БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 4, с. 741-744

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 57.086.866;57.084

СПОСОБ МИНИМИЗАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ПРИ ВВЕДЕНИИ

МИКРОЭЛЕКТРОДА В НЕЙРОН

*Академия биологии и биотехнологии Южного Федерального университета,

344091, Ростов-на-Дону, просп. Стачки, 194/1

**Научно-исследовательский технологический центр нейротехнологий Южного Федерального университета,

344091, Ростов-на-Дону, просп. Стачки, 194/1

E-mail: ins270386@yandex.ru

Поступила в редакцию 20.01.2020 г.

После доработки 03.05.2020 г.

Принята к публикации 25.05.2020 г.

Погружение микроэлектрода в сому клетки является одним из самых уязвимых мест в методике ре-

гистрации внутриклеточной активности. Показателем повреждения нейрона при прокалывании

мембраны может служить посттравматическая активность. В работе представлены результаты апро-

бации разработанного авторами импульсного электромагнитного микроманипулятора, предназна-

ченного для менее травматичного и более контролируемого введения микроэлектрода. Экспери-

менты с регистрацией внутриклеточной активности проводились на нейронах препарата изолиро-

ванной центральной нервной системы виноградной улитки (Helix pomatia). Результаты, полученные

при использовании сконструированного устройства, демонстрируют отсутствие выраженной реак-

ции нейрона на вторжение микроэлектрода, быстрое восстановление стабильного состояния клет-

ки и возможность длительной (многочасовой) регистрации активности нейрона. Все это указывает

на целесообразность использования предлагаемого устройства в экспериментах с регистрацией

внутриклеточной активности элементов нервной системы и других возбудимых тканей.

Ключевые слова: нейрон, внутриклеточная регистрация активности, импульсный электромагнитный

микроманипулятор, потенциал действия, мембранный потенциал.

DOI: 10.31857/S0006302920040158

стей, связанных, прежде всего, с риском повре-

Метод внутриклеточной регистрации биоэлек-

ждения клетки. Механические свойства мембра-

трической активности в возбудимых тканях живых

ны, в частности ее прочность и эластичность, су-

организмов [1-7], имеющий почти столетнюю ис-

щественно затрудняют управляемое погружение

торию применения, переживает в настоящее вре-

микроэлектрода вглубь клетки и увеличивают ве-

мя свое «второе дыхание». Помимо традиционно-

роятность повреждения нейрона при прокалыва-

го применения (микроионофорез, поляризация

нии мембраны, либо значительно увеличивают

мембран и пр.), его часто используют в комплекс-

время восстановления его исходного функцио-

ных мультидисциплинарных исследованиях в со-

нального состояния после прокола [4-7].

четании с новейшими биофизическими, нейрохи-

мическими, оптофизиологическими, ультраструк-

Обычно для проникновения в клетку использу-

турными, нейроморфологическими методами [2,

ется аккуратное микронажатие (мягкое или, на-

3]. Например, оптическая регистрация активности

оборот, резкое) на микроманипулятор. Применя-

нейронов может сочетаться с внутриклеточной ре-

ются также электронные методы, заключающиеся

гистрацией их электрической активности для со-

в пропускании через микропипетку переменного

поставления и последующего анализа информа-

тока высокой частоты или в прикладывании боль-

ции, получаемой с помощью этих методов [2].

шого положительного (или отрицательного) по-

Вместе с тем, несмотря на многолетние усилия

тенциала. Тем не менее все эти приемы чреваты

исследователей по усовершенствованию метода,

повреждением клетки [4, 7].

регистрация внутриклеточной активности по-

Стремление усовершенствовать приемы введе-

прежнему сопряжена с рядом технических трудно-

ния микроэлектрода в нейрон привело авторов к

Сокращениe: ИЭММ - импульсный электромагнитный

идее создания импульсного электромагнитного

микроманипулятор.

микроманипулятора (ИЭММ).

741

742

ОРЛОВ и др.

смещения электромагнитов относительно ударно-

го и/или компенсирующего стержней (в отличие

от предыдущей версии устройства [8]). В результа-

те отпадает необходимость в использовании спе-

циальной перемычки между внутренним корпу-

сом устройства и серединой пружины, связываю-

щей стержни, а также винта регулировки

натяжения верхней пружины.

Изготовленный экземпляр представляемого

здесь устройства имеет вес 20 г, диаметр 6 мм, дли-

ну 5 см. Оптимальный режим гашения вибраций

подбирался в процессе изготовления (посредством

смещения электромагнитов) под контролем фото-

элемента, затененного ИЭММ, по скачку напря-

жения на осциллографе. Сила тока, обеспечиваю-

щая бросок ударного стержня на 200 мкМ, состав-

ляла около 300 мА. Внутренний корпус прибора

выполнен из тефлоновой трубочки, позволяющей

минимизировать трение между внутренним кор-

Рис. 1. Схема устройства импульсного электромаг-

пусом и подвижными частями устройства.

нитного микроманипулятора: 1 - внешний экрани-

рующий корпус; 2 - управляющая (нижняя) и ком-

Устройство предназначено для вертикального

пенсирующая (верхняя) злектромагнитные катушки;

погружения микроэлектрода.

3 - ударный (нижний) и компенсирующий (верхний)

Чтобы выяснить, насколько эффективным яв-

стержни; 4 - пружина подвески стержней; 5 - пружи-

на, связывающая стержни; 6 - точка подвески по-

ляется применение ИЭММ, были проведены экс-

движных элементов устройства; 7 - внутренний кор-

перименты в условиях, различающихся лишь спо-

пус устройства.

собом проникновения микроэлектрода в клетку.

Апробацию устройства проводили на иденти-

Оптимальным для обеспечения минимального

фицированных нейронах париетальных ганглиев

травмирования представлялся способ, при кото-

изолированного подглоточного комплекса вино-

ром микроэлектроду придается ударное ускоре-

градной улитки [3].

ние, обеспечивающее очень короткий, дозирован-

Для внутриклеточной регистрации нейронной

ный по амплитуде шаг. При этом было желатель-

активности использовали стандартные стеклян-

но, чтобы ударное воздействие на микроэлектрод

ные микроэлектроды, заполненные раствором

не сопровождалось последующими дополнитель-

2.5 М KCl; диаметр кончиков микроэлектродов

ными вибрациями.

составлял 0.3-0.5 мкМ, сопротивление - 10-

Принципиальная схема разработанного

15 МОм.

устройства представлена на рис. 1.

В четырех экспериментах погружение микро-

Движущимися элементами ИЭММ являются

электрода осуществляли с помощью винта микро-

два одинаковых стержня 3: ударный и компенси-

подачи механического манипулятора ММ-1, в пя-

рующий. Стержни подвешены к общей точке фик-

ти экспериментах - с помощью ИЭММ.

сации 6 с помощью двух пружин 4 и 5, выполнен-

В экспериментах с применением микровинта

ных из вольфрамовой проволоки диаметром

механического манипулятора были зарегистриро-

50 мкм.

ваны мощные и продолжительные реакции нейро-

Питание электромагнитов 2, приводящих в

нов. Сразу после прокола мембраны начиналась

движение ударный и компенсирующий стержни,

высокочастотная генерация травматических раз-

осуществляется короткими (0.5-1.0 мс) прямо-

рядов, которая продолжалась от нескольких минут

угольными импульсами тока, подаваемыми от

до нескольких часов и сопровождалась выражен-

обычного лабораторного электростимулятора

ной (десятки мВ) деполяризацией мембранного

(ЭСЛ-2) на оба электромагнита одновременно. С

потенциала. На рис. 2 представлена типичная ос-

подачей импульса на электромагниты ударный

циллограмма внутриклеточной активности.

стержень осуществляет микроудар по торцу мик-

Осциллограмма демонстрирует продолжитель-

ропипетки (калибруется заранее); при этом ком-

ную генерацию травматических потенциалов дей-

пенсирующий стержень осуществляет движение в

ствия, сопровождающуюся изменением мембран-

противоположную сторону, демпфируя вибрацию

ного потенциала. Такие интенсивные реакции с

ИЭММ и предохраняя микроэлектрод от колеба-

затяжным периодом перехода к устойчивому уров-

ний, способных травмировать клетку.

ню потенциала покоя мембраны - обычное явле-

Регулировка демпфирования вибраций в пред-

ние при удачном проникновении микроэлектрода

ставленном варианте ИЭММ производится за счет

в клетку [6].

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

СПОСОБ МИНИМИЗАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ

743

0 мВ

10 мВ

5с

Рис. 2. Активность нейрона виноградной улитки во

Рис. 3. Активность нейрона виноградной улитки во

время погружения микроэлектрода и в первые

время погружения микроэлектрода и в первые секун-

секунды после прокола мембраны с помощью

ды после прокола мембраны с помощью импульсного

микровинта механического манипулятора. Момент

электромагнитного микроманипулятора. Момент

прокола отмечен стрелкой.

В экспериментах с ИЭММ реакции нейронов

При использовании ИЭММ микроэлектрод,

разительно отличались от описанных выше.

получив короткий и резкий (с большим ускорени-

ем) микроудар, прокалывает мембрану при мень-

При проколе мембраны с помощью ИЭММ ге-

шем ее натяжении, что уменьшает вибрации мем-

нерация травматических разрядов была кратко-

браны, которые «разбалтывают» отверстие, обра-

временной (3-5 спайков в течение первых 5-

зующееся при проникновении микроэлектрода

10 мс) во всех экспериментах и не сопровождалась

(имеющего неодинаковую толщину на разных рас-

выраженными изменениями мембранного потен-

стояниях от кончика) в клетку. В результате мем-

циала. Переход к устойчивому уровню потенциала

брана быстрее сокращается вокруг микроэлектро-

покоя мембраны занимал 12-20 с. На рис. 3 пред-

да, плотно охватывая и удерживая его, и таким об-

ставлена осциллограмма активности одного из за-

разом препятствуя возникающему после прокола

регистрированных нейронов. Она свидетельствует

свободному обмену ионами между внутренней

об отсутствии интенсивной реакции нейрона на

средой нейрона и внешним, омывающим нейрон,

вторжение микроэлектрода с помощью ИЭММ и

о быстром переходе к спокойному функциональ-

раствором [3, 6].

ному состоянию. Признаки ухудшения состояния

Оптимальный подбор силы микроудара, стан-

не наблюдались в течение всего эксперимента ни у

дартизируя воздействия в степени, невозможной

одной из пяти клеток. (В качестве признаков ухуд-

даже при самом аккуратном ручном управлении,

шения состояния рассматривались резкое измене-

ограничивает шаг микроэлектрода и устанавлива-

ние амплитуды, формы и длительности спайков и

ющуюся в итоге глубину его погружения в сому

частоты их генерации (по сравнению с наблюдав-

нейрона. Гашение тремора самого ИЭММ, а сле-

шимся до прокола характером фоновой активно-

довательно, и частей механического манипулято-

сти), а также нестабильность уровня потенциала

ра, несущих микроэлектрод, защищает нейрон от

покоя мембраны.)

дополнительных вибраций, представляющих се-

Таким образом, полученные результаты свиде-

рьезную угрозу для клетки. Миниатюрность

тельствуют о значительно менее травматичном по-

ИЭММ позволяет закрепить его на обычном меха-

гружении микроэлектрода при использовании

ническом манипуляторе непосредственно над

ИЭММ.

микропипеткой таким образом, чтобы ударный

стержень находился на оптимальном расстоянии

В чем же, на наш взгляд, кроются причины

от торца микроэлектрода.

столь успешного проникновения в клетку с помо-

щью разработанного устройства?

Полученные результаты подтвердили исходное

Обычно прикосновение кончика микроэлек-

предположение о существенно более щадящем и

трода к мембране нейрона и последующее его про-

контролируемом погружении микроэлектрода в

движение приводят к прогибу и натяжению эла-

клетку с помощью разработанного устройства. О

стичной мембраны клетки. В тот момент, когда на-

высокой эффективности ИЭММ свидетельствует

рушается целостность мембраны и кончик

отсутствие выраженной реакции нейрона на втор-

микроэлектрода проникает внутрь нейрона, про-

жение микроэлектрода, сравнительно быстрое

исходит резкая механическая отдача, вызывающая

восстановление и длительное сохранение стабиль-

вибрации мембраны и электрода, зачастую трав-

ного состояния клетки. Применение устройства

мирующие клетку.

упрощает процедуру погружения микроэлектрода,

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

744

ОРЛОВ и др.

требующую от экспериментатора специальных на-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

выков.

1. G. Ling and R. W. Gerard, J. Cell Comp. Physiol. 34

Такие преимущества ИЭММ расширяют воз-

(3), 383 (1949).

можности использования метода внутриклеточ-

ной регистрации, особенно в экспериментах,

2. Е. С. Никитин, Дисс. … д-ра биол. наук (ИВНД и

предполагающих регистрацию биоэлектрической

НФ РАН, Москва, 2015).

активности на протяженных временных интерва-

3. В. Орлов, А. Сухов, О. Кит и др., Cardiometry,

лах, а также открывают обнадеживающую пер-

спективу применения метода для внутриклеточ-

№ 12, 40 (2018).

ной регистрации нейронной активности мозга

4. П. Г. Костюк, Микроэлектродная техника (Наук.

высших позвоночных животных, чьи нейроны

думка, Киев, 1960).

значительно мельче, чем у беспозвоночных (име-

ются предварительные неопубликованные дан-

5. Дж. Николлс, А. Р. Мартин, Б. Дж. Валлас и

ные).

П. А. Фукс, От нейрона к мозгу (Едиториал УРСС,

М., 2003).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

6. Р. Пёрвис, Микроэлектродные методы внутрикле-

точной регистрации и ионофореза (Мир, М., 1983).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта ин-

тересов.

7. J. M. Bekkers, R. J. Bookman, M. J. Delay, et al., The

Axon CNS Guide (Molecular Devices Corp., USA,

2006).

http://www.octopus.huji.ac.il/course/Links/

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Axon_Guide.pdf.

Проведенные эксперименты полностью соот-

ветствуют действующим национальным и между-

8. С. А. Ивлев, А. Г. Сухов и Г. Г. Бондарь, Биомед.

народным нормам в области этики.

радиоэлектроника, № 4, 35 (2015).

Approach to Minimize Damage Resulting from Microelectrode Insertion into Neuron

V.I. Orlov*, S.A. Ivlev**, and G.G. Bondar**

*Academy of Biology and Biotechnology of the Southern Federal University,

prosp. Stachki 194/1, Rostov-on-Don, 344091 Russia

**Research Technology Center of Neurotechnology of the Southern Federal University,

prosp. Stachki 194/1, Rostov-on-Don, 344091 Russia

Penetration of a microelectrode into the cell soma is one of the essential vulnerable stages of the method in-

tracellular recording. Traumatic neuronal activity after piercing the membrane with a microelectrode can be

an indicator of neuronal damage. In this paper we report the results from tests of our pulse electromagnetic

micromanipulator. This device is designed to reduce the neuronal damage from the insertion of a microelec-

trode and more controlled penetration into the cell. Intracellular recordings were employed in experiments

carried out on neurons of the isolated central nervous system of the grape snail (Helix pomatia). The results

obtained by using our micromanipulator show the absence of a pronounced neuronal reaction in response to

the invasion of a microelectrode, the cell is able to rapidly return to a stable state, and registration of neuronal

activity is possible for a long period of time (many hours). These findings indicate the relevance of using the

proposed device in experiments that recording intracellular activity of the cells of the nervous system and oth-

er excitable tissues.

Keywords: neuron, intracellular activity recording, pulse electromagnetic micromanipulator, action potential,

membrane potential

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020