БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 4, с. 769-772

БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ

УДК 577.3

ОЦЕНКА БИОРАСПРЕДЕЛЕНИЯ МАГНИТОЛИПОСОМ

В ОПУХОЛИ И ОРГАНАХ МЫШЕЙ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОННОГО

ПАРАМАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА

А.С. Татиколов*, А.Н. Голощапов*, А.Ф. Ванин**

*Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва, ул. Косыгина, 4

**Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН,

119334, Москва, ул. Косыгина, 4

E-mail: serezhenkov@yandex.ru

Поступила в редакцию 07.04.2020 г.

После доработки 07.04.2020 г.

Принята к публикации 17.04.2020 г.

Методом спектроскопии электронного парамагнитного резонанса впервые изучено биораспреде-

ление магнитолипосом, полученных на основе наночастиц магнетита (Fe₃O₄), в опухоли и органах

мышей с карциномой Льюис в отсутствие и в присутствии магнитного поля. Животных в опытной

группе после внутривенного введения магнитолипосом в дозе 7.56 мг Fe/кг в зоне опухоли подвер-

гали воздействию внешнего магнитного поля (0.6 Тл). На основании анализа спектров электронно-

го парамагнитного резонанса образцов органов и тканей мышей обнаружено, что воздействие маг-

нитного поля приводит к двукратному возрастанию концентрации наночастиц магнетита в опухоли

(p < 0.05) по сравнению с контролем, что дает основание рекомендовать полученные магнитолипо-

сомы для использования в качестве магнитоуправляемого носителя для адресной доставки проти-

воопухолевых средств. Высокая концентрация суперапарамагнитных наночастиц магнетита обна-

ружена в печени в отсутствие и в присутствии внешнего магнитного поля. Отличия в накоплении

Fe₃O₄ в легких и печени в присутствии магнитного поля статистически незначимы.

Ключевые слова: ЭПР, наночастицы магнетита, SPIONs, МЛП, магнитное поле, биораспределение,

карцинома Льюис.

DOI: 10.31857/S0006302920040195

кой токсичностью, более того, SPIONs на основе

С развитием нанотехнологий возрастает инте-

наночастиц магнетита (Fe₃O₄) являются един-

рес к наноразмерным материалам. Особое внима-

ние уделяется применению суперапарамагнит-

ственными магнитными наночастицами, разре-

ных наночастиц магнетита (SPIONs) на основе

шенными для клинического применения [5].

оксидов железа для биомедицины: магнитного

Инкапсулирование наночастиц Fe₃O₄ в липосо-

концентрирования и сепарации клеток, иммуно-

мы — эффективное средство предотвращения их

логического анализа, сверхвысокочастотной ги-

агрегации, способствует доставке лекарственных

пертермии опухолей [1, 2]. Представляет интерес

средств в клетки-мишени. Имеется и другой не-

использование SPIONs в качестве контрастирую-

маловажный аспект: в составе магнитолипосом

щих агентов в магниторезонансной томографии

(МЛП) наночастицы Fe₃O₄ сохраняют свои маг-

для визуализации опухолей и в качестве магнито-

нитные свойства. Работ по изучению биораспре-

управляемых носителей [3, 4] для адресной до-

деления МЛП на основе наночастиц магнетита у

ставки лекарственных средств. Целевая доставка

животных-опухоленосителей методом электрон-

лекарственных средств позволяет создать депо

ного парамагнитного резонанса (ЭПР) практиче-

препарата в клетках опухоли и существенно по-

ски нет. Из исследований в этом направлении

низить негативное влияние на организм за счет

представляет интерес работа [6], в которой мето-

уменьшения вводимой дозы. Возможность при-

дом ЭПР обнаружено увеличение накопления на-

менения SPIONs в клинике обусловлена их низ-

ночастиц магнетита в глиобластоме у мышей по-

сле воздействия на опухоль внешнего магнитного

Сокращения: SPIONs - суперапарамагнитные наночасти-

цы магнетита, МЛП - магнитолипосомы, ЭПР - элек-

поля (МП) индукцией 0.4 Тл, а также работа [7], в

тронный парамагнитный резонанс, МП - магнитное поле.

которой под действием внешнего магнитного по-

769

770

МАРНАУТОВ и др.

ля обнаружено повышение концентрации магни-

лы ЭПР образцов регистрировали на спектромет-

толипосомального доксорубицина в остеосарко-

ре ECS-106 (Brucker, Германия) при 77 К [10].

ме у хомячков.

Условия регистрации ЭПР спектров: усиление

Целью данной работы является исследование

5 ⋅ 10²-5 ⋅ 10⁴, центр поля 3300 Гс, развертка поля

количественного биораспределения МЛП, полу-

6500 Гс, амплитуда модуляции 11.4 Гс.

ченных на основе наночастиц магнетита, в опухо-

Опыты на мышах-опухоленосителях. Магнито-

ли и органах мышей с карциномой Льюис мето-

липосомальную композицию вводили поло-

дом ЭПР в присутствии и в отсутствие воздей-

ствия на опухоль внешнего магнитного поля для

возрелым мышам самцам линии C57Bl/6 массой

оценки возможности их использования в каче-

20-22 г с внутримышечно привитой карциномой

стве магнитоуправляемых переносчиков для ад-

Льюис в хвостовую вену в дозе 7.56 мг Fe/кг спу-

ресной доставки противоопухолевых средств.

стя 10 суток после трансплантации опухоли. Че-

рез 60 мин после введения животных декапитиро-

вали; образцы легких, печени и опухолевой ткани

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

замораживали и хранили в жидком азоте. Полу-

Синтез наночастиц магнетита. Наночастицы

ченные образцы органов и тканей мышей анали-

Fe₃O₄синтезировали высокотемпературным раз-

зировали методом ЭПР.

ложением ацетилацетоната железа (III) Fe(AcAc)₃

Опухоли мышей в первой группе с магнитоли-

в триэтиленгликоле [8]. Размер частиц в зависи-

посомальной композицией не подвергали воз-

мости от условий синтеза находится в диапазоне

действию магнитного поля (контроль), во второй

от 3 до 9 нм.

группе мышей (опыт) сразу после введения пре-

парата область локализации опухоли подвергали

Синтез магнитолипосом на основе наночастиц

воздействию магнитного поля с использованием

магнетита. МЛП получали модификацией метода

постоянного магнита индукцией 0.6 Тл в течение

регидратации тонких фосфолипидных пленок

60 мин.

[9], состоящего в проведении трехкратной проце-

дуры оттаивания-озвучивания-замораживания,

Статистическую обработку данных осуществ-

с включением наночастиц Fe₃O₄во внутренний

ляли с использованием программного обеспече-

объем МЛП. Очистку МЛП от липосом, не содер-

ния Open Office, SciDaVis, R и Statistica. Опыты

жащих наночастицы, осуществляли с помощью

проводили с трехкратным повтором, в каждой

магнитной сепарации на постоянном магните с

группе было три-пять мышей. Для оценки разли-

индукцией 0.6 Тл, (t = 4 ч, T = 4°С). Невключен-

чий между группами использовали U-тест Ман-

ные наночастицы Fe₃O₄удаляли центрифугиро-

на-Уитни-Уилкоксона.

ванием (1500 g, t = 15 мин, T = 4°С). Концентра-

цию железа в образце определяли методом атом-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

но-абсорбционной

спектроскопии

после

растворения аликвоты анализируемого образца в

На рис. 1а представлена электронная микро-

концентрированной соляной кислоте (37%). Эф-

фотография наночастиц Fe₃O₄, на врезках приве-

фективность инкапсуляции наночастиц Fe₃O₄ в

дены электронная дифрактограмма и размерное

МЛП составила 24.2 ± 2.8%. Размер МЛП соста-

распределение наночастиц, полученное методом

вил 158.7 ± 24.9 нм.

динамического светорассеяния; на рис. 1б пред-

ставлено размерное распределение МЛП на ос-

Трансплантация карциномы. Трансплантацию

нове Fe₃O₄, на врезке - электронная микрофото-

карциномы Льюис осуществляли путем внутри-

графия МЛП на их основе.

мышечной инокуляции опухолевых клеток в бед-

ро правой лапы, каждой мыши вводили по 0.2 мл

Полученные наночастицы имеют форму,

близкую к сферической, с диаметром частиц

20%-й взвеси опухолевых клеток в среде 199.

7.26 ± 1.17 нм. Средний размер наночастиц, изме-

ЭПР-спектры. Для определения концентра-

ренный методом динамического светорассеяния,

ции МЛП в образцах биологических тканей пред-

составил 14.5 ± 2.9 нм (рис. 1a). Размер МЛП на

варительно строили калибровочную прямую за-

их основе, определенный методом динамическо-

висимости интегральной интенсивности сигнала

го светорассеяния, составил

158.7

± 24.9 нм

ЭПР при g = 2.21 от концентрации МЛП в пере-

(рис. 1б).

счете на железо. Концентрацию суперапарамаг-

Для оценки биораспределения МЛП в опухоли

нитных наночастиц Fe₃O₄ в тканях рассчитывали

и органах мышей-опухоленосителей использова-

по калибровочной прямой, используя метод

ли спектры ЭПР образцов биологических тканей.

двойного интегрирования спектров ЭПР. Сигна-

На рис. 2 представлены примеры ЭПР-спектров

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

ОЦЕНКА БИОРАСПРЕДЕЛЕНИЯ МАГНИТОЛИПОСОМ

771

(а)

(б)

100

Размер частиц, нм

00 нм

100

1000

10000

100 нм

Размер частиц, нм

Рис. 1. (а) - Микрофотография наночастиц Fe₃O₄ (d = 7.26 ± 1.17 нм) и их размерное распределение; (б) - размерное

распределение и микрофотографии магнитолипосом, синтезированных на основе наночастиц Fe₃O₄.

печени и опухолевой ткани после внутривенного

МП концентрация Fe₃O₄ в опухоли возрастает не

введения МЛП.

менее чем в два раза по сравнению с концентра-

цией в отсутствие поля (p < 0.05). Отличия в на-

На основании полученных ЭПР-спектров

коплении Fe₃O₄ в легких и печени в присутствии

опухолевой ткани и печени (рис. 2), а также дру-

МП статистически незначимы.

гих органов были рассчитаны концентрации

МЛП (в пересчете на железо) в опухоли и органах

(таблица).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Максимальная концентрация Fe₃O₄ после

В работе методом ЭПР впервые изучено коли-

внутривенного введения МЛП обнаружена в пе-

чественное биораспределение МЛП на основе су-

чени как в отсутствие, так и в присутствии внеш-

перпарамагнитных наночастиц Fe₃O₄, в опухоли

него магнитного поля (таблица). Накопление

и органах мышей с карциномой Льюис после

МЛП в печени характерно для наноразмерных

внутривенного введения. Показано, что воздей-

липосомальных структур [11]. После воздействия

ствие внешнего магнитного поля (0.6 Тл) на зону

опухоли приводит к двукратному возрастанию

концентрации наночастиц Fe₃O₄ МЛП в опухоли

g =2.32 2.006

(p < 0.05), что дает основание рекомендовать по-

лученные МЛП в качестве магнитоуправляемых

переносчиков для адресной доставки противо-

опухолевых средств.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена по теме Государственного

задания

№

44.2

(№ гос. регистрации

001201253311).

200

300

400 мТл

Рис. 2. ЭПР-спектры (Т = 77 К) печени (1 и 2) и

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

опухолевой ткани

(3 и

4) через

60 мин после

внутривенного введения магнитолипосом: 1 - печень

без магнита, 2 - печень с магнитом, 3 - опухоль без

Авторы декларируют отсутствие конфликта

магнита, 4 - опухоль с магнитом.

интересов при написании данной статьи.

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

772

МАРНАУТОВ и др.

Концентрации МЛП (в пересчете на железо) в печени, опухоли и легких мышей с карциномой Льюис через

60 мин после внутривенного введения МЛП

Концентрация MЛП, мкМ (среднее ± ст. откл.)

печень

опухоль

легкие

Внутривенное введение

1891 ± 300

66 ± 12

57 ± 9

Внутривенное введение + внешнее

2121 ± 393

140 ± 22

66 ± 8

МП (0.6 Тл)

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

5. A. C. Anselmo and S. Mitragotri, AAPS J. 17 (5), 1041

(2015). DOI: 10.1208/s12248-015-9780-2

Все процедуры с животными осуществляли в

6. H. Marie, L. Lemaire, F. Franconi, et al., Adv. Func-

строгом соответствии с Европейской Конвенци-

tion. Mat.

(8),

1258

(2015). DOI:10.1002/ad-

ей по защите позвоночных животных, используе-

fm.201402289

мых для экспериментов или в иных научных це-

7. H. Nobuto, T. Sugita, T. Kubo, et al., Int. J. Cancer 109

лях (1997).

(4), 627 (2004). DOI:10.1002/ijc.20035

8. Л. Х. Комиссарова, Н. А. Марнаутов, А. С. Татико-

лов и др., Технологии живых систем 14 (4), 51

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

(2017).

1. J. Gao, H. Gu, and B. Xu, Accounts Chem. Res. 42 (8),

9. C. Kirby and G. Gregoriadis, Nat. Biotechnol. 2 (11),

1097 (2009). DOI: 10.1021/ar9000026

979 (1984). DOI: 10.1038/nbt1184-979

10. T. S. Kavetskyy, V. A. Serezhenkov, et al., in Advanced

2. L. Mohammed, H. Gomaa, D. Ragab, et al., Particuol-

Nanotechnologies for Detection and Defence against

ogy 30, 1 (2017). DOI: 10.1016/j.partic.2016.06.001

CBRN Agents (Springer, Dordrecht, 2018), pp. 487-

3. K. Ulbrich, K. Holá, V. Šubr, et al., Chem. Rev. 116

492.

(9), 5338 (2016). DOI: 10.1021/acs.chemrev.5b00589

11. M. J. Ernsting, M. Murakami, A. Roy, et al., J. Con-

4. J. Estelrich, M. J. Sánchez-Martín, and M. A. Busquets,

trolled Release

172

(3),

782

(2013). DOI:

Int. J. Nanomed. 10, 1727 (2015). DOI:10.2147/ijn.s76501

10.1016/j.jconrel.2013.09.013

Evaluation of the Biodistrubution of Magnetoliposomes in Murine Tumor

and Mice Organs Using Electron Spin Resonance

N.A. Marnautov*, V.A. Serezhenkov**, L.Kh. Komissarova*, N.A. Tkachev**,

A.S. Tatikolov*, A.N. Goloshchapov*, and A.F. Vanin**

*Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, ul. Kosygina 4, Moscow, 119334 Russia

**Semenov Federal Research Center of Chemical Physics, Russian Academy of Sciences, ul. Kosygina 4, Moscow, 119334 Russia

Electron spin resonance spectroscopy has been applied for the first time to study the biodistribution of mag-

netoliposomes, formed with the use of magnetite nanoparticles (Fe₃O₄), in a murine tumor and the organs

of Lewis carcinoma-bearing mice in the absence and presence of an external magnetic field. Animals from

the experimental group after intravenous injection of 7.56 mg/kg of magnetoliposomes the tumor area were

subjected to an external magnetic field with a flux density of 0.6 T. Electron spin resonance spectra analysis

of mice organs and tissues samples has shown that exposure to a magnetic field results in a two-fold increase

in Fe₃O₄ accumulation within the tumor (p < 0.05) as compared to control. These findings suggest that mag-

netoliposomes can be used as a magnetic-targeted carriers for antitumor drug delivery. SPIONs a high con-

centration was found in the liver in the absence and presence of the external magnetic field. Differences in

the accumulation of Fe₃O in the lung and liver tissues in the presence of a magnetic field are not statistically

significant.

Keywords: ESR, magnetite nanoparticles, SPIONs, MLP, magnetic field, biodistribution, Lewis carcinoma

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020