БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 4, с. 691-704

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 577.1

РАДИКАЛЫ В СТРУКТУРАХ КЛЕТКИ

Е.В. Швецова*, Ж.Т. Абдрасулова*

*Казахский национальный университет им. аль-Фараби,

050040, Алматы, просп. аль-Фараби, 71, Республика Казахстан

**Государственный университет «Дубна», 141982, Дубна Московской области, ул. Университетская, 19

E-mail: yu.shapovalov@mail.ru

Поступила в редакцию 05.12.2019 г.

После доработки 18.02.2020 г.

Принята к публикации 25.05.2020 г.

Рассмотрено участие природных радикалов в одноэлектронных процессах жизнедеятельности кле-

ток. Показано, что коферменты, имея промежуточные свободно-радикальные хиноидные и семи-

хиноидные формы, могут взаимодействовать с каротиноидами, образуя комплексы с переносом за-

ряда с полосой поглощения 1030 нм. При этом комплекс может выполнять активную светособира-

ющую функцию при фотосинтезе вплоть до 1100 нм с передачей энергии от хлорофиллов a и b на

комплекс. Исследования сорбции фермент-кофакторной системы «алкогольдегидрогеназа-нико-

тинамидадениндинуклеотид» на гидрофобном электропроводном носителе показали, что макси-

мальная активность фермент-кофакторной системы проявляется при последовательной сорбции

кофермента, а затем апофермента. Важную роль играет ориентация биокаталитической системы на

матрице иммобилизации.

Ключевые слова: радикалы, коферменты, каротиноиды, комплекс с переносом заряда, сорбция,

иммобилизация.

DOI: 10.31857/S0006302920040092

нения антиоксидантной защиты для нейтрализа-

Известно, что к радикалам относят атомы или

ции радикалов. Роль антиоксидантной защиты

молекулы, имеющие неспаренный электрон, ко-

выполняют биокатализаторы: супероксиддисму-

торый определяет их высокую нестабильность и

таза, каталаза, глутатионзависимая пероксидаза,

активность, связанную со стремлением радика-

трансфераза, которые понижают негативное воз-

лов захватить или отдать лишний электрон. В

действие радикалов путем удаления перекисных

биологических объектах различают природные и

соединений. В настоящее время выделено боль-

чужеродные радикалы. Известно, что чужерод-

шое число фенольных соединений, которые об-

ные радикалы на основе кислорода образуются в

ладают антиоксидантными свойствами, напри-

результате физического или химического воздей-

мер, витамины Е (α-токоферол), К₁ (филлохи-

ствия на клетки живых организмов. Радикалы по-

вреждают аминокислоты и белки, дезорганизуют

нон) и К₂ (менахинон), убихиноны, триптофан,

клеточные структуры и биологические мембра-

фенилаланин, а также значительное количество

ны. Доказана роль чужеродных свободных ради-

растительных и животных пигментов: каротино-

калов в развитии таких болезней, как рак, атеро-

иды, флавоноиды, фенолкарбоксильные кислоты

склероз, инфаркт миокарда, инсульт, ишемия;

[3]. Механизм антиоксидантной защиты сводит-

заболеваний нервной и иммунной систем, лег-

ся к их взаимодействию со свободными радика-

ких, печени, почек, крови, кожи; также они вы-

лами и превращению последних в неактивные

зывают преждевременное старение [1, 2].

молекулы, обеспечивая таким образом обрыв це-

пи свободнорадикального окисления.

Для снижения агрессивного влияния радика-

В отличие от чужеродных радикалов, в живых

лов на организм человека и животных в биологи-

системах преобладают природные радикалы [4],

ческих объектах имеются специализированные

которые образуются в результате ферментатив-

ферментные системы, а также природные биоор-

ных реакций и выполняют ключевую роль в про-

ганические соединения и синтетические соеди-

цессах жизнедеятельности клеток: в реакциях

Сокращения: ADH

- алкогольдегидрогеназа, LDH

биосинтеза, окислительного фосфорилирования,

лактатдегидрогеназа.

регуляции липидного обмена, процессах митоза,

691

692

ШАПОВАЛОВ и др.

метаболизма и др. Ежесуточно каждая клетка ге-

Важнейшая роль в транспорте окислительно-

нерирует миллионы соединений, обладающих

восстановительных эквивалентов в мембранах

естественной радикальной природой, которые

митохондрии и хлоропластах отводится мобиль-

участвуют в жизненно важных одноэлектронных

ному небелковому переносчику - убихинону (ко-

биохимических процессах, связанных с отдачей

ферменту Q₆ и Q₁₀). Убихинон (CoQ) имеет

или приобретением электронов. Существенную

структуру хинона, он широко распространен в

роль в радикальных окислительно-восстанови-

митохондриальной мембране. Известно, что же-

тельных реакциях клетки выполняют кофермен-

лезо-серные центры биокатализаторов передают

ты NAD, NADP, FAD, FMN, CoQ и др., которые

электроны коферменту Q. В процессе восстанов-

являются акцепторами электронов для одной

ления кофермент Q изменяет свою химическую

группы ферментов в полиферментном комплексе

структуру через форму свободного радикала - се-

и донорами для другой. Коферменты способны

михинона [6]. Принимая при этом один элек-

образовывать промежуточные радикальные

трон, убихинон приобретает радикальную форму

структуры и комплексы с переносом заряда в био-

коэнзима Q, образуя полувосстановленную фор-

логических мембранах, обеспечивая перенос

му - убисемихинон-радикал. Второй электрон

энергии и транспорт электронов. При этом вос-

переводит этот радикал в полностью восстанов-

становление и окисление метаболитов сопровож-

ленный гидрохинон.

дается циклической ферментативной регенера-

На основании вышеизложенного можно за-

цией коферментов. Основными из ряда перенос-

ключить, что коферменты в клетках образуют вы-

чиков redox-эквивалентов

(протонов

сокоактивные промежуточные свободные ради-

электронов) в клетках являются коферменты

калы в виде хиноидов и семихинонов, которые

NAD, NADP, FAD, FMN, CoQ. Установлено, что

участвуют в ферментативных окислительно-вос-

в молекулах NAD и NADP в каталитическом акте

становительных реакциях. Приобретая электрон

участвует никотинамидный нуклеотид. Во мно-

и протон от субстрата, кофермент восстановлива-

гих биохимических redox-реакциях никотина-

ется и, обратно, при отдаче электрона и протона

мидный нуклеотид NAD и NADP восстанавлива-

наблюдается его окисление. Перенос энергии и

ется либо окисляется с присоединением или от-

электронов в фермент-кофакторный комплекс

дачей электронов и протонов. Реакция протекает

возможен через систему образования комплексов

через две одноэлектронные стадии, образуя про-

с переносом заряда.

межуточный свободный радикал NAD·.

В работе рассматриваются вопросы о роли при-

Коферменты FAD, FMN, а также их предше-

родных радикалов коферментов в окислительно-

восстановительных биокаталитических реакциях и

ственник рибофлавин (витамин В₂) имеют

в процессах, связанных с переносом энергии и

изоаллоксазиновую гетероциклическию систему,

электронов в активный центр окисидоредуктаз с

участвующую в окислительно-восстановитель-

участием липидо-каротиноидной структуры клет-

ных ферментативных процессах. Восстановление

ки. Приводятся данные по ориентации оксидоре-

изоаллоксазинового кольца протекает в две ста-

дуктаз: алкогольдегидрогеназы (ADH) и лактатде-

дии. На первой в результате переноса электрона

гидрогеназы (LDH) на электропроводном обрат-

образуется свободный радикал семихинон, кото-

нофазовом сорбенте, моделирующим гидро-

рый затем присоединяет второй электрон, пере-

фобный монослой биологической мембраны.

ходя в восстановленную форму кофермента.

Отличительным признаком FAD по отноше-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

нию к FMN является наличие дополнительной

В экспериментальной работе использовали

гетероциклической системы - аденина, присо-

фермент алкогольдегидрогеназу (КФ 1.1.1.1) из

единенного к изоаллоксазиновому нуклеотиду

печени лошади, коферменты - динатриевую соль

гибкой пирофосфатной цепью. Исследования

восстановленного никотинамидадениндинук-

флюоресценции FAD показали, что в водных рас-

леотида (NADН-Na₂) 80%-й чистоты с молеку-

творах изоаллоксазиновый и адениновый нук-

леотиды кофермента располагаются параллельно

лярной массой 709,43 и окисленный никотина-

друг другу, вследствие чего наблюдается сильное

мидадениндинуклеотид (NAD⁺) 85%-й чистоты с

тушение флюоресценции кофермента. Это стало

молекулярной массой 663,45 (Merck, США). До-

основанием для предположения об образовании

полнительную очистку ADH и кофермента NAD

комплексов с переносом заряда между аденино-

осуществляли, используя карбоксиметил- и

вым и изоаллоксазиновым нуклеотидами [5]. Су-

ДЭАЭ-целлюлозу, а также сефадексы G-10 и

ществование комплексов с переносом заряда в

G-200 (Pharmacia, Швеция). Также в работе ис-

FAD объясняют гидрофобным взаимодействием

пользовали β-каротин; кардиолипин и ликопин

нуклеотидов и их параллельным расположением

(Sigma, США). Для получения обратнофазового

в молекуле.

сорбента применяли линолевую, линоленовую и

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

РАДИКАЛЫ В СТРУКТУРАХ КЛЕТКИ

693

олеиновую кислоты, глицерин, трех- и пятихлор-

тельно отмывали водой и высушивали. Окислен-

истый фосфор, хлористый тионил, N,N-диме-

ный уголь активировали треххлористым фосфо-

тилформамид, пиридин, одно- и двухзамещен-

ром при 20°С в течение 5-6 ч при периодическом

ный фосфат натрия, хлорид натрия, этанол, лак-

перемешивании, а затем отмывали обезвожен-

тальдегид,

хлороформ,

четыреххлористый

ным четыреххлористым углеродом или хлоро-

углерод, бикарбонат натрия, азотную и серную

формом.

кислоты, гидрат окиси натрия. Все реактивы -

Связывание глицерина осуществляли по следу-

производства компании «Химмед» (Россия), име-

ющей методике. К 10 г активированного сорбента

ли квалификацию «х.ч.».

приливали смесь обезвоженного глицерина

Количество фермента и кофермента определя-

(1 мл), N,N-диметилформамида (2 мл), хлорофо-

ли на спектрофотометре СФ-56 («ЛОМО», Рос-

ма (15 мл) и пиридина (5 мл). Смесь перемешива-

сия). При препаративной очистке использовали

ли при 20°С в течение 2 ч. Раствор сливали, а но-

жидкостной хроматограф Agilent 1260 Infinity Pre-

ситель последовательно промывали на фильтре

parative Scale (Agilent, США). Удельную поверх-

Шотта хлороформом, серным эфиром, 0.5 н сер-

ность сорбентов определяли, используя Surfer

ной кислотой, 5%-м раствором бикарбоната на-

Gas Adsorption Porosimeter (Thermo Scientific,

трия и дистиллированной водой, затем высуши-

Италия). Экспериментальные исследования об-

вали.

разования комплекса с переносом заряда между

Получение хлорангидридов жирных кислот. В

β-каротином и кардиолипином или лецитином

трехгорлую колбу емкостью 100 мл с обратным

осуществляли спектрофотометрическим методом

холодильником приливали 10 мл охлажденной

на спектрофотометре Specord 200 Plus (Analytik

смеси олеиновой и линолевой кислот (1 : 1.25). В

Jena, Germany), формирование мицелл или липо-

эту смесь по каплям в течение 3 ч при перемеши-

сом проводили с помощью ультразвукового гомо-

вании добавляли 22 мл свежеперегнанного тио-

генизатора Sonopuls HD 2070 (Bandelin, Герма-

нилхлорида, охлаждая реакционную смесь холод-

ния). В электрохимических исследованиях ис-

ной проточной водой. По завершении реакции

пользовали потенциостат-гальваностат Р-20Х

избыток тионилхлорида отгоняли при 75-80°С, а

(«Electrochemical Instruments», Черноголовка

продукт очищали перегонкой при 136°С и давле-

Московской области). Буферные растворы и сме-

нии 1.5-2.0 мм рт. ст.

си прокачивали через проточные спектрофото-

Связывание хлорангидридов жирных кислот с

метрические и электрохмические ячейки пери-

модифицированными носителями. В круглодонную

стальтическими насосами Zalimp-305 и Unipan-

колбу помещали 5 мл хлорангидридов жирных

304 (Польша). Очистку и выделение ферментов и

кислот и 45 мл хлороформа, не содержащего во-

кофементов проводили на центрифуге К-24

ды, затем добавляли 20 г углеродного сорбента с

(MLW, Германия).

«пришитым» глицерином, после чего раствор с

Получение обратнофазового сорбента. Размель-

сорбентом перемешивали в течение 2 ч при ком-

ченный спектральный уголь фракционировали,

натной температуре. Выделяющийся в процессе

используя лабораторные сита. Фракцию с разме-

реакции газообразный хлористый водород удаля-

рами частиц 0.2-0.3 мм обрабатывали концен-

ли, используя водоструйный насос; растворитель

трированной азотной кислотой в колбе с обрат-

отделяли на фильтре Шотта, а сорбент промыва-

ным холодильником. Окисление проводили при

ли хлороформом в аппарате Сокслета. Контроль

температуре кипения кислоты в течение 6 ч с по-

за степенью отмывки обратнофазового сорбента

стоянным перемешиванием. Затем сорбент отде-

осуществляли спектрофотометрически в интер-

ляли от раствора и многократно промывали ди-

вале длин волн 200-350 нм. Носитель отмывали

стиллированной водой до отсутствия кислой ре-

дистиллированной водой, высушивали и исполь-

акции. Отмытый носитель высушивали при

зовали для исследований сорбции кофермента

120°С. Полученный карбоксилированный уголь

НАД и фермента ADH.

включал поликарбоновые кислоты, в частности

Сорбция кофермента NAD и апофермента алко-

меллитовую кислоту, прочно удерживаемую сор-

гольдегидрогеназы. Сорбцию очищенных апофер-

бентом в водных растворах при рН 1.0-8.0. Для

мента и кофермента изучали в термостатируемых

получения углеродного носителя, не содержаще-

ячейках при 25.0 ± 0.2°С при постоянном переме-

го сорбированных поликарбоновых кислот, обра-

шивании магнитной мешалкой со скоростью

ботанный уголь экстрагировали 96%-м этиловым

600 об/мин. Величина навески носителя (на абсо-

спиртом в аппарате Сокслета. Контроль за степе-

лютно сухой вес) была равна 0.1000 г, пределы ис-

нью отмывки носителя осуществляли спектрофо-

ходных концентраций белка и кофермента соста-

тометрически в интервале длин волн 200-350 нм.

Сорбент фильтровали и промывали дистиллиро-

вили 2.4 · 10^-6-7.3 · 10^-6 М и 4.5·10^-5-5.6 · 10^-4 М

ванной водой с последующей обработкой 0.1 н

соответственно. Для каждого опыта брали по 5 мл

раствора гидроокиси натрия при температуре

исследуемых растворов, пробы на анализ отбира-

96°С в течение 1 ч. Полученный носитель тща-

ли в течение 1-2 с, а их объем как правило не пре-

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

694

ШАПОВАЛОВ и др.

3.0

мобилизации NAD необходимо было экспери-

ментально изучить кинетику сорбции, обрати-

мость сорбционных процессов и, наконец, опре-

делить оптимальные условия осуществления

иммобилизации.

2.0

Сорбция кофермента NAD на обратнофазовом

углеродном сорбенте. Результаты кинетических

исследований сорбции окисленной формы

NAD⁺ на гидрофобонизированном угле при ин-

1.0

тенсивном перемешивании показали, что сорб-

ция завершается практически в течение 60 мин.

Полученные изохроны сорбции свидетельствова-

ли о необратимом характере сорбции NAD⁺на

0.0

гидрофобонизированном угле. Обратные ветви

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

изохрон указывали на прочную иммобилизацию

С, мг/мл

кофермента и невозможность снятия его с сор-

бента раствором, в котором осуществляли сорб-

Рис. 1. Изохрона сорбции ADH на гидрофобонизиро-

ванном угле: 1 - сорбционная ветвь, 2 - десорбцион-

цию кофермента. Попытки десорбировать иммо-

ная ветвь. Условия эксперимента: навеска 0.1 г, кон-

билизованный NAD даже 4 М раствором хлори-

центрация буферного раствора 0.015 М, объем 5.1 мл,

стого натрия, а также при изменении рН раствора

скорость перемешивания 600 об/мин, температура

в диапазоне 5.0-9.0 не приводили к заметной де-

25°С.

сорбции кофермента, что указывало на гидро-

фобное взаимодействие кофермента на поверх-

ности углеродного модифицированного носите-

вышал 10% от начального объема раствора. Кон-

центрацию ADH определяли флуоресцентным

ля. Результаты проведенных исследований

методом при λ = 310 нм, затем пробы возвращали

показали необратимый характер сорбции NAD на

гидрофобном носителе, которую нельзя рассмат-

обратно в ячейку. Концентрации окисленной и

ривать с позиции равновесных представлений.

восстановленной форм NAD определяли при

λ = 260 и 340 нм соответственно. Анализ осу-

Сорбция апофермента ADH на обратнофазовом

ществляли в кварцевой кювете объемом 0.5 мл.

сорбенте. Аналогичные исследования сорбции

До проведения анализа проверяли соблюдение

были проведены для зависимого от кофермента

линейной зависимости флуоресценции, а также

NAD апофермента ADH. Сорбционная иммоби-

оптической плотности растворов NAD от кон-

лизация ADH на гидрофобной матрице осу-

центрации в области рабочих концентраций. Ко-

ществлялась за счет водородного, гидрофобного

личество сорбированного белка и кофермента

и электростатического взаимодействия. При этом

определяли по разности исходного и оставшегося

не исключалась возможность многоточечного

к моменту отбора пробы количества сорбата в

ориентированного контакта белковой глобулы с

растворе. Каждая точка на кривой являлась сред-

поверхностью матрицы сорбента. Для определе-

ним результатом трех-четырех экспериментов.

ния параметров иммобилизации ADH изучали

кинетику сорбции фермента. Результаты сорбции

фермента на гидрофобонизированном угле пока-

РЕЗУЛЬТАТЫ

зали, что процесс сорбции протекает от одного до

Иммобилизация фермент-кофакторного ком-

двух часов, не достигая равновесия. На неравно-

плекса ADH-NAD на модифицированных электро-

весный характер сорбции белка ADH на гидрофо-

проводных углеродных носителях. Для иммобили-

бонизированном угле указывало также несовпа-

зации фермент-кофакторной системы ADH-

дение сорбционных и десорбционных ветвей изо-

NAD был применен метод сорбционного связы-

хроны (рис. 1). Сорбция белков на сорбентах

вания на угле с привитыми углеводородными це-

зависит от рН раствора, свойств ионогенных

пями, моделирующими липидный монослой.

групп ионита, ионной силы используемого фоно-

Принимая во внимание предложенный метод им-

вого раствора. В качестве буферных растворов

мобилизации, который заключался в последова-

при изучении влияния рН среды на сорбцию

тельной сорбции кофермента и апофермента,

ADH мы использовали 0.015 М фосфатный бу-

проводили исследования сорбции каждого ком-

ферный раствор с рН 6.0-8.4 и 0.015 М карбонат-

понента ферментативной системы в отдельности.

ный буфер с рН 8.0-10.0. Выбор диапазона рН

Образование фермент-кофакторного комплекса

фонового раствора при исследовании сорбции

осуществляли по принципу «самосборки» из от-

АА-изоформы ADH определялся устойчивостью

дельных компонентов ферментативной системы.

фермента в этой области рН и проявляемой им

Для проведения исследований сорбционной им-

максимальной ферментативной активности. Из-

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

РАДИКАЛЫ В СТРУКТУРАХ КЛЕТКИ

695

вестно [7], что ниже рН 5.9 фермент инактивиру-

K, мг/г

ется, а наибольшую активность АА-изоформа

ADH проявляет при рН 10.0 [8]. Для гидрофобо-

2.0

низированного угля в этом диапазоне рН не отме-

чалось какого-либо изменения сорбции, что

можно объяснить гидрофобной природой связы-

вания фермента с носителем (рис. 2). Другим

фактором, подтверждающим наличие многото-

1.0

чечных гидрофобных связей, является то, что при

попытке десорбировать иммобилизованную

ADH водными растворами сорбированный

белок не удалось обнаружить в растворе, тогда

0.0

как 50%-й раствор этанола легко и практически

полностью десорбировал фермент. Сорбцию

ADH проводили из 0.015 М фосфатного буферно-

Рис. 2. Зависимость коэффициентов распределения

го раствора с рН 7.8 при перемешивании в тече-

ADH между гидрофобным углем и буферным

ние 2 ч при концентрации ADH от 1.35 · 10^-7 до

раствором от рН.

1.08 · 10^-6М растворов. Количество сорбирован-

ного апофермента находилось в пределах 1.0-

личество сорбированного кофермента и фермен-

3.0 мг/г. Каталитическая активность фермента-

та составляло 1.1 мг/г и 6.42 мг/г (массовое соот-

тивной системы оставалась практически неиз-

ношение 1 : 6) соответственно, а удельная актив-

менной при комнатной температуре в течение

ность полученной системы - 0.012 Е/г. Для

180 ч.

полученного массового соотношения возникает

Следует отметить, что при сорбции ADH на уг-

вопрос о структуре молекулярного комплекса

леродных сорбентах, как и в случае кофермента

ADH-NAD. Известно, что в комплексе на одну

существенную роль играют гидрофобные взаимо-

молекулу ADH, содержащую два активных цен-

действия. Об этом свидетельствует прочное удер-

тра, приходится две молекулы кофермента NAD.

живание фермента при высоких концентрациях

Из полученных экспериментальных данных мож-

хлористого натрия (вплоть до 2 М) в фосфатном

но рассчитать, что количество сорбированного

буферном растворе, а также результаты десорб-

кофермента на порядок больше его количества,

ции фермента спиртом. С увеличением концен-

необходимого для образования комплекса. При

трации спирта до 50% десорбция фермента в ре-

последовательной сорбции NAD, а затем ADH

зультате разрушения гидрофобных связей растет.

происходит перераспределение кофермента меж-

Дальнейшее увеличение концентрации спирта

ду сорбентом и активными центрами биокатали-

ведет к уменьшению десорбции, что, по-видимо-

затора. В связи с последним часть молекул кофер-

му, связано с противодействующим влиянием

мента NAD оказывается в активном центре фер-

высаливающего эффекта. Значительная денату-

мента, тогда как другая была сорбирована

рация иммобилизованной ADH наблюдается при

носителем. Таким образом, массовое соотноше-

концентрации спирта выше 70%.

ние не имеет прямого отношения к составу ком-

плекса.

Формирование биокаталитического комплекса

ADH-NAD на углеродном электропроводном носи-

При сорбции фермент-кофакторной системы

теле. Ввиду необратимости сорбционных процес-

в последовательности ADH-NAD количество

сов, следует ожидать влияния последовательно-

сорбированных кофермента и фермента соответ-

сти проведения сорбции компонентов на конеч-

ствовало 0.50 и 3.56 мг/г, удельная активность со-

ное состояние сорбционного комплекса системы

ставляла 0.0083 Е/г. Как видно из приведенных

и проявляемую им каталитическую активность.

данных, активность системы, полученной по пер-

Экспериментально было изучено влияние после-

вому способу, примерно в полтора раза выше, чем

довательности сорбции на гидрофобонизирован-

по второму.

ном угле ADH и NAD на активность иммобили-

зованной фермент-кофакторной системы. Сорб-

Повышенную активность систем, полученных

ция фермента и кофермента осуществлялась в

при сорбции в последовательности NAD-ADH,

идентичных условиях при рН 7.8 из 0.015 М фос-

нельзя однозначно объяснить стерическими осо-

фатного буфера. Фермент сорбировали из раство-

бенностями иммобилизованного фермент-ко-

ра с концентрацией 3 мг/мл, а кофермент NADН -

факторного комплекса, так как повышение ак-

0.79 мг/мл при соотношении сорбент : раствор,

тивности может быть связано с повышением кон-

равном 1 : 10. Было установлено, что при «сбор-

центрации кофермента и фермента на

ке» иммобилизованной фермент-кофакторной

поверхности носителя. Тем не менее из сообра-

системы в последовательности NADН-ADH ко-

жений стерического блокирования NAD в ката-

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

696

ШАПОВАЛОВ и др.

COOH

COCl

PCl₃

COCl

COO CH CHOH CH OH₂₂

+ HOCH₂

CHOH CH OH₂

HCl

COO CH CHOH CH OH₂₂

COO CH2 CH CH2OCO (CH2)n CH₃

+ 2Cl CO (CH )n CH₂₃

2HCl

OCO (CH )n CH₂₃

Рис. 3. Схема синтеза обратнофазового сорбента.

литической щели апофермента целесообразно

ние такого электропроводного гидрофобного

осуществлять сначала сорбцию кофермента, а за-

сорбента, моделирующего монослой биологиче-

тем фермента. Различия в количествах сорбиро-

ских мембран на углеродной матрице, приводит-

ваных фермента и кофермента при изменении

ся на рис. 3. Оптимальной считается ориентация

последовательности сорбции объясняются тем,

фермента на гидрофобном сорбенте, когда ко-

что при предварительной сорбции NAD происхо-

фермент блокирован носителем в каталитиче-

дит существенное изменение свойств поверхно-

ской щели апофермента, обеспечивая тем самым

сти сорбента, в частности, увеличивается ее отри-

эффективную регенерацию кофермента и высо-

цательный заряд, что при рН 7.8 < рI 8.7 означает

кую биокаталитическую активность иммобили-

усиление электростатического взаимодействия

зованной фермент-кофакторной системы.

положительно заряженного белка с сорбентом.

На примере ADH нами была рассмотрена по-

Подобная модификация сорбента низкомолеку-

луэмпирическая модель взаимодействия белко-

лярными органическими соединениями (хотя и

вой глобулы с электронейтральной гидрофобной

не ионного характера) широко используется на

поверхностью [9]. Ввиду того, что глобула фер-

практике для ориентированной иммобилизации

мента представляет собой сложную систему, рас-

ферментов, управляемой гидрофобными взаимо-

чет ее сорбционных характеристик с помощью

действиями. Уменьшение сорбции NADН после

метода атом-aтомных потенциалов представляет-

сорбции ADH, по-видимому, связано с блокиро-

ся нецелесообразным. Поэтому энергию взаимо-

ванием белком гидрофобной поверхности сор-

действия (F_sorb) ADH с обратнофазовым сорбен-

бента.

том рассчитывали по аддитивной схеме, исходя

Полученные результаты сорбции ADH и NAD

из экспериментальных данных по взаимодей-

на обратнофазовом углеродном носителе указы-

ствию аминокислот и пептидов с гидрофобным

вают на прочную необратимую сорбцию фер-

сорбентом [10], в соответствии с уравнениями 1

мент-кофакторного комплекса на матрице сор-

и 2:

бента за счет гидрофобного связывания. Катали-

тическая активность комплекса существенно

(1)

зависит от последовательности формирования

sorb

=

solv,

i=1

ферментативной системы. Наибольшую актив-

ность биокаталитический комплекс проявляет

Fsolv = FiΔLi/Li^,

(2)

при последовательной сорбции сначала кофер-

где Fsolv,i - энергия гидрофобного взаимодействия

мента, а затем апофермента.

i-го радикала; n - число радикалов; F_i - энергия

взаимодействия i-го аминокислотного радикала

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

при его полном погружении в гидрофобный слой

сорбента; ΔL_i -длина участка радикала, погру-

Исследование ориентации алкогольдегидрогена-

женного в гидрофобный слой при данной ориен-

зы и лактатдегидрогеназы на обратнофазовых сор-

тации глобулы белка; L_i - длина радикала.

бентах. Практический интерес представляет ори-

ентация глобулярных белков на обратнофазовых

При расчете энергии гидрофобного взаимо-

матрицах за счет сил гидрофобного взаимодей-

действия использовали значения относительных

ствия. В качестве носителей могут быть использо-

свободных энергий F/RT взаимодействия амино-

ваны электропроводные углеводородные сорбен-

кислотных радикалов с обратнофазовыми сор-

ты или их модифицированные формы. Получе-

бентами (таблица).

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

РАДИКАЛЫ В СТРУКТУРАХ КЛЕТКИ

697

Значения F/RT для аминокислотных радикалов [10]

Asp

Glu

Tyr

Ser

Met

Trp

Phe

0,173

-0,694

0,106

-0,449

-1,758

-1,085

Val

Leu

Ile

Gly

Ala

Pro

His

0,288

-0,485

0,040

-0,097

-0,197

-0,149

Lys

Arg

Gln

Asn

Cys

-0,554

-0,197

-0,108

0,090

Полученные в результате расчета данные

вием сохранения физиологической активности

представлены в виде перспективной азимуталь-

иммобилизованных биокаталитических систем,

ной ортографической проекции уровней взаимо-

включающих кофактор, является его нативное

действия белковой глобулы при различных на-

расположение в активном центре апоферментов.

правлениях касания с гидрофобной плоскостью

Представлялось интересным рассмотреть, как

(рис. 4).

другие NAD-зависимые дегидрогеназы, обладаю-

Из приведенных данных видно, что глобула

щие трехмерной гомологией с ADH, будут ориен-

ADH имеет четыре области наиболее вероятной

тироваться в липофильном слое биологической

гидрофобной атаки сорбционной плоскости. При

мембраны. Для решения поставленной задачи ис-

этом две из них находятся близко друг от друга на

пользовали лактатдегидрогеназу акулы, для кото-

экваторе глобулы (Δφ = 18) и лежат между двумя

рой известна пространственная структура [11, 12].

коферментными щелями фермента. Если гидро-

Молекула LDH состоит из четырех симметрич-

фобная поверхность представляет собой не плос-

ных субъединиц, каждая из которых имеет 331

кость, а цилиндрическую или сферическую пору

аминокислоту. В работе [12] координаты α-С-

с R ≈ 28.0 нм, то осуществляется одновременная

атомов аминокислот приводятся для стандартной

гидрофобная атака по этим двум основным на-

«красной» субъединицы. Координаты других

правлениям и их равнодействующая по направле-

субъединиц рассчитываются путем вращения

нию совпадает с осью «у». При этом в силу сим-

«красной» субъединицы вокруг осей P, Q, R. Ко-

метрии молекулы фермента обе коферментные

ординаты «голубой» субъединицы получали вра-

щели расположены строго симметрично отно-

щением «красной» субъединицы вокруг оси Р,

сительно направления наиболее вероятной гид-

«желтой» - вокруг оси Q и «зеленой» - вокруг

рофобной атаки. Доступность же субстратных

оси R. В связи с этим программа расчета энергии

щелей для этанола максимальна. Важным усло-

взаимодействия белковой глобулы с гидрофоб-

Рис. 4. Перспективная азимутальная ортографическая проекция уровней гидрофобности ADH: 1 - 5 < F/RT < 10, 2 -

10<F/RT < 20, 3 - 20 < F / RT < 30, 4 - F/RT > 30; «меридианы» и «параллели» проведены через 9° [9].

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

698

ШАПОВАЛОВ и др.

Рис. 5. Перспективная азимутальная ортографическая проекция уровней гидродрофобности поверхности LDH: 1 -

0 < F/RT < 1; 2 - 1 < F/RT < 2; 3 - F/RT > 2;, 4 - гидрофильная область.

ной поверхностью включала преобразование ко-

ление уровней энергии гидрофобного связыва-

ординат с установлением пространственного рас-

ния глобулы LDH на поверхности полусферы,

приведенной со стороны одного из полюсов мо-

положения 1324 α-С-атомов четырех субъединиц

лекулы белка. Из рисунка видно, что LDH на эк-

LDH. Результаты расчета ориентации LDH на

ваторе имеет два участка (полосы), где белковая

гидрофобной поверхности в виде перспективной

глобула проявляет гидрофильные свойства при

азимутальной ортографической проекции приве-

различных направлениях касания с гидрофобной

дены на рис. 5. На рис. 6 представлено распреде-

поверхностью. Четыре активных центра биоката-

лизатора находятся на двух противоположных

полюсах (по два на каждом) в области максималь-

ной энергии гидрофобного связывания, которые

на рис. 5 и 6 обозначены черным цветом. При

сорбции LDH на гидрофильных сорбентах моле-

кула апофермента будет сориентирована эквато-

ром к поверхности, обеспечивая свободный до-

ступ субстратов и коферментов к четырем актив-

ным центрам биокатализатора, расположенным

на полюсах молекулы фермента.

При сорбции LDH на гидрофобной поверхно-

сти будет наблюдаться связывание, при котором

один из полюсов с двумя активными центрами

будет сориентирован к гидрофобной поверхно-

сти, тогда как другой направлен в противополож-

ную от носителя сторону. Такой тип ориентиро-

ванной посадки молекулы белка в гидрофобном

слое мембраны обеспечивает блокирование NAD

в активном центре апофермента, сохраняя при

этом активность фермент-кофакторной системы.

Этот тип ориентации белков на гидрофобных

сорбентах в дальнейшем будет использован при

Рис. 6. Распределение уровней энергии гидрофобно-

иммобилизации фермент-кофакторных систем

го связывания LDH на поверхности полусферы.

на гидрофобных электропроводных носителях.

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

РАДИКАЛЫ В СТРУКТУРАХ КЛЕТКИ

699

Транспорт электронов и протонов в биологиче-

Представленные на этой схеме ферментативные

ских структурах с участием радикалов. Функцио-

реакции, протекающие в биологических мембра-

нирование коферментов в настоящее время еще

нах, возможны благодаря аналогии каталитиче-

полностью не изучено. Восстановление и окисле-

ских щелей апоферментов, а также подобию в

ние метаболитов сопровождается циклической

фиксации коферментов в активном центре и

ферментативной регенерацией. Общий ради-

строгой ориентации фермент-кофакторных ком-

кальный механизм биокаталитических процес-

плексов. Наибольшее сходство было обнаружено

сов, происходящих в полиферментном комплек-

се биологических мембран клетки и сопровожда-

для NAD-связывающих областей, что подтвер-

ющихся переносом redox-эквивалентов, можно

ждает аналогичность способов фиксации кофак-

представить в виде следующей схемы (схема 1).

тора в коферментсвязывающей щели.

Схема 1. Общий радикальный механизм биокаталитических процессов, происходящих в полиферментном комплексе

биологических мембран клетки. Е₁, Е₂…Еn и É₁, É₂…É_n - ферменты, участвующие в восстановлении и окислении суб-

стратов S₁,S₂…S_n и Ś₁Н, Ś₂Н…Ś_nН соответственно; ·СoQ^- и ·СoQ·Н^- - анион-радикал и убисемихинон радикала ко-

фермента Q, соответственно; РН₁, РН₂…РН_n и Ṕ

1, Ṕ2^…Ṕn - продукты ферментативных реакций.

Исследования аминокислотной последова-

тельности и пространственной структуры фер-

ментов: ADH печени человека и лошади, LDH

собаки и акулы, глицеральдегид-3-фосфатдегид-

рогеназы кальмара, свиньи и дрожжей привели к

выводу о существовании трехмерной гомологии

Схема 2. Последовательные радикальные реакции

NAD-зависимых дегидрогеназ [13, 14]. Представ-

при трансмембранном переносе протонов.

ленная схема 1 показывает, каким образом в клет-

Как видно из схемы 2, коэнзим Q восстанавли-

ке возможен радикальный механизм реализации

вается по одноэлектронному механизму, образуя

переноса протонов и электронов через биологи-

полувосстановленную форму - убисемихинон-

радикал.

ческие мембраны.

К группе переносчиков энергии и электронов,

Анион-радикал кофермента Q (·CоQ^-), лока-

широко распространенных в растительном и жи-

лизованного в жидкокристаллической структуре

вом мире, можно отнести природные

биомембраны, восстанавливается в результате

органические пигменты - каротиноиды, имею-

ферментативной реакции É₁до убисемихинон-

щие сопряженную систему связей. В настоящее

время известно более 800 видов структурно раз-

радикала (·СoQ·Н^-), присоединяя протон. Суб-

личающихся каротиноидов [15, 16]. По химиче-

страт S₁′H в матриксе митохондрии окисляется

скому строению каротиноиды делят на две груп-

при этом до Р₁′. Ферментативная регенерация ко-

пы: каротины (углеводороды) и ксантофиллы

(каротиноиды, содержащие кислород). Боль-

фермента ·CоQ^- происходит при миграции его к

шинство каротиноидов содержат 40 углеродных

другой биокаталитической системе E₁. При этом

атомов, имеют сопряженные двойные связи. Бла-

субстрат S₁, находящийся в межмембранном про-

годаря наличию ненасыщенных сопряженных

странстве, например, митохондрии, восстанавли-

(конъюгированных) связей каротиноиды имеют

вается до PН₁.

вытянутую светочувствительную «проволочную»

структуру, благодаря которой способны выпол-

Трансмембранный перенос протонов, сопро-

нять функцию переносчиков энергии и электро-

вождающийся ферментативной регенерацией ко-

нов. Каротиноиды встречаются как в свободном

фермента, может быть описан рядом последова-

состоянии, так и в виде гликозидов; они способ-

тельных радикальных реакций (схема 2):

ны нековалентно связываться с белками, кофак-

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

700

ШАПОВАЛОВ и др.

(а)

(б)

Рис. 7. Химические структуры β-каротина (a) и ликопина (б).

торами и мембранными липидами. Электроны

каротиноидов легко переходят в возбужденное

состояние при попадании даже небольшого коли-

чества квантов света. Ряд каротиноидов способен

Схема 3. Физический механизм антиоксидантного

образовывать комплексные соединения с такими

действия каротиноидов.

металлами, как Ca²⁺, Cu²⁺, Pb²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺ и

Химический механизм «тушения» предполага-

Hg²⁺ [17]. Образование металл-хелатного ком-

ет окисление каротиноидов синглетным кисло-

плекса не только изменяет спектр поглощения

родом с образованием различных альдегидов и

эндопероксидов [18, 19]. Образующиеся при этом

каротиноидов, но и повышает его способность к

продукты окисления каротиноидов могут играть

перехвату свободных радикалов.

важную роль в регуляции развития растений [20].

Каротиноиды в основном локализуются в ли-

Взаимодействие каротиноидов со свободными

пофильной области биологических мембран, об-

радикалами зависит главным образом от характе-

разуя стабильные каротинобелковые комплексы,

ра свободных радикалов, а не от типа каротинои-

они модулируют физические свойства мембран,

да [18]. Каротиноиды могут взаимодействовать со

расширяя диапазон фазового перехода из состоя-

свободными радикалами (·R) тремя способами,

ния геля в жидкокристаллическую структуру.

причем во всех трех случаях образуются радикалы

Длинные сопряженные углеводородные цепи ка-

каротиноидов [18]:

ротиноидов заканчиваются кольцевой иононо-

1. Взаимодействие с полиеновой структурой

вой структурой (рис. 7а), хотя возможно и отсут-

каротиноидов - ·R + Car → ·Car-R.

ствие гетероциклического кольца, как это можно

видеть у ликопина (рис. 7б). В связи с тем, что ка-

2. Реакция с отделением атома водорода -

ротиноиды содержат большое количество двой-

·RН + Car → ·Car-H + R.

ных связей, в клетках животных и человека они

3. Реакции, сопровождающиеся переносом

выполняют различные защитные функции: свя-

электронов -

зывают синглетный кислород, предупреждая об-

разование чужеродных свободных радикалов;

·R + Car → R^- + ·Car⁺,

обеспечивают защиту от жесткого электромаг-

·R + Car → R⁺ + ·Car^-.

нитного излучения. Понижая уровень свободных

Имея светочувствительную, электронопрово-

радикалов, каротиноиды выступают в роли анти-

дящую сопряженную структуру связей, кароти-

оксидантов. Способность к перехвату свободных

ноиды выполняют функцию переносчиков энер-

радикалов в молекуле каротиноидов возрастает с

гии и электронов. При этом они могут образовы-

увеличением числа компланарных (т.е. лежащих

вать комплексы с переносом заряда с

в одной плоскости) конъюгированных двойных

биоорганическими соединениями, имеющими

связей. Различают физический и химический ме-

свободно-радикальную форму хинона, напри-

ханизмы антиоксидантного действия каротинои-

мер, с коферментами FAD, FMN, имеющих в

дов. Физический механизм антиоксидантного

своем составе изоаллоксазиновое кольцо, кото-

действия предполагает «тушение» триплетного

рое при восстановлении образует радикал семи-

хлорофилла (3Chl*) или синглетного кислорода

хинона. Так, комплекс кофермента с иононовым

(¹О₂) за счет перехода каротиноидов (Car) в три-

кольцом каротиноида образуется при его контак-

плетное возбужденное состояние (3Car*) и даль-

те с изоаллоксазиновым нуклеотидом кофактора.

нейшего рассеивания энергии в виде тепла

Важную роль в транспорте окислительно-восста-

(схема 3) [18]:

новительных эквивалентов в биологической мем-

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

РАДИКАЛЫ В СТРУКТУРАХ КЛЕТКИ

701

бране отводится небелковому переносчику элек-

Эффективность электронного переноса через

тронов и протонов - коферменту Q, который так-

липидо-каротиноидную структуру существенно

же способен приобретать форму свободного

возрастет при воздействии на нее квантов света,

анион-радикала - семихинона (·CoQH^-). Фер-

что можно наблюдать в процессах фотосинтеза,

ментативная реакция с участием коферментов

протекающих в тилакоидах хлоропластов. Каро-

NAD, NADP протекает через две одноэлектрон-

тиноиды тилакоидных мембран участвуют в све-

ные стадии, в результате первой из них образуют-

товых реакциях фотосинтеза и обеспечивают

ся промежуточные свободные радикалы кофер-

структурную стабильность пигмент-белковых

ментов ·NAD или ·NADP, имеющие хиноидную

комплексов. Как известно, мембраны тилакои-

структуру в никотинамидном нуклеотиде.

дов содержат молекулы хлорофилла и каротинои-

дов, которые выполняют светособирающую

Одноэлектронный характер взаимодействия ка-

функцию, при этом каждая из этих молекул улав-

ротиноидов и их комплексов с хинонами в поляр-

ливает из солнечного спектра электромагнитные

ных средах описан в работах [21, 22]. Образование

волны определенной длины волн. Имеющаяся

катион-радикалов каротиноидов в реакции с хино-

система двойных связей выполняет функцию

нами показало, что на первой стадии образуется

хромофора и характеризует спектральные свой-

комплекс с переносом заряда, а затем ион-ради-

ства конкретных каротиноидов, которые имеют

кальная пара [·Car⁺ + ·Q^-]. Конечными продуктами

три или два пика (максимума) поглощения света

являются аддукты каротиноида с хиноном (Car-Q)

в диапазоне длин волн от 280 до 550 нм.

и цис-изомеры каротиноида. Образование ком-

плексов с переносом заряда в реакциях β-каротина,

Сложилось представление, что передача энер-

кантаксантина и 8΄-апо-β-каротин-8΄-аля с хино-

гии возможна только от каротиноидов на хлоро-

нами были зарегистрированы методом оптической

фил, которая происходит резонансным путем по

спектроскопии и ЭПР [21, 22].

механизму Фёрстера и протекает для одной пары

Было изучено образование комплексов с пере-

молекул на расстояние 1 нм в течение 10^-10 - 10^-12 с.

носом заряда между β-каротином и липидом кар-

Передача энергии сопровождается ее потерей:

диолипином. Для кардиолипина в видимой обла-

10% при передаче от хлорофилла a к хлорофиллу b и

сти спектра не были обнаружены полосы погло-

60% - от каротиноидов к хлорофиллу [22-25]. При

щения, тогда как β-каротин имеет характерные

этом передача энергии возможна только от пиг-

полосы при 340, 450 и 475 нм. Существенное рас-

мента с максимумом поглощения с меньшей дли-

ширение (до 100 нм) полосы поглощения β-каро-

ной волны к пигменту с большей, причем обрат-

тина в длинноволновую область наблюдается при

ный процесс невозможен. Такое упрощенное по-

образовании комплекса кардиолипина с β-каро-

нимание процесса передачи энергии и

тином. Незначительное смещение полос погло-

электронов при фотосинтезе не совсем правиль-

щения в длинноволновую область до 480 нм было

ное, так как оно не дает ответа на вопрос: каким

получено для комплекса «β-каротин-лецитин»

образом хлорофилл реализует механизм передачи

относительно исходной длины волны 450 нм.

энергии на другие биомолекулы тилакоидов, на-

Проведенные экспериментальные исследования

пример, каротиноиды, липиды, кофакторы, фер-

показали, что система «каротин-липид» способ-

менты?

на образовывать комплекс с переносом заряда,

В связи с этим следует отметить, что каротино-

посредством которого возможен электронный

перенос через липидо-каротиноидную структуру

иды в структурах клетки находятся в динамиче-

биологических мембран.

ском контакте с другими биомолекулами, образуя

при этом комплексы с переносом энергии и заря-

Радикальный перенос электронов в биологи-

да, следствием чего является существенное рас-

ческих мембранах с участием радикалов кофер-

ментов (С, СоQ), каротиноидов (Car) и липидов L

ширение полосы поглощения каротиноидов.

можно представить в виде цепи последователь-

Комплексы каротиноидов в составе биологиче-

ных реакций (схема 4).

ских мембран проявляют высокую стабильность.

Проведенные спектрофотометрические исследо-

вания [21, 22] показали возможность образования

комплексов с переносом заряда для смеси β-ка-

ротина с хиноном (2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-

бензохиноном) и появление интенсивной полосы

поглощения β-каротина в области 1030 нм. Таким

образом, передача энергии при фотосинтезе мо-

жет осуществляться от хлорофила к каротинои-

дам, что совсем не нарушает правила передачи

Схема 4. Цепь последовательных реакций

энергии от пигмента с меньшей длиной волны к

при радикальном переносе электронов в биологиче-

ских мембранах.

пигменту с большей длиной волны. Совпадение

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

702

ШАПОВАЛОВ и др.

1.2

ных жирных кислот в липидных мембранах и со-

держания в них каротиноидов.

1.0

В ряде работ рассматривается возможность

проводимости углеводородных цепей с диеновой

0.8

конъюгацией [27], когда углеродные атомы разде-

0.6

лены этиленовыми группировками или «метиле-

новыми мостиками» -СН₂-. В частности, приво-

0.4

дятся данные об электронной проводимости ли-

пида - далихола, углеводородная цепь которого

0.2

имеет спиральное диеновое сопряжение. Умест-

но отметить, что диеновую конъюгацию имеет

0.0

кофермент Q, выполняющий функцию перенос-

300

400

500 600 700

800

900 100

110 0

чика протонов и электронов.

, нм

Установлено, что при фотоактивации фермен-

тативной системы EС2 происходит окисление β-

каротина, сопровождающееся переносом элек-

Рис.

8. Спектры поглощения β-каротина

(1) и

трона от молекулы каротина (Car) к первичному

комплекса с переносом заряда (2), образованного при

донору Р680⁺ и образованием катион-радикала

его смешении с хиноном (2,3-дихлор-5,6-дициано-

1,4-бензохиноном) [21].

·Car⁺ [28]. Методом ЭПР было обнаружено обра-

зование анион-радикалов хинонов в EС1 и EС2

[29]. Молекулы каротиноидов легко подвергают-

полос поглощения хлорофилла и каротиноидов в

ся окислению и восстановлению, обладают хоро-

диапазоне длин волн 440-460 нм говорит о том,

шими электронными донорно-акцепторными

что передача энергии от хлорофилла на молекулу

свойствами по отношению к хлорофиллу, липи-

β-каротина может быть реализована без энерге-

дам и коферментам. Спектры поглощения каро-

тических затруднений.

тиноидов изменяются при различных структур-

Анализ спектра поглощения (рис. 8) указывает

ных перестройках молекулы пигмента. Образова-

на то, что пигменты-каротиноиды могут выпол-

ние ·Car+ в реакции с хинонами зарегистрировано

нять активную светособирающую функцию от

как в условиях фотолиза, так и в условиях темно-

ультрафиолетовой до видимой области в диапазо-

вой реакции.

не от 350 до 500 нм, а также 770-1100 нм. В диапа-

зоне спектра

440-770 нм светособирающую

функцию выполняют хлорофилл a и хлорофилл b.

ВЫВОДЫ

В связи с этим можно отметить, что каротино-

В работе рассмотрено участие природных ра-

иды являются обязательными структурными

дикалов в одноэлектронных процессах жизнедея-

компонентами любых фотосинтетических мем-

тельности клеток. Показано, что коферменты

бран, в виде комплексов они входят в состав хло-

имеют промежуточные свободно-радикальные

рофилл-белковых комплексов, пронизывают

хиноидные и семихиноидные формы, которые

мембранный бислой, образуя межмолекулярную

участвуют в жизненно важных одноэлектронных

связь с молекулами липидов [26]. Имея протя-

биохимических процессах, связанных с отдачей

женную сопряженную систему связей с метиль-

или приобретением электронов. Описывается

ными ответвленными группировками, каротино-

способ получения гидрофобного электропровод-

иды встраиваются в липидную мембрану и стяги-

ного сорбента, моделирующего монослой биоло-

вают два монослоя за счет сил гидрофобного

гической мембраны. Разработаны гетерогенные

связывания, формируя высокоорганизованную

биокаталитические системы в результате сорбции

структуру упакованных молекул пигмента и ли-

ADH и NAD на обратнофазовом электропровод-

пидов. При этом углеводородные цепи липидов

ном углеродном сорбенте. Результаты сорбции

могут содержать от одной до шести двойных свя-

ADH и NAD на электропроводном углеродном

зей. Липиды ряда растений, так же как и кароти-

носителе указывают на прочную необратимую

ны, могут иметь конъюгированную систему

сорбцию фермент-кофакторного комплекса на

связей. Это дает основание предполагать, что

матрице сорбента за счет гидрофобного связыва-

энергетическая и электронная проводимость

ния. Показано, что каталитическая активность

биологических мембран существенно зависит от

комплекса существенно зависит от последова-

количественного содержания полиненасыщен-

тельности формирования фермент-кофакторной

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

РАДИКАЛЫ В СТРУКТУРАХ КЛЕТКИ

703

системы; наибольшую активность биокаталити-

www.enzyme.chem.msu.ru/eduproc/prac/task9/part09.doc.

ческий комплекс проявляет при последователь-

Е. В. Петрова, Дис

канд. хим. наук (Томский

ной сорбции сначала кофермента, а затем апо-

гос. университет, 2015).

фермента. Осуществлены численные модельные

J. T. McFarland and Yu-H. Chu, Biochemistry 14 (6),

исследования ориентированной сорбции ADH и

1140 (1975).

лактатдегидрогеназы на гидрофобных матрицах с

U. M. Lutstarf, P. M. Shürch, and J. P. Wartburg, Eur.

целью управления биокаталитическими свой-

J. Biochem. 17 (3), 497 (1970).

ствами иммобилизованной фермент-кофактор-

ной системы.

П. П. Гладышев, М. И. Горяев и И. Г. Шпильберг,

Молекул. биология 16 (5), 943 (1982).

Рассматриваются вопросы радикального

трансмембранного переноса протонов и электро-

10.

E. Lundanes and T. Greibrokk, J. Chromatogr. 149,

нов, сопровождающегося ферментативной реге-

241 (1978).

нерацией кофермента. Отмечается важная роль

11.

The Enzymes (Acad. Press, New York, San Francisco,

радикалов природных пигментов каротиноидов в

London, 1975), Vol. 11, p. 191.

процессах переноса энергии и электронов в ак-

тивный центр биокатализаторов, которые могут

12.

M. J. Adams, G. C. Ford, A. Liljas, and M. G. Ross-

образовывать комплексы с переносом заряда с

man, Biochem. Biophys. Res. Commun. 53 (1), 46

липидами и коферментами. Анализ спектра по-

(1973).

глощения комплекса β-каротина с хиноном (2,3-

13.

M. G. Rossmann, D. Moras, and K. W. Olsen, Nature

дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохиноном) показал

250 (5463), 194 (1974).

появление интенсивной полосы поглощения в

14.

I. Ohlsson, B. Nordström, and C.-I. Bränden, J. Mol.

области 1030 нм [23]. Это указывает на то, что

Biol. 89 (2), 339 (1974).

комплекс каротина с коферментами, имеющими

фрагменты хиноидной и семихиноидной струк-

15.

H. Klaui, in Chemistry and Biochemistry (Pergamon

тур, могут выполнять активную светособираю-

Press, Oxford, (1982), pp. 309-317.

щую функцию при фотосинтезе в области длин

16.

J. A. Olson and N. I. Krinsky, FASEB J. 9 (15), 1547

волн в диапазоне от 350 до 500 нм, а также 770-

(1995).

1100 нм. При этом перенос энергии от хлорофил-

17.

E. Hernández-Marin, A. Barbosa, and A. Martínez,

лов a и b на комплекс каротиноида c кофермен-

Molecules 17, 1039 (2012).

том не нарушает правило передачи энергии от

18.

R. Edge and G. Truscott, in Carotenoids: Physical,

пигмента с меньшей длиной волны к пигменту с

Chemical, and Biological Functions and Properties (Klu-

большей длиной волны. В диапазоне спектра

wer Acad. Publ., 2010), pp. 283-307.

440-770 нм светособирающую функцию выпол-

няют хлорофилл a и хлорофилл b.

19.

F. Ramel, S. Birtic, and S. Cuine, Plant Physiol. 158,

1267 (2012).

20.

F. Bouvier, J.-C. Isner, O. Dogbo, and B. Camara,

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Trends Plant Sci. 10 (4), 187 (2005).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

21. Н. Э. Поляков и Т. В. Лёшина, Успехи химии 75,

интересов.

1175 (2006).

22. N. E. Polyakov, A. L. Focsan, K. Michael, et al., J.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Phys. Chem. B 23, 16968 (2010).

Настоящая работа не содержит описания ка-

23. H.Volkhard, Fluorescence Resonance Energy Transfer.

ких-либо исследований с использованием людей

Principles of Computational Cell Biology (Wiley-VCH,

и животных в качестве объектов.

Weinheim, 2008).

24. Н. Д. Алехина, Ю. В. Балнокин, В. Ф. Гавриленко

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

и др., Физиология растений (Academia, М., 2005).

1. Н. П. Чеснокова, Е. В. Понукалина и М. Н. Бизен-

25. D. C. Harris, in Applications of Spectrophotometry.

кова, Успехи соврем. естествознания, № 7, 29

Quantitative Chemical Analysis (W. H. Freeman and

(2006).

Co., New York, 2010).

2. Ю. А. Владимиров, Сорос. образоват. журн.

26. Г. Н. Смоликова и С. С. Медведев, Физиология

Биология 6 (12), 14 (2000).

растений 62 (1), 3-16 (2015).

3. Н. Т. Берберова, Сорос. образоват. журн. Химия 6

27. http://fbm.msu.ru/education/lectures/biophys/pdf/05.

(5), 39 (2000).

28. D. Kuciauskas, P. A. Liddell, A. L. Moore, et al., J. Am.

4. А. Соловьев, Фармацевт практик, № 12 (2016).

Chem. Soc. 120, 10880 (1998).

http://fp.com.ua/articles/svobodnyie-radikalyi-raz-

29. A. Sieckmann, W. Lubitz, and D. Stehlic, Chem. Phys.

rushiteli-ili-zashhitniki-organizma.

194, 349 (1995).

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020