагентов до достижения

15 мин. Отбирали по 2 мл супернатанта и перено-

50%-го гемолиза. Важно отметить, что этот про-

сили в стеклянные пробирки объемом 20 мл. В

межуток времени включает, не только видимый

каждую пробирку добавляли по 0.5 мл раствора

процесс гемолиза, но и предшествующий ему пе-

0.8% ТБК в 0.05 М NaOH. Пробирки инкубирова-

риод индукции. Таким образом, данная характе-

ли 30 мин на кипящей водяной бане. После инку-

ристика может служить оценкой длительности

бации образцы охлаждали проточной водопро-

протекания химических процессов внутри

водной водой и определяли оптическое поглоще-

клетки, приводящих к гемолизу. Соответственно

ние при длине волны 532 нм.

обратная ей величина, 1/t(γ₅₀), будет служить

БИОФИЗИКА том 65

№ 3

2020

532

СОКОЛОВА, НЕШЕВ

A₅₃₂

1.0

0.15

t-BuOOH

37 C

)

29 C

0.10

24 C

14 C

0.5

0.05

ТНКЖ

0.00

0.0

t, мин

C 104 M

Рис. 2. Кинетика гемолиза эритроцитов под действи-

Рис. 4. Образование ТБК-реактивных продуктов в

ем ТНКЖ. Содержание эритроцитов - 0.2 об. %;

мембранах эритроцитов под действием t-BuOOH и

[ТНКЖ]0 = 10^-4M.

ТНКЖ. Содержание эритроцитов - 1.6 об. %; время

инкубации - 20 мин; t = 37°C.

оценкой скорости этих процессов и может быть

использована для построения графиков Аррениу-

Как известно, тангенс угла наклона графика

са. На рис. 3 показаны графики Аррениуса для

Аррениуса характеризует величину энергии акти-

t-BuOOH и ТНКЖ, построенные на основе дан-

вации изучаемой химической реакции. В нашем

ных, представленных на рис. 1 и 2. Как видно из

случае эту характеристику можно с определенной

рис. 3, логарифмы характеристик 1/t(γ50) для

степенью условности назвать энергией актива-

ции гемолиза. При этом тангенс угла наклона для

каждой из гемолитических кривых для t-BuOOH

t-BuOOH в 2.4 раза выше, чем для ТНКЖ (рис. 3).

и ТНКЖ линейно зависели от обратной абсолют-

Это означает, что гемолиз эритроцитов под дей-

ной температуры. Тот факт, что данные гемоли-

ствием t-BuOOH является более термочувстви-

тических экспериментов удается представить в

тельным и, вероятно, протекает по другому хими-

указанных координатах, свидетельствует о том,

ческому механизму.

что гемолиз эритроцитов в обоих случаях имеет

Общеизвестным маркером пероксидного

химическую природу. При этом величина 1/t(γ₅₀)

окисления в мембране считается образование

адекватно характеризует скорость предгемолити-

ТБК-реактивных продуктов, главным из которых

ческого процесса в каждом случае.

является малоновый диальдегид. Анализ образо-

вания ТБК-реактивных продуктов в мембранах

эритроцитов под действием t-BuOOH и ТНКЖ

(рис. 4) показал характерное для t-BuOOH кон-

центрационнозависимое нарастание уровня

ТБК-реактивных продуктов. Это согласуется с

известными литературными данными, согласно

которым в основе гемолиза, инициируемого

ТНКЖ

t-BuOOH, лежит процесс пероксидного окисле-

ния липидов эритроцитарной мембраны, приво-

дящий к нарушению ее барьерных свойств [6, 7].

В то же время, как видно из рис. 4, в случае ТНКЖ

t-BuOOH

образование ТБК-реактивных продуктов в мем-

бране эритроцита не обнаружено. Это подтвер-

ждает различие в механизмах гемолитического

действия t-BuOOH и ТНКЖ, что согласуется с

предположением, высказанным выше на основе

3.2

3.3

3.4

3.5

анализа механизмов гемолиза по Аррениусу.

1/T 10³

Исследования показали, что источником ге-

Рис. 3. Взаимосвязь между скоростью гемолиза и об-

молитической активности сера-нитрозильных

ратной абсолютной температурой.

комплексов железа, к классу которых относится

БИОФИЗИКА том 65

№ 3

2020

УРАВНЕНИЕ АРРЕНИУСА В АНАЛИЗЕ МЕХАНИЗМА

533

ТНКЖ, является выделямый ими в среду оксид

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

азота, а непосредственным химическим индукто-

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

ром гемолиза выступает продукт биохимической

интересов.

трансформации оксида азота - пероксинитрит

[8]. Предполагается, что гемолитическое дей-

ствие данной группы доноров NO реализуется че-

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

рез известный для пероксинитрита механизм

Все применимые международные, националь-

окисления сульфгидрильных групп в белках [9].

ные и институциональные принципы ухода и ис-

Среди потенциальных внутриклеточных мише-

пользования животных при выполнении работы

ней пероксинитрита в эритроците обращает на

были соблюдены.

себя внимание сульфгидрильная группа цистеина

в активном центре Na⁺/K⁺-ATФазы, окислитель-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ная модификация которой под действием перок-

синитрита, приводящая к ингибированию фер-

1. Л. А. Блюмефельд, Проблемы биологической физики

мента, была ранее продемонстрирована in vitro

(Наука, М., 1977).

[10]. Последнее может приводить к нарушению

2. J. D. Young, L. G. Leong, M. A. DiNome, and

коллоидно-осмотического равновесия в эритро-

Z. A. Gohn, Anal. Biochem. 154 (2), 649 (1986).

ците и, следовательно, к гемолизу. Как известно,

3. A. Ilani and R. Granoth, Biochim. Biophys. Acta

процессы, связанные с работой ферментов харак-

(Biomembranes) 1027 (2), 199 (1990).

теризуются низкими энергиями активации в

4. J. Stocks and T. L. Dormandy, Br. J. Haematol. 20 (1),

сравнении с обычными химическими реакциями,

95(1971).

что согласуется с данными настоящей работы.

5. Н. А. Санина, О. А. Ракова, С. М. Алдошин и др.,

Таким образом, полученные результаты пока-

Координац. химия 27 (3), 198 (2001).

зывают эффективность предложенного нами

6. B. Deuticke, K. B. Heller, and C. W. Haest, Biochim.

подхода к анализу механизма химического гемо-

Biophys. Acta 899 (1), 113 (1987).

лиза эритроцитов на основе анализа температур-

7. B. Deuticke, K. B. Heller, and C. W. Haest, Biochim.

ных зависимостей с использованием уравнения

Biophys. Acta 854 (2), 169 (1986).

Аррениуса.

8. Н. И. Нешев, Б. Л. Психа, Е. М. Соколова и др.,

Изв. РАН. Сер. хим., № 12, 2160 (2010).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

9. R. Radi, J. S. Beckman, K. M. Bush, and B. A. Free-

Работа выполнена при финансовой поддержке

man., J. Biol. Chem. 266, 4244 (1991).

Государственного задания (Регистрационный №

10. P. Muriel, G. Castaneda, M. Ortega, and F. Noel, J.

0089-2019-0014).

Appl. Toxicol. 23 (4), 275 (2003).

Arrhenius Equation in Analysis of the Mechanism of Erythrocyte Hemolysis

E.M. Sokolova and N.I. Neshev

Institute of Problems of Chemical Physics, Russian Academy of Sciences,

prosp. Akademika Semenova 1, Chernogolovka, Moscow Region, 142432 Russia

The effect of temperature on the kinetics of erythrocyte hemolysis induced by tert-butyl hydroperoxide and

dinitrosyl iron complex with thiosulfate ligands was studied. The inverse of the time needed to achieve 50%

hemolysis was used as an estimate of the rate of hemolysis. This has afforded us an opportunity to present the

obtained experimental data in the form of linear graphs of Arrhenius. The slope for tert-butyl hydroperoxide

was 2.4 times higher. This means that erythrocyte hemolysis induced by tert-butyl hydroperoxide is more

thermosensitive and, probably, proceeds through a different chemical mechanism. The hemolysis of red

blood cells induced by tert-butyl hydroperoxide was preceded by a concentration-dependent increase in the

level of thiobarbiturates-reactive products in the erythrocyte membranes, indicating the activation of lipid

peroxidation. This effect was not observed in the case of dinitrosyl iron complexes with thiosulfate ligands.

This confirms the difference in the mechanisms of hemolytic action of tert-butyl hydroperoxide and dini-

trosyl iron complexes and is consistent with the results of the analysis of the temperature dependences of the

rate of hemolysis according to the Arrhenius equation.

Keywords: erythrocytes, chemical hemolysis, Arrhenius equation

БИОФИЗИКА том 65

№ 3

2020