БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 3, с. 552-556

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 53.0963:639.3

ФОРМИРОВАНИЕ МИКРОЧАСТИЦ ЛЬДА В ОВАРИАЛЬНОЙ

ЖИДКОСТИ И ГОМОГЕНАТЕ НЕОПЛОДОТВОРЕННЫХ ЯЙЦЕКЛЕТОК

РУССКОГО ОСЕТРА ПРИ ОХЛАЖДЕНИИ ДО -196С

*Южный научный центр РАН, 344006, Ростов-на-Дону, пр. Чехова, 41

**Астраханский государственный технический университет, 414056, Астрахань, ул. Татищева, 16

***Институт биофизики клетки ФИЦ ПНЦБИ РАН, 142290, Пущино Московской области, Институтская, 3

E-mail: firsovaangelina1991@mail.ru

Поступила в редакцию 07.10.2019 г.

После доработки 10.03.2020 г.

Принята к публикации 25.03.2020 г.

Проблема криоконсервации икры рыб и земноводных на сегодняшний день не решена. При глубо-

ком замораживании яйцеклеток рыб основным повреждающим фактором является образование

кристаллов льда внутри и вне клеток, а также разрастание этих кристаллов (рекристаллизация, пе-

рекристаллизация). Для предотвращения таких повреждений требуется разработка эффективных

криопротекторных сред. Присутствие в криозащитной среде дополнительных компонентов, сни-

жающих термомеханические напряжения и растрескивание замороженной среды, может увеличить

выживаемость ооцитов после процедуры замораживания-оттаивания. Представляется возможным

использовать в качестве таких добавок естественные компоненты икры и овариальной жидкости.

Целью исследований явилось изучение процесса формирования микрочастиц льда в тонком слое

(0.2 мм) овариальной жидкости и компонентов гомогената икры русского осетра при их охлажде-

нии до температуры жидкого азота (-196°C). При постепенном понижении температуры наблюда-

ли процесс замерзания, растрескивания льда и формирование микрочастиц. Форма и размер мик-

рочастиц зависели от состава замораживаемого раствора. Сделано предположение что некоторые

фракции гомогената икры могут быть использованы как компоненты криозащитной среды.

Ключевые слова: замораживание, растрескивание льда, микрочастицы, икра осетра.

DOI: 10.31857/S0006302920030151

Резкое сокращение популяций рыб как по-

меров объекта и т.д.) могут переходить в аморф-

верхностных континентальных вод, так и миро-

ное, полностью кристаллизованное и частично

вого океана требует принятия срочных мер для

кристаллизованное состояние (т.е. образовывать

сохранения генетического материала с использо-

аморфно-кристаллическую структуру). Зависи-

ванием методов криоконсервации. Технология

мость температуры замерзания водного раствора

криоконсервации спермы рыб в значительной

от концентрации растворенных веществ опреде-

степени отработана. Проблемой является крио-

ляется криоскопической константой 1.86°С/М

консервация ооцитов, которые сложно обратимо

[2]. В процессе кристаллизации воды концентра-

заморозить из-за крупного размера клеток, высо-

ция растворенных веществ в незамерзшей части

кого содержания желтка и низкой проницаемо-

раствора увеличивается. Процесс формирования

сти мембран для криозащитных соединений [1].

кристаллов льда и увеличение концентрации рас-

Необходим поиск новых подходов к созданию

твора продолжается по мере охлаждения вплоть

сред для консервации ооцитов. Один из таких

до тех пор, пока незамерзший раствор не достига-

возможных подходов - использование криоза-

ет пороговой степени вязкости, в результате чего

щитных сред с низким содержанием воды (на-

образуется аморфный (витрифицированный) лед

пример, растительного жира), чтобы уменьшить

[3]. Формирование льда при градуально повыша-

повреждения, вызываемые внеклеточными кри-

ющейся концентрации растворенных веществ в

сталлами льда.

охлаждаемой жидкости образует неоднородную

Вода и водные растворы при замораживании в

среду. Из-за разных коэффициентов температур-

зависимости от условий охлаждения (скорости

ного расширения/сжатия кристаллов льда и

охлаждения, объемной доли воды, формы и раз-

витрифицированных областей замороженного

552

ФОРМИРОВАНИЕ МИКРОЧАСТИЦ ЛЬДА

553

раствора возникают термомеханические напря-

ствует 4500 g. В результате оболочки икры оседа-

жения и растрескивание в замороженной среде

ли. Остальное содержимое икры распределялось

[4-7].

на три слоя. В процессе центрифугирования мо-

лекулы со схожей массой группируются друг с

Пpи отноcительно малыx напpяженияx на-

другом (фракционируются): наиболее тяжелые

блюдаютcя дефоpмации, пpопоpциональные ве-

оседают на дне и стенках сосуда; наиболее легкие

личине этиx напpяжений. Когда термомеханиче-

собираются на поверхности. Сахара, органиче-

ские напряжения cтановятcя чpезмеpными,

ские кислоты и соли остаются в растворе. По на-

возникает растрескивание замороженного мате-

шей оценке верхний слой состоял преимуще-

риала. Фоpмиpование pаcтpеcкиваний завиcит

ственно из содержимого жировых вакуолей, сред-

от физичеcкиx cвойcтв замоpаживаемого ма-

ний слой был образован цитозолем, а нижний

теpиала - элаcтичноcти и жеcткоcти [8].

слой - содержимым желточных вакуолей. Каж-

Кpиcталлы льда в замеpзшей cpеде xаpак-

дый слой изучали отдельно.

теpизуютcя выcокой жеcткоcтью, а амоpфный

лед, обpазовавшийcя из выcококонцентpиpован-

Для регистрации изменения температуры об-

ныx pаcтвоpов, - значительной элаcтичноcтью.

разца (термограммы), температуры замерзания и

формирования микрочастиц в процессе охлажде-

Увеличение элаcтичноcти матеpиала ведет к по-

ния смонтировали установку [19], состоящую из

нижению темпеpатуpы, пpи котоpой начинаетcя

микроскопа, пенопластового бокса, камеры Фук-

pаcтpеcкивание и cоответcтвенно фоpмиpование

микpочаcтиц льда [9].

са-Розенталя, электронного термометра, видео-

камеры (рис. 1).

Являясь крупными клетками (0.7-7.0 мм),

ооциты рыб могут получать значительные повре-

Образцы (10 мкл) вносили в кварцевую камеру

ждения как за счет внеклеточного и внутрикле-

Фукса-Розенталя, которую помещали в пено-

точного формирования кристаллов льда [10], так

пластовый бокс. Камеру охлаждали до -196°С

и за счет растрескивания замороженной среды и

сначала парами азота, а затем жидким азотом, ре-

формирования микрочастиц льда. Один из спо-

гулируя подачу жидкого азота в бокс. Температу-

собов снизить повреждения при растрескивании

ру измеряли с помощью электронного термомет-

криозащитной среды - повысить эластичность

ра АТТ-2004 с медь-константановой термопарой.

замороженного криозащитного раствора. Для

Скорость охлаждения составила около 10°С/мин.

этого используют добавки в криозащитную среду

Видеорегистрацию процесса замерзания осу-

яичного желтка [11], липосом [12-15], водорас-

ществляли при помощи видеокамеры (Alpha A57,

творимых высокомолекулярных органических

Sony, Япония), установленной на микроскопе

соединений [14-17], растительных жиров [18].

«Биолам» (ЛОМО, Россия)), объектив - 4×10,

Представляется возможным использовать в каче-

окуляр - ×7. Фоторегистрацию микрочастиц про-

стве таких добавок также естественные компо-

водили при температуре жидкого азота.

ненты икры и овариальной жидкости рыб.

При постепенном охлаждении образцов на-

В данной работе с целью поиска перспектив-

блюдали изменения состояния и фиксировали

ных криозащитных сред для консервации ооци-

температуры фазовых переходов на протяжении

тов нами изучены особенности замерзания ова-

всего процесса. После охлаждения до температу-

риальной жидкости и отдельных фракций гомо-

ры жидкого азота -196°С фотографировали мик-

гената икры русского осетра, а также

рочастицы, сформированные в ходе растрескива-

растительного жира при охлаждении до темпера-

ния замороженного материала (рис. 2).

туры -196°C.

Эксперименты были проведены в трех повтор-

ностях по каждому из пяти образцов. Cтатиcти-

чеcкую обpаботку пpоводили c помощью

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

пpогpаммы SigmaPlot

12. Pезультаты были

Материалом для исследований служили: ова-

пpедcтавлены в виде cpеднеаpифметичеcкого ±

риальная жидкость русского осетра, три различ-

± cтандаpтная ошибка cpеднего аpифметичеcко-

ные фракции гомогената неоплодотворенных яй-

го (М ± m).

цеклеток русского осетра и растительное масло

«Кубаночка» (подсолнечное нерафинированное

вымороженное холодного отжима, производи-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

тель ООО «Гранд-Стар», Краснодар, Россия).

Кристаллизация растительного масла. При

Для разделения внутреннего содержимого яй-

охлаждении жидкого растительного масла не на-

цеклеток икру подсушивали на фильтровальной

блюдали процессов образования микрочастиц

бумаге от овариальной жидкости, а затем расти-

вплоть до -80 ± 7°С (n = 3). При охлаждении до -

рали в ступке. Получившийся гомогенат центри-

196°С проба с растительным маслом изменилась

фугировали в течение 40 мин на центрифуге

дважды - при температуре ниже 0°С регистриро-

ЦЛН-2 (Россия) при 7000 об/мин, что соответ-

вали застывание; при температуре -80 ± 7°С

БИОФИЗИКА том 65

№ 3

2020

554

ПОНОМАРЕВА и др.

(а)

(б)

t, ºС

-50

-100

4×

-150

-200

Время, мин

Рис. 1. (а) - Блок-схема установки для замораживания образцов: 1 - объектив микроскопа, 2 - видеоокуляр микро-

скопа, 3 - видеокамера Sony Alpha A57, 4 - электронный термометр, 5 - камера Фукса-Розенталя, 6 - пенопластовый

бокс, 7 - регулируемая система подачи охлажденного и жидкого азота. (б) - Типичная температурная кривая процесса

охлаждения образца (дистиллированой воды).

(n = 3) - формирование микрочастиц. Микроча-

меров в процессе охлаждения до -196°С. Воз-

стицы имели продолговатую форму с округлыми

можная причина формирования микрочастиц -

краями. (рис. 2а) и не меняли своих форм и раз-

неоднородность состава жирных кислот в расти-

(а)

(б)

(в)

500 мкм

(г)

(д)

500 мкм

Рис. 2. Микрочастицы льда в замороженных образцах: (а) - растительный жир, (б) - средний слой отцентрифугиро-

ванного гомогената икры русского осетра, (в) - верхний слой отцентрифугированного гомогената икры, (г) - овари-

альная жидкость самки русского осетра, (д) - нижний слой отцентрифугированного гомогената икры. Фотографии

сделаны при -196°C.

БИОФИЗИКА том 65

№ 3

2020

ФОРМИРОВАНИЕ МИКРОЧАСТИЦ ЛЬДА

555

тельном жире [20]. Даже небольшая разница в

можных добавочных компонентов криозащит-

температурах замерзания отдельных компонен-

ных растворов.

тов формирует неоднородную замороженную

Второй и третий слой гомогената ооцитов в за-

среду, что при низких температурах приводит к

мороженном состоянии обладали сходными тер-

образованию округлых микрочастиц.

момеханическими свойствами и формировали

Кристаллизация овариальной жидкости. Овари-

регулярную структуру из микрочастиц льда.

альная жидкость, имеющая вид прозрачной или

Овариальная жидкость, очевидно, за счет бо-

полупрозрачной вязкой жидкости, по структур-

лее высокого содержания воды образовывала не-

но-механическим свойствам является коллоид-

однородные структуры. Наблюдаемая картина

ным раствором (сложным гидрозолем) белковых

кристаллизации в целом соответствовала картине

веществ с незначительными примесями неорга-

кристаллизации очищенной воды. Вероятно,

нических соединений [13]. В наших эксперимен-

белковые компоненты овариальной жидкости

тах овариальная жидкость замерзала при -5 ± 1°С

практически не повлияли на термомеханические

(n = 3), незначительно или совсем не отличаясь

свойства льда при охлаждении до сверхнизких

по этому параметру от очищенной воды. При тем-

температур.

пературе -70 ± 6°С (n = 3) регистрировали начало

Растительные масла (жиры) - продукты рас-

растрескивания массива льда. Окончательно

тительного происхождения, содержащие в основ-

сформированные микрочастицы при

-196°С

ном триглицериды жирных кислот [20]. Расти-

имели неоднородные формы и размеры (рис. 2б).

тельный жир из-за низкого содержания воды не

Кристаллизация трех фракций гомогената ооци-

претерпевал значительных растрескиваний, при

тов. Замерзание пробы верхнего слоя, по нашей

охлаждении формируя округлые микрочастицы

оценке состоящего из жировых вакуолей, реги-

из замороженных жирных кислот.

стрировали при -20 ± 4°С (n = 3). Растрескивание

Основываясь на полученных данных, с точки

наблюдали при температуре ниже -105 ± 7°С

зрения поиска новых эффективных сред для кон-

(n = 3). Микрочастицы, сформированные в ре-

сервации ооцитов, переспективным представля-

зультате растрескивания, имели различные фор-

ется использование в качестве добавок в криоза-

мы, в том числе округлые, без острых краев

щитную среду верхнего самого легкого компо-

(рис. 2в). Похожие по форме микрочастицы льда

нента гомогената ооцитов осетра. Данная

были получены при замораживании растворов

фракция, по нашим предположениям, состоит

криопротекторов - диметилсульфоксида, форма-

преимущественно из содержимого жировых ва-

мида, диметилформамида, этиленгликоля, гли-

куолей икры. По своим свойствам она сходна с

церина [9].

водными растворами, в составе которых присут-

Средний слой гомогената ооцитов застыл при

ствуют водорастворимые липиды или липосомы,

-5 ± 1°С (n = 3), растрескивание и начало форми-

для которых показан криозащитный эффект [14,

рования микрочастиц регистрировали при

15]. Присутствие этой фракции в растворе снижа-

-70 ± 8°С (n = 3). В отличие от верхнего слоя

ло температуру начала растрескивания и обеспе-

микрочастицы льда при -196°С имели прямо-

чивало морфологическую картину кристаллиза-

угольную форму (рис. 2г).

ции, сходную с картинами, наблюдаемыми при

замораживании растворов известных криопро-

Фазовый переход при охлаждении третьего,

текторов.

нижнего слоя гомогената ооцитов, регистрирова-

ли при -2 ± 1°С (n = 3), растрескивание пробы -

при -65 ± 5°С (n = 3). Микрочастицы льда при -

БЛАГОДАРНОСТИ

196°С имели прямоугольную форму (рис. 2д).

Работы выполнены с использованием Биоре-

Из всех изученных компонентов только верх-

сурсной коллекции редких и исчезающих видов

ний слой отцентрфугированного гомогената яй-

рыб Южного научного центра РАН № 73602.

цеклеток осетра, формировал лед, обладающий

повышенной эластичностью. На это указывают

низкая температура начала растрескивания мас-

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

сива льда (-105 ± 7°С (n = 3)) и образование

округлых микрочастиц. Вероятно, элаcтичноcть

Работа выполнена в рамках реализации ГЗ

замоpоженной cpеды значительно повышалаcь,

ЮНЦ РАН, № госрегистрации

01201354245

вcледcтвие присутствия в пробе компонентов жи-

(Апробация методики криоконсервации репро-

ровых вакуолей и за счет этого увеличения доли

дуктивных клеток), и при финансовой поддержке

амоpфного (наиболее элаcтичного) льда в общем

Российского фонда фундаментальных исследова-

объеме замоpоженной cpеды. Подобные структу-

ний в рамках научного проекта № 19-016-00208

ры, как ранее было показано нами, образует за-

(Изучение процессов образования микрочастиц

мороженный раствор таурина [19], одного из воз-

льда).

БИОФИЗИКА том 65

№ 3

2020

556

ПОНОМАРЕВА и др.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

8. Y. Rabin, P. S. Steif, K. C. Hess, et al., Cryobiology 53

(1), 75 (2006).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

9. Y. Rabin and P. S. Steif, in Advances in Biopreservation,

интересов.

Ed. by J. G. Baust and J. M. Baust (Taylor & Francis

Group, 2007), pp. 359-379.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

10. F. W. Kleinhans, J. F. Guenther, D. M. Roberts, and

P. Mazur, Cryobiology 52 (1), 128 (2006).

Настоящая работа не содержит описания ка-

11. L. Briand-Amirat, D. Tainturier, and M. Anton, in Bio-

ких-либо исследований с использованием людей

active Egg Compounds, Ed. by R. Huopalahti, R. Lуpez-

и животных в качестве объектов.

Fandiсo, M. Anton, and R. Schade (Springer-Verlag,

Berlin-Heidelberg, 2007), pр. 259-264.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

12. K. M. Wilhelm, J. K. Graham, and E. L. Squires,

Cryobiology 33, 320 (1996).

1. T. Zhang and D. M. Rawson, Cryobiology 55, 354,

13. L. He, J. L. Bailey, and M. M. Buhr, Biol. Reprod. 64

(2007),

(1), 69 (2001).

2. А. Г. Стромберг и Д. П. Семченко, Физическая

14. A. A. Andreev, D. G. Sadikova, C. Labbe, et al.,

химия (Высш. шк., М., 1999).

Biofizika 53 (4), 598 (2008).

3. D. E. Pegg, M. C. Wusteman, and S. Boylan, Cryobi-

15. A. A. Andreev, D. G. Sadikova, E. N. Gakhova, et al.,

ology 34 (2), 183 (1997).

Biophysics 54 (5), 612 (2009).

4. C. Kroener, B. J. Luyet, Biodynamica 10 (201), 47

16. D. A. Balentine, S. A. Wiseman, and L. C. M. Bou-

(1966).

wens, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 37, 693 (1997).

5. Y. Rabin and P. S. Steif, ASME J. Appl. Mech. 65 (2),

17. U. Rauen and H. de Groot, Cryobiology 56, 88 (2008).

328 (1998).

18. А. М. Тихомиров, Патент РФ №2010142589/13

6. Y. Rabin and P. S. Steif, in Advances in Heat and Mass

(2010).

Transfer in Biotechnology, Abstr. Book of Int. Mechan.

19. А. А. Андpеев, Д. Г. Cадикова, Н. А. Ивличева и

Engineer. Congr. and Exposition (Nashville, TN, HTD,

А. В. Борода, Биофизика 62 (2), 213 (2017).

1999), pp. 183-188.

20. Химический состав пищевых продуктов, под ред.

7. Y. Rabin and P. S. Steif, Int. J. Solids Struct. 37, 2363

И. М. Скурихина и М. Н. Волгарева, кн. I., 2-е

(2000).

изд., перераб. и доп. (Агропромиздат, М., 1987).

Formation of Ice Microparticles in Ovarian Fluid and Homogenate of Unfertilized Eggs

of Russian Sturgeon during Cooling to -196C

E.N. Ponomareva*, A.V. Firsova*, A.M. Tikhomirov**, and A.A. Andreev***

*Southern Scientific Center, Russian Academy of Sciences, prosp. Chekhova 41, Rostov-on-Don, 344006 Russia

**Astrakhan State Technical University, ul. Tatishcheva 16, Astrakhan, 414056 Russia

***Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region,142290 Russia

There are a variety of approaches to increasing cryopreservation efficiency of fish and amphibian eggs, al-

though some hurdles still remain to be overcome. During deep freezing of fish eggs, the main detrimental fac-

tor is the formation of ice crystals inside and outside the cells, as well as the growth of these crystals (recrys-

tallization, repeated recrystallization). To avoid injury from freezing, there is a need for the development of

effective cryoprotective media. The presence of additional components in the cryoprotective media that re-

duce thermomechanical stresses and cracks of the frozen tissues might increase survival of oocytes after freez-

ing-thawing. It is probable that natural components of caviar and ovarian fluid may act as such additives. The

aim of the research was to study the process of the formation of ice microparticles in a thin layer (0.2 mm) of

ovarian liquid and components of the homogenate of Russian sturgeon caviar when they were cooled to the

temperature of liquid nitrogen (-196°C). With a gradual decrease in temperature, the processes of freezing,

cracking of ice and the formation of microparticles were observed. The shape and size of the microparticles

depended on the composition of the frozen solution. Therefore, we assume that some fraction of the homog-

enate of caviar can be used as a component of cryoprotective medium.

Keywords: freezing, cracking ice, microparticles, sturgeon eggs

БИОФИЗИКА том 65

№ 3

2020