БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 4, с. 760-768

БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ

УДК 663.951.542.943-032.1

ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ЛИПОСОМНЫХ КОМПЛЕКСОВ

НА АНТИОКИСЛИТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ПЛАЗМЫ КРОВИ

И ЛИПИДОВ ПЕЧЕНИ И МОЗГА МЫШЕЙ

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334, Москва, ул. Косыгина, 4

E-mail: natnik48s@yandex.ru

Поступила в редакцию 19.03.2020 г.

После доработки 31.03.2020 г.

Принята к публикации 02.04.2020 г.

В настоящее время большое внимание уделяется разработке и созданию эффективных систем до-

ставки незаменимых омега-3-полиненасыщенных жирных кислот и других нутрицевтиков в орга-

низм человека через пищевые системы. Одними из таких систем доставки являются нанокомплек-

сы на основе липосом соевого фосфатидилхолина с включенными нутрицевтиками, длительное по-

требление которых может оказать влияние на антиокислительный статус различных органов и

тканей. В работе методом термоинициированной хемилюминесценции проведено исследование

изменения антиокислительной активности плазмы крови, липидов печени и мозга шести групп мы-

шей в зависимости от состава липосомных нанокомплексов, введенных в напитки, заменяющие во-

ду, в их длительную (трехмесячную) диету. Компонентами шести видов липосомных нанокомплек-

сов, кроме фосфатидилхолина, в разном сочетании служили: эфирное масло гвоздики, рыбий жир

и казеинат натрия. Показано, что нанокомплексы, содержащие липосомы из фосфатидилхолина с

добавлением в них рыбьего жира, эфирного масла гвоздики и инкапсулированных молочным бел-

ком казеинатом натрия, оказались самыми эффективными в отношении увеличения антиокисли-

тельной активности плазмы крови и липидов мозга мышей по сравнению с контролем.

Ключевые cлова: функциональные нутрицевтики, липосомы, эфирное масло гвоздики, рыбий жир,

казеинат натрия, антиокcидант, антиокислительная активность, xемилюминеcценция.

DOI: 10.31857/S0006302920040183

сидантами, которые содержатся в органах и тка-

Известно, что суммарная антиокислительная

нях экспериментальных животных [1, 8, 9].

активность (АОА) различных органов и тканей

является важным показателем для оценки состо-

В настоящее время широкое распространение

яния организма и его устойчивости к повреждаю-

получила идея введения в рацион питания допол-

щим воздействиям и развитию многих заболева-

нительного количества омега-3 полиненасыщен-

ний [1-7]. К изменению этой величины могут

ных жирных кислот (ПНЖК). Данное предложе-

приводить как различные физические факторы,

ние связано с тем, что, с одной стороны, ПНЖК

так и введение в организм веществ как искус-

играют важную роль в поддержании ряда физио-

ственного, так и природного происхождения, их

логических функций организма животных и че-

смесей, растительных экстрактов и масел [1-10].

ловека (рецепторных, противовоспалительных,

Степень влияния всех перечисленных воздей-

регуляторных) [11-15], а с другой - они не синте-

ствий на АОА зависит от антирадикальной и ан-

зируются в организме млекопитающих и потреб-

тиокислительной активности вводимых веществ,

ляются с пищей. Наиболее оптимальным для

их взаимодействия друг с другом и теми антиок-

усвоения in vivo является соотношение ПНЖК

(омега-6 : омега-3 = 1:1 - 4:1) [15]. Однако созда-

Сокращения: АОА

- антиокислительная активность, ние таких продуктов, обогащенных ПНЖК, со-

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты, ФХ -

пряжено с определенными трудностями, обу-

фосфатидилхолин, ЭМГ

- эфирное масло гвоздики,

словленными тем, что высокое содержание нена-

Каз-Na - казеинат натрия, РЖ - рыбий жир, ACW - сум-

марная антиокислительная емкость водорастворимых со- сыщенных углерод-углеродных связей в их

единений плазмы крови, ACL - антиокислительная ем-

молекулах способствует их окисляемости и дегра-

кость жирорастворимых соединений в липидах, ХЛ - хе-

милюминесценция.

дации с образованием токсичных продуктов: гид-

760

ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ЛИПОСОМНЫХ КОМПЛЕКСОВ

761

роперекисей, кетонов и альдегидов. Кроме того,

этаноламина,

3% лизофосфатидилхолина,

0.1%

липофильная природа ПНЖК затрудняет их вве-

фосфатидилинозита; триглицериды - 2%; свобод-

дение в низкожирные или имеющие 0% жирно-

ные жирные кислоты - 0.5%; α-токоферол - 0.15%.

сти продукты питания.

Использовали также казеинат натрия (Каз-Na)

В работах [16, 17] был выполнен цикл исследо-

фирмы Sigma (Новая Зеландия); органические рас-

ваний, посвященных созданию и всестороннему

творители фирмы Merk (Германия); эфирное масло

изучению физико-химических свойств наноком-

гвоздики фирмы Plant Lipids Ltd (Индия); рыбий

плексов пищевых биополимеров с липосомами

жир (концентрат омега-3 «Омега-3 дети», ООО

соевого фосфатидилхолина (ФХ), обогащенных

«РУСКАПС», Москва); аскорбиновая кислота (Sig-

незаменимой растительной омега-3 ПНЖК в от-

ma, США); тролокс™ (6-гидpокcи-2,5,7,8-тетpаме-

сутствие и в присутствии растительного антиок-

тилxpоман-2-каpбоновая киcлота) фирмы Aldrich

сиданта - эфирного масла гвоздики (ЭМГ). Од-

(CША). В китах ARA-W (для определения антира-

нако оставался открытым вопрос о биодоступно-

дикальной активности водорастворимых соедине-

сти и степени биоусвоения омега-3 ПНЖК и

ний) и ARA-L (для определения антирадикальной

ЭМГ из биополимерных наноконтейнеров в жи-

активности жирорастворимых соединений) фирмы

вом организме при их пероральном употребле-

Oxidaq UG Ltd. (Германия) содержатся соответ-

нии. В частности, длительный прием липосо-

ственно 2,2´-азо-бис(2-метил-пропионамидин)ди-

мальных комплексов может существенно изме-

гидрохлорид и 2,2'- азо-бис(2,4-диметил-валеро-

нить не только уровень ПНЖК в липидах, но и

нитрил) фирмы Wako-chemicals (Япония).

оказать влияние на такой показатель, как сум-

Приготовление растворов липосомных наноком-

марную антиокислительную активность различ-

плексов. В экспериментах были использованы

ных органов и тканей.

водные растворы шести видов липосомных нано-

комплексов в качестве напитков, заменяющих

В литературе представлены работы, связанные

воду в диете экспериментальных животных:

с оценкой влияния приема растительных и эфир-

ных масел, антиоксидантов и других биологиче-

Диета 1. Липосомы из ФХ (с концентрацией в

ски активных добавок на состав липидов органов

растворе [ФХ] = 2.50 мг/мл).

мышей, их общеклинические показатели, актив-

Диета 2. Липосомы из ФХ с добавлением ЭМГ

ность некоторых антиоксидантных ферментов и

(2% от веса ФХ) (с концентрацией в растворе

уровень АОА [10, 18-22]. Например, в работе [10]

[ФХ] = 2.50 мг/мл). Весовое отношение компо-

методом фотохемилюминесценции исследовали

нентов липосомного нанокомплекса: ФХ : ЭМГ =

АОА шести разных растительных масел и влия-

= 1 : 0.02.

ние их пятнадцатисуточного приема на АОА ли-

Диета 3. Липосомы из ФХ (с концентрацией в

пидов сыворотки крови крыс. Установлено зна-

растворе [ФХ] = 1.66 мг/мл), инкапсулированные

чительное различие (в два-четыре раза) суммар-

казеинатом натрия (Каз-Na) (с концентрацией в

ной АОА масел между собой, а также высокая

растворе [Каз - Na] = 16.6 мг/мл). Весовое отно-

корреляция (~0.95) между АОА масел и АОА ли-

шение компонентов в липосомном наноком-

пидов сыворотки крови. Работы по изучению

плексе: ФХ : Каз-Na = 1 : 10.

влияния на антиокислительный статус организма

Диета 4. Липосомы из ФХ с добавлением ЭМГ

in vivo состава водорастворимых липосомных на-

(2% от веса ФХ) ([ФХ] = 2,50 мг/мл), инкапсули-

нокомплексов, включающих различные нутри-

рованные Каз-Na (с концентрацией в растворе

цевтики и длительно принимаемых перорально, в

[Каз-Na] = 25,0 мг/мл). Весовое отношение ком-

литературе отсутствуют.

понентов в липосомном нанокомплексе

Цель настоящей работы - изучить in vivo влия-

ФХ : ЭМГ : Каз-Na = 1 : 0,02 : 10.

ние состава водорастворимых липосомных нано-

Диета 5. Липосомы из ФХ (с концентрацией в

комплексов, принимаемых перорально, на анти-

растворе [ФХ] = 1.66 мг/мл) с добавлением рыбьего

окислительную активность плазмы крови, а так-

жира (РЖ) (с концентрацией в растворе [РЖ] =

же липидов печени и мозга у экспериментальных

= 1.66 мг/мл), инкапсулированные Каз-Na (с кон-

животных.

центрацией в растворе [Каз-Na] = 33.3 мг/мл). Ве-

совое отношение компонентов в липосомном нано-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

комплексе ФХ : РЖ : Каз-Na = 1 : 1 : 20.

Материалы. В работе использовали фосфатидил-

Диета 6. Липосомы из ФХ (с концентрацией в

холин фирмы Lipoid GmbH (Германия) следующего

растворе [ФХ] = 1.66 мг/мл) с добавлением ры-

химического состава по данным фирмы: фосфоли-

бьего жира (с концентрацией в растворе [РЖ] =

пиды - 94% фосфатидилхолина, 0.6% фосфатидил-

1.66 мг/мл) и ЭМГ (2% от веса ФХ + РЖ), инкап-

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

762

САЖИНА и др.

сулированные Каз-Na (с концентрацией в рас-

I группа животных (семь особей) получала об-

творе [Каз-Na] = 33.3 мг/мл). Весовое отноше-

щевиварный рацион и была забита методом дека-

ние компонентов в липосомном нанокомплексе:

питации в первый день эксперимента. II группа

ФХ : РЖ : ЭМГ : Каз-Na = 1 : 1 : 0.02 : 20.

(шесть особей) получала диету 1; III группа

(шесть особей) - диету 2; IV группа (шесть осо-

Приготовление липосом. Липосомы ФХ с до-

бей) - диету 3, V группа (шесть особей) - диету 4;

бавлением ЭМГ и/или РЖ готовили по следую-

VI группа (шесть особей) - диету 5; VII группа

щей методике: в стерилизованные при 110°С

(шесть особей) - диету 6; VIII группа (семь осо-

(30 мин) стеклянные стаканчики взвешивали не-

бей) содержалась на общевиварном рационе все

обходимые навески ФХ/ЭМГ/РЖ. Добавляли в

92 суток эксперимента и была забита в конце

них расчетное количество свежекипяченой биди-

опыта. Через 92 суток после начала приема раз-

стиллированной воды, диспергировали ФХ/

личных диет мыши были забиты методом декапи-

ЭМГ/РЖ в воде при помощи трехкратной меха-

тации, а плазма крови, ткани печени и головного

нической гомогенизации, используя гомогениза-

мозга животных были взяты для исследования их

тор (Heidolph, Германия), в течение 2 мин при

антиокислительной активности. Кровь собирали

20000 об/мин. Полученную водную дисперсию

в пробирки с 5%-м раствором цитрата натрия,

ФХ/ЭМГ/РЖ дополнительно обрабатывали уль-

центрифугировали при 1300 g и комнатной темпе-

тразвуком для получения наноразмерных липо-

ратуре 10 мин, отделяли плазму крови.

сомных комплексов, используя при этом ультра-

Выделение липидов из плазмы крови, печени и

звуковой гомогенизатор VCX-130 (Sonics & Mate-

мозга. Экстракцию липидов из плазмы крови

rials, США) в подобранном предварительно

проводили по методу Блайя и Дайера [23]; из тка-

режиме: озвучивание в течение 5 мин при 40%

ней печени и головного мозга - по методу Фолча

мощности сигнала (отношение времени озвучи-

в модификации Кейтса [24].

вания к времени без озвучивания 30 с : 30 с). При

Определение антиокислительной активности

озвучивании образец охлаждали во льду. Для по-

плазмы крови, липидов печени и головного мозга

лучения наноразмерных липосомных комплек-

мышей. Измерения антиокислительных парамет-

сов такой режим озвучивания повторяли семи-

кратно. После этого проводили центрифугирова-

ров проводили на хемилюминометре Minilum^®

ние полученных водных растворов липосомных

L-100 компании Oxidaq UG Ltd. (Германия) c

комплексов ФХ/ЭМГ/РЖ в стерилизованных

проточной, термостатированной при 37 ± 0.02°C

(при 110°С, 30 мин) центрифужных пробирках в

кюветой [25], методом термоинициированной хе-

течение 30 мин при 4000 об/мин (1800 g) для уда-

милюминесценции с использованием китов

ления металлической стружки от ультразвукового

ARA-W и ARA-L [26]. Определяли ACW (суммар-

зонда. Инкапсулирование белком (Каз-Na) при-

ную антиокислительную емкость водораствори-

готовленных липосом (ФХ/ЭМГ/РЖ) проводили

мых соединений плазмы крови) и ACL (ан-

смешением их растворов в стерилизованных (при

тиокислительную емкость жирорастворимых

соединений в липидах). Принцип термоиниции-

110°С, 30 мин) бутылочках для кормления с по-

рованной хемилюминесценции основан на реги-

следующим их встряхиванием (165 об/мин) в

страции хемилюминесценции (ХЛ), сопровожда-

шейкер-инкубаторе (GFL 3032, Германия) при

ющей взаимодействие с люминолом свободных

40°С в течение 1 ч. После этого повышали темпе-

радикалов, возникающих при термоиницииро-

ратуру в шейкер-инкубаторе до 63°С и пастеризо-

ванном распаде водорастворимого азосоедине-

вали все приготовленные растворы в течение

ния 2,2′-азо-бис(2-амидинопропан)дигидрохло-

30 мин при их продолжающемся встряхивании

рида для ACW или жирорастворимого 2,2'-азо-

(165 об/мин).

бис(2,4-диметил-валеронитрила) для ACL в соот-

Все приготовленные растворы липосомных

ветствии со схемой (рис. 1) [27-29]. С потенци-

нанокомплексов готовили на двое суток из расче-

альными антиоксидантами могут реагировать ра-

та их потребления одной мышью в объеме 7 мл

дикалы R^, ROO^, L^-, О_2-, формирующиеся в

ежедневно.

реакциях, протекающих в процессе окисления.

Животные и дизайн эксперимента. 50 мышей

При определении ACW плазмы крови мышей

линии F1(C57blxDBA2\6) массой 18-20 г из вива-

в реакционную кювету добавляли 50 мкл раство-

рия «Столбовая» (Московская область) были раз-

ра

2,2′-азо-бис(2-амидинопропан)дигидрохло-

делены на восемь групп по шесть-семь мышей в

рида, 50 мкл раствора люминола (кит ARA-W).

каждой группе. Мышей содержали на диете в те-

Объем вводимой плазмы крови мышей составил

чение 92 суток.

5-10 мкл, фосфатный буферный раствор

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ЛИПОСОМНЫХ КОМПЛЕКСОВ

763

37 C

R N=N R

2R N₂

R O₂

ROO

(+HO

ROH + O₂

ROOН + L , L + O₂

(Эндопероксид люминола)

ROO +LHO

или:

R LHOO (Эндопероксид люминола)

N +AP*₂

(Аминофталат-анион в возбужденном состоянии)

+h (Хемилюминесценция,

max = 425

нм)

Рис. 1. Схема предполагаемых реакций в модели термоинициированной хемилюминесценции [27-29].

(рН 7.2) добавляли до конечного объема реакци-

Надо отметить, что в отличие от ХЛ-кривой

онной смеси (1.5 мл) [26]. Для каждой группы

для аскорбиновой кислоты (рис. 2, кривая 1), для

мышей проводили пять-шесть повторных реги-

всех ХЛ-кривых плазмы крови характерно увели-

чение интенсивности ХЛ после периода индук-

страций. Измеряемым параметром являлся пе-

ции выше холостой пробы (кривая 0). Подобную

риод индукции τ, который определяли как вре-

картину для термоинициированной ХЛ плазмы и

мя от момента инициирования окисления до

сыворотки крови наблюдали также и в других ра-

точки пересечения с осью времени касательной,

ботах (например, [30, 31]). Это может быть связа-

приложенной к ХЛ кривой в точке ее перегиба

но с образованием в процессе окисления люми-

(рис. 2). Для калибровки в качестве эталона ис-

нола промежуточных радикальных интермедиа-

пользовали аскорбиновую кислоту, ACW выра-

тов, меняющих кинетику окисления. Глутатион,

жали в эквивалентном содержании аскорбино-

а также некоторые другие тиильные соединения в

вой кислоты в 1 мл плазмы крови (нмоль аскор-

белках плазмы крови, например цистеин, могут

биновой кислоты/мл плазмы). На рис.

восстанавливать образующиеся при окислении

приведены характерные ХЛ-кривые для опреде-

гидропероксиды, и это восстановление может

проходить через радикальные стадии (тиильные

ления ACW плазмы крови мышей.

I₀

100

150

100

250

300

t, c

Рис. 2. Примеры характерных кинетических кривых

интенсивности ХЛ (I) при измерении ACW плазмы

Рис. 3. Примеры характерных кинетически кривых

крови мышей: кривая

- холостая проба (без

ХЛ для определения ACL: 0 - холостая проба (бланк);

плазмы), 1 - аскорбиновая кислота, кривые 2 и 3 -

кривые 1-3 - соответственно липиды плазмы крови,

плазма крови мышей (VIII и I гр.), прямая линия -

печени и мозга; I₀ - интенсивность ХЛ на кривой (0)

касательная к кривой 3 в точке ее перегиба.

при t = 60 c.

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

764

САЖИНА и др.

Суммарная антиокислительная активность водорастворимых компонентов плазмы крови

ACW, нмолей аскорбиновой кислоты/мл плазмы

I^#

III^#

VII

VIII

69.9 ± 3.8

27.8 ± 1.1

49.2 ± 5.5

22.0 ± 5.0*

23.8 ± 4.4*

24.2 ± 3.7*

36.6 ± 6.5

31.0 ± 5.2

Примечание. ^# - Плазма крови с гемолизатом; * - p < 0.05 по отношению к контрольной группе VIII.

нов [1-7, 30, 34, 35]. При этом делаются попытки

соединения + гидропероксиды → TS^• + LO^• +

использовать метод хемилюминесценции в кли-

H₂O), образуя дополнительный источник ради-

нике для целей диагностики и контроля над тера-

калов [32, 33]. Возможно, некоторые интермеди-

пией заболеваний [29, 30], причем в одних рабо-

аты плазмы крови выступают как активаторы лю-

тах предпочтение отдается водорастворимым ан-

минесценции. Остатки гемоглобина эритроцитов

тиоксидантам

[29-31],

а в других

в плазме крови могут проявлять радикалпродуци-

жирорастворимым [1, 2]. Мы использовали в на-

рующую активность по отношению к липидным

ших экспериментах киты ARA-W и ARA-L, поз-

и другим органическим гидропероксидам, при-

воляющие оценить АОА и водо- и жирораствори-

сутствующим в плазме, инициируя образование

мых веществ в плазме крови экспериментальных

липидных пероксильных радикалов [30].

животных.

Для определения АОА жирорастворимых со-

единений в липидах плазмы крови, печени и моз-

В таблице представлены результаты измере-

га (ACL) измеряли степень уменьшения (I/I₀) ам-

ния суммарной АОА водорастворимых компо-

плитуды ХЛ (I) в момент времени t = 60 с от нача-

нентов плазмы крови (ACW) для восьми групп

ла окисления по сравнению с амплитудой ХЛ для

исследованных животных, выраженные в едини-

холостой пробы I₀ (рис. 3). Объем реакционной

цах, эквивалентных количеству аскорбиновой

кислоты.

смеси в кювете составил 1.5 мл, включая объем

добавляемых липидов (50-100 мкл), 25 мкл рас-

Как видно из таблицы, уровень AОА плазмы

твора 2,2'- азо-бис(2,4-диметил-валеронитрила)

крови мышей групп I и III значительно выше

и 125 мкл раствора люминола (киты ARA-L),

остальных. Следует отметить, что в этих образцах

остальное - метанол [26]. Число повторов равня-

визуально был заметен гемолизат эритроцитов. В

лось четырем-пяти. Калибровку для ACL прово-

процессе гемолиза в плазму крови попадают эле-

дили по тролоксу и выражали в эквивалентном

менты эритроцитов: метгемоглобинредуктаза, су-

содержании тролокса в мг липидов (нмоль тро-

пероксиддисмутаза и ферменты глутатионового

локса/мг липидов).

цикла [36], которые, как было показано в работах

Статистическая обработка результатов. Стати-

[36, 37], эффективно увеличивают период индук-

стическую обработку результатов экспериментов

ции на кривых хемилюминесценции. Поэтому

осуществляли с использованием компьютерных

высокий уровень ACW в плазме крови мышей I и

программ Origin Pro 8.1 и Microsoft^® Office Excel.

III групп можно объяснить именно гемолизом. К

Результаты исследования представлены как сред-

сожалению, наличие гемолиза не позволяет про-

няя измеряемая величина ± стандартная ошибка

вести сравнение уровней ACW в плазме крови ис-

средней. Для сравнения данных использовались

ходных контрольных животных и мышей группы

методы непараметрической статистики с крите-

VIII (контроль через 92 суток после начала экспе-

рием Манна-Уитни. Различия считались стати-

римента). Рассматривая результаты, полученные

стически достоверными при уровне значимости

для АCW остальных групп животных, можно ска-

p < 0.05.

зать, что по сравнению с группой VIII, являю-

щейся контролем, наблюдается статистически

достоверное снижение ACW плазмы у мышей

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

групп IV, V и VI, которые принимали липосомы,

Как указывалось выше, устойчивость организ-

изготовленные из ФХ + Каз-Na, ФХ + ЭМГ +

ма к повреждающим воздействиям и развитию

+ Каз-Na и ФХ + РЖ + Каз-Na соответственно.

патологий многие авторы связывают с уровнем

Значение ACW плазмы крови у мышей группы

суммарной антиоксидантной активности их орга-

VII находится на уровне контроля, но статистиче-

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ЛИПОСОМНЫХ КОМПЛЕКСОВ

765

ски достоверно превышает ACW плазмы крови

(а)

2.5

мышей групп II, IV, V и VI.

Таким образом, можно сделать вывод, что

2.0

применение всех используемых диет или не влия-

ло на уровень АОА водорастворимых антиокси-

1.5

дантов плазмы крови (группа VII), или даже сни-

1.0

жало его (группы IV и VI).

Рассмотрим теперь, какие изменения под вли-

0.5

янием различных диет произошли в АОА жиро-

растворимых антиоксидантов (ACL) плазмы кро-

0.0

ви мышей. Эти результаты приведены на рис. 4а.

III

V VI VII VIII

Номер группы

Видно, что у контрольных мышей, содержа-

1.4

(б)

щихся на общевиварном рационе, ACL плазмы

крови уменьшилась за три месяца проведения

1.2

эксперимента более чем в шесть раз (группы I и

1.0

VIII). Это объясняется старением животных и

0.8

снижением уровня ACL [38, 39]. Все используе-

мые водорастворимые нанокомплексы увеличи-

0.6

вали ACL липидов плазмы крови мышей по срав-

0.4

нению с соответствующим контролем (группа

0.2

VIII). Это связано, как и предполагалось, с нали-

чием в нанокомплексах жирорастворимых анти-

0.0

III

V VI VII VIII

оксидантов, накапливающихся при постоянном

Номер группы

приеме в липидах плазмы крови. Наибольший

2.5

(в)

эффект наблюдался у животных группы II, для

которых уровень ACL статистически достоверно

2.0

не отличался от уровня у контрольных молодых

мышей. Вероятно, это связано с накоплением в

1.5

липидах плазмы крови альфа-токоферола, не-

большое количество которого содержалось в ФХ,

1.0

использованном для приготовления исходных

липосом. Не исключено, что усвоение альфа-то-

0.5

коферола из плазмы крови органами животных

группы II идет медленнее, чем у мышей, прини-

III

V VI VII VIII

мающих более сложные нанокомплексы, создан-

Номер группы

ные на основе того же ФХ. Сравнивая между со-

бой эффективность других нанокомплексов,

Рис. 4. Сравнительные диаграммы суммарной АОА

можно отметить, что на фоне всех остальных вы-

жирорастворимых компонентов (ACL) плазмы крови

деляются по степени увеличения (в полтора-два

(а), печени (б) и мозга (в); * - p < 0.05 по отношению

раза) ACL группы V (ФХ:ЭМГ:Каз-Na=1:0,02:10)

к контрольной группе VIII.

и группы VII (ФХ:РЖ:ЭМГ:Каз-Na = 1:1:0,02:20)

c диетой, содержащей ЭМГ и Каз-Na. ACL плаз-

ции к снижению ACL у возрастных животных

мы крови мышей группы VII, отличавшейся от

(группа VIII), достоверном уменьшении ACL в

группы V дополнительным приемом рыбьего жи-

группах II (ФХ) и III (ФХ:ЭМГ = 1:0,02) и сохра-

ра, была выше, что, вероятно, объясняется нали-

нении того же уровня ACL, что и в контроле

чием в рыбьем жире некоторых жирораствори-

(группа VIII), в группах с IV по VII. По-видимому,

мых антиоксидантов. Сопоставляя влияние

уменьшение уровня АОА липидов в группах II и

используемых диет на АОА водо- и жирораство-

III можно связать с конкурентными взаимодей-

римых антиоксидантов плазмы крови, можно

ствиями введенных с диетой экзогенных антиок-

сделать заключение о их противоположном дей-

сидантов и эндогенных антиоксидантов, содер-

ствии: эффективность водорастворимых антиок-

жание которых в печени достаточно высокое [1, 2,

сидантов снижается или не изменяется, в то вре-

38, 39]. Ранее нами было установлено, что хрони-

мя как АОА липидной компоненты возрастает.

ческое введение антиоксидантов иногда может

Изменения ACL липидов печени мышей, при-

приводить к снижению АОА именно в печени [1,

веденные на рис. 4б, свидетельствуют о тенден-

2, 40]. Эвгенол, входящий в состав ЭМГ, в высо-

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

766

САЖИНА и др.

ких концентрациях также может выступать как

комплексов, состоящих из липосом ФХ с ЭМГ,

прооксидант и инициатор перекисного окисле-

покрытых белковой оболочкой, способствует,

ния липидов [41, 42].

по-видимому, лучшей доставке антиоксидантов

из липосом в клетки мозга и препятствует их рас-

Для липидов мозга видно (рис. 4в), что, как и в

ходованию в процессах перекисного окисления

плазме крови, ACL у контрольных мышей группы

липидов. При использовании липосом, состоя-

VIII достоверно снижена по сравнению с группой

щих из одного ФХ (группа II), мы наблюдали зна-

I, хотя и не столь значительно (примерно в полто-

чительное увеличение АОА плазмы крови при от-

ра раза), что также можно объяснить возрастны-

сутствии изменений в головном мозге. Данное

ми изменениями [38, 39]. Действие всех наноком-

различие можно объяснить незначительным

плексов приводило к увеличению ACL по отно-

включением этих липосом в липиды мозга, но за-

шению к контролю (группа VIII). Если для групп

метным накоплением в плазме крови. Переход к

II (ФХ), III ( ФХ+ЭМГ) и VI (ФХ+РЖ+Каз-Na)

более сложным диетам, содержащим, наряду с

это было только тенденцией, то в группах IV

ФХ, ЭМГ и Каз-Na (группы V и VII), приводит к

(ФХ+Каз-Na), V (ФХ:ЭМГ:Каз-Na=1:0,02:10) и

увеличению и АОА липидов плазмы крови, и

VII (ФХ:РЖ:ЭМГ:Каз-Na = 1:1:0,02:20) наблюда-

АОА головного мозга. Это хорошо коррелирует с

лось статистически достоверное увеличение дан-

нашими данными, полученными при окислении

ного параметра; при этом значения ACL у мышей

этих липосом in vitro: именно сочетание ЭМГ и

групп V и VII в два-три раза превышали уровень

Каз-Na вызывало синергетическое увеличение

ACL в остальных группах животных.

периода индукции на кривых окисления [43].

Сопоставляя влияние различных липосомных

Возможно, что в головном мозге мышей групп V

нанокомплексов на АОА липидов различных ор-

и VII работают оба фактора - облегчение транс-

ганов экспериментальных животных (плазма

порта липосом с антиоксидантами и синергизм в

крови, печень и головной мозг), можно отметить

действии ЭМГ и Каз-Na.

следующие закономерности: в течение 92 суток

проведения эксперимента АОА липидов всех ис-

следуемых органов животных, содержащихся на

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

общевиварном рационе (группы I и VIII), умень-

шалась, хотя и в различной степени, а наиболь-

В работе методом термоинициированной хе-

шие изменения происходили в липидах плазмы

милюминесценции было проведено исследова-

крови. Это уменьшение можно объяснить воз-

ние изменения антиокислительной активности

растными изменениями [38, 39]. Использование в

водорастворимых и липидных компонентов плаз-

диетах мышей липосомных комплексов приводи-

мы крови мышей, а также АОА липидов их пече-

ло к увеличению АОА липидов плазмы крови и

ни и мозга в зависимости от состава водораство-

головного мозга, приближая эту величину к уров-

римых липосомных нанокомплексов, включен-

ню, характерному для молодых особей (группа I),

ных в комплексную диету мышей на протяжении

или даже превышая его (головной мозг мышей

92 суток.

групп V и VII). Это, безусловно, является положи-

тельным моментом, так как связано с повышени-

По результатам можно сделать вывод, что дие-

ем устойчивости данного органа к повреждаю-

та мышей с водорастворимой добавкой инкапсу-

щим воздействиям. Следует отметить, что ранее

лированных Каз-Na липосом из соевого ФХ с до-

аналогичные качественные данные были получе-

бавлением в них рыбьего жира и включением

ны в работе [19] при шестимесячном введении

ЭМГ оказалась самой эффективной в отношении

мышам ЭМГ в виде водной взвеси. Однако в на-

ACL плазмы крови, а также значительно увеличи-

ших экспериментах получился больший эффект,

вала АОА липидов мозга мышей по сравнению с

особенно при использовании диет, в которых на-

контролем. Это дает основание рекомендовать

ряду с антиоксидантами (α-токоферолом и ЭМГ)

такие липосомные нанокомплексы в качестве

содержался Каз-Na (группы IV, V и VII). В случае

же групп V и VII можно предположить, что это

функциональных добавок для практического ис-

увеличение объясняется накоплением как в моз-

пользования.

ге, так и в плазме крови мышей жирорастворимо-

го антиоксиданта, коим является эвгенол из гвоз-

дичного масла [41-43]. В липосомной диете, со-

БЛАГОДАРНОСТИ

держащей рыбий жир, из него, кроме омега-3 и

Авторы благодарят д-ра И.Н. Попова (НИИ

других жирных кислот, в клетки мозга попадает

антиокислительной терапии, Берлин, Германия)

еще один антиоксидант, а именно жирораствори-

за научно-техническую поддержку этой работы,

мый витамин А. Омега-3 в сочетании с α-токофе-

выполненной в рамках договора о сотрудничестве

ролом могут «включать» также клеточные сиг-

нальные пути, ведущие к увеличению активности

между ИБХФ РАН и НИИ АТ, и критическое

антиоксидантных ферментов [44]. Использова-

прочтение рукописи. Мы благодарим также ком-

ние в диете водорастворимых липосомных нано-

панию Oxidaq UG Ltd (Берлин, Германия) за

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ЛИПОСОМНЫХ КОМПЛЕКСОВ

767

19. T. A. Misharina, L. D. Fatkullina, E. S. Alinkina, et al.,

предоставление нам прибора Minilum^® и необхо-

Prikl. Biokhim. Mikrobiol. 50 (1), 101 (2014).

димых реактивов.

20. K. J. Valentini, C. A. Pickens, J. A. Wiesinger, and

J. I. Fenton, Int. J. Food Sci. Nutrition 69 (6), 705

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

(2018).

Исследование не имело спонсорской под-

21. A. Balcerezyk, A. Gajewska, E. Macierzynska-Pi-

держки.

otrowska, et al., Molecules 19, 14794 (2014).

22. S. S. Teh, S. H. Mah, S. W. Gouk, et al., J. Food Nutr.

Res. 6 (1), 39 (2018).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

23. T. G. Blaigh and W. J. Dyer, Can. J. Biochem. Physiol.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

37, 911 (1959).

интересов.

24. M. Кейтс, Техника липидологии. Выделение, анализ и

идентификация липидов (Мир, М., 1975).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

25. http://www.minilum.de.

Все применимые международные, националь-

26. I. Popov and G. Lewin, LABO 11, 8 (1997).

ные и институциональные принципы ухода и ис-

27. I. Popov and G. Lewin, Luminescence 20, 321 (2005).

пользования животных при выполнении работы

28. I. Popov and G. Lewin, in Handbook of chemilumines-

были соблюдены.

cent methods in oxidative stress assessment, Ed. by

I. Popov and G. Lewin (Transworld Research Net-

work, Kerala, 2008), pp. 361-391.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

29. Н. Н. Сажина, И. Н. Попов и В. Н. Титов, Клин.

1. Е. Б. Бурлакова, А. В. Алесенко, Е. М. Молочкина

лабор. диагн. 63 (1), 16 (2018).

и др., Биоантиоксиданты в лучевом поражении и

злокачественном росте (Наука, М., 1975).

30. М. М. Созарукова, А. М. Полимова, Е. В. Прос-

2. Е. Б. Бурлакова и Н. П. Пальмина, Вопр.

курнина и Ю. А. Владимиpов, Биофизика 61 (2),

онкологии 36 (10), 1155 (1990).

337 (2016).

3. Е. Б. Бурлакова, Успехи химии 44 (10), 1871 (1975).

31. Ю. О. Теселкин, И. В. Бабенкова и А. Н. Осипов,

4. Е. Б. Бурлакова, Г. Ф. Иваненко и Л. Н. Шишкина,

Биофизика 64 (5), 883 (2019).

Изв. АН СССР. Сер. биол., № 4, 588 (1985).

32. M. L. Sagristá, A. E. García, M. A. De Madariaga, and

5. I. Popov, G. Lewin, G. Matthes, et al., Z. Klin. Med.

M. Mora, Free Radic. Res. 36 (3), 329 (2002).

43, 1663 (1988).

33. Е. А. Менгеле, Д. А. Круговов и О. Т. Касаикина,

6. I. Popov, M. Popov, and G. Lewin, in Free Radicals and

Изв. РАН. Сер. хим. 4 (1), 1 (2015).

Oxidative Stress: Chemistry, biochemistry and pathophys-

iological implications, Ed. by D. Galaris (Medimond,

34. Ю. А. Владимиров и Е. В. Проскурнина, Успехи

Ioannina, 2003), pp. 219-223.

биол. химии 49, 341 (2009).

7. И. Н. Попов и Г. Левин, Биофизика 58 (5), 848

35. Ю. А. Владимиров, Соросовский образоват. журн.

(2013).

7 (1), 16 (2001).

8. Е. Б. Бурлакова и Н. Г. Храпова, Успехи химии 54

(9), 907 (1985).

36. R. B. Hebbel and J. Lab. Clin. Med. 107, 401 (1986).

9. Е. Б. Бурлакова, С. А. Крашаков и Н. Г. Храпова,

37. G. Lewin and I. Popov, Med. Hypoth. 42, 269 (1994).

Биол. мембраны 15 (2), 161 (1998).

38. Е. Б. Бурлакова, Е. М. Молочкина, Н. П. Пальми-

10. S. Dhavamani, Y. P. C. Rao, and B. R. Lokesh, Food

на и Л. В. Слепухина, Вопр. мед. химии 22 (4), 541

Chem. 164, 551 (2014).

(1976).

11. R. K. Saini and Y.-S. Keum, Life Sci. 203, 255 (2018).

39. Н. П. Пальмина, Л. К. Обухова и Т. В. Бунто, Изв.

12. N. R. Fuentesa, E. Kima, Y.-Y. Fana, and R. S. Cha-

АН СССР. Сер. биол. 2, 290 (1979).

pkina, Mol. Aspects of Medicine 64, 79 (2018).

13. R. J. T. Mocking, J. Assies, H. G. Ruhé, and

40. Е. Б. Бурлакова, Н. М. Дзюба и Н. П. Пальмина,

A. H. Schene, J. Inherited Metab. Dis. 41, 597 (2018).

Биофизика 1 (5), 766 (1965).

14. M. Simonetto, M. Infante, R. L. Sacco, et al., Nutri-

41. T. Atsumi, S. Fujisawa, and K. Tonosaki, Toxicol. In

ents 11, 2279 (2019).

Vitro 19,1025 (2005).

15. G. C. Candela, L. L. M.Bermejo, and K. V. Loria, Nu-

42. D. P. Bezerra, G. C. G. Militão, M. Castro de Morais

tric. Hospital 26 (2), 323 (2011).

and D. Pergentino de Sousa, Nutrients 9, 1367 (2017).

16. М. Г. Семёнова, А. С. Антипова, Н. П. Пальмина и

др., Хим. физика 38 (12), 38 (2019)

43. N. N. Sazhina, A. S. Antipova, M. G. Semenova, and

N. P. Palmina, Russ. J. Bioorgan. Chem. 45 (1), 34

17. М. G. Semenova, A. S. Antipova, D. V. Zelikina, et al.,

(2019).

Food Res. Intern. 88, 70 (2016).

18. R. S. Jope, D. J. Jenden, C. S. Subramanian, et al., Bio-

44. R. Rodrigo, J. C. Prieto, and R. Castillo, Clin. Sci. 124,

chem. Pharmocol. 33 (5), 793 (1984).

1 (2013).

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

768

САЖИНА и др.

The Influence of Liposomal Nanocomplex Composition on Antioxidant Activity

of Mice Blood Plasma, Liver and Brain Lipids

N.N. Sazhina, M.G. Semenova, A.S. Antipova, E.I. Martirosova, and N.P. Palmina

Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, Kosygina str. 4, Moscow, 119334 Russia

Much attention is currently given to research and development of the efficient systems for the delivery of es-

sential omega-3-polyunsaturated fatty acids and other nutraceuticals to the human body through food.

Nanocomplexes, which are based on soybean phosphatidylcholine liposomes with nutraceuticals included

are amongst the efficient delivery systems. The prolonged use of these nanocomplexes may affect the anti-

oxidant status in various organs and tissues. In this work, a thermo-initiated chemiluminescence method was

used to study changes in the antioxidant activity of blood plasma, liver and brain lipids in mice divided into

six groups depending on the composition of liposomal nanocomplexes introduced into drinks substituted for

water in a long-term (3 months) diet. The components of six types of liposomal nanocomplexes, except for

phosphatidylcholine, in different combinations were: clove essential oil, fish oil and sodium caseinate. The

results of the study showed that nanocomplexes containing liposomes from phosphatidylcholine with the ad-

dition of fish oil, clove essential oil and treated with milk protein (sodium caseinate) for food encapsulation

purposes proved to be the most effective in increasing the antioxidant activity in blood plasma and brain lipids

in mice as compared to control.

Keywords: functional nutraceuticals, liposomes, clove essential oil, fish oil, sodium caseinate, antioxidant, antiox-

idant activity, chemiluminescence

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020