БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 4, с. 780-791

БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ

УДК 577.3

ОЦЕНКА СОХРАННОСТИ МИОКАРДА КРЫСЫ И ИЗОЛИРОВАННОГО

СЕРДЦА БАРАНА ПОСЛЕ ПРОЛОНГИРОВАННОЙ 24-ЧАСОВОЙ

ГИПОТЕРМИЧЕСКОЙ КОНСЕРВАЦИИ ПОД ДАВЛЕНИЕМ ГАЗОВОЙ

СМЕСИ НА ОСНОВЕ МОНООКСИДА УГЛЕРОДА

Н.В. Шишова*, Н.Э. Швирст*, М.В. Гольтяев*, А.Л. Ковтун***

*Институт биофизики клетки РАН - обособленное подразделение ФИЦ «Пущинский научный центр биологических

исследований РАН», 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3

E-mail: eugeny.ef@gmail.com

**НМИЦ трансплантологии и искусственных органов им. ак. В.И. Шумакова Минздрава РФ,

123182, Москва, Щукинская ул., 1

***Фонд перспективных исследований, 121059, Москва, Бережковская наб., 22/3

Поступила в редакцию 08.05.2020 г.

После доработки 08.05.2020 г.

Принята к публикации 15.05.2020 г.

Подтверждены высокие органопротективные свойства газовой смеси на основе монооксида

углерода СО и кислорода при пролонгированной 24-часовой гипотермической консервации сердца

при 4°С. Показано, что консервация под давлением 6 атм смеси СО и О₂ обеспечивает эффективное

восстановление сократительной активности изолированного сердца крысы после 24-часового

хранения. Продолжительность работы сердца на стенде после реперфузии не отличалась от

интактного контроля, зоны поврежденного миокарда при окрашивании трифенилтетразолием

хлоридом отсутствовали. Исследование сократительной активности папиллярных мышц сердца в

ответ на электрическую стимуляцию показало высокую функциональную сохранность ткани. В

опытной группе зависимость «частота-сила», выраженность эффекта потенциации паузой и ответ

на стимуляцию изопротеренолом в целом соответствовали нормальному миокарду крысы. Впервые

газовая консервация успешно использована для сердца барана, по размерам и массе сравнимому с

сердцем человека. Во всех экспериментах в опытной группе сокращения сердца самопроизвольно

восстановились после начала перфузии. Результаты гистологического анализа не показали

значительных различий в сердцах барана контрольной и опытной групп. Миокард опытной группы

сохранял нормальную структуру ткани. Достигнутый срок консервации 24 ч в четыре раза

превышает максимально разрешенные сроки стандартной холодовой консервации в

консервирующих растворах. Полученные результаты на модели сердца крупного лабораторного

животного подтверждают перспективность предлагаемого подхода для пролонгации хранения

сердца человека.

Ключевые слова: монооксид углерода, кислород, газ, орган, трансплантация, хранение, сердце, крыса,

баран, консервация, гипотермия.

DOI: 10.31857/S0006302920040213

Несмотря на достижения в области фармако-

ло трансплантаций накладывают как общая не-

терапии различных заболеваний, трансплантация

хватка органов из-за отсутствия доноров, так и

органа (почка, печень, сердце, легкие, поджелу-

малая длительность хранения трансплантатов,

дочная железа) остается для ряда больных един-

ограничивающая их транспортировку. Использу-

ственным методом лечения, существенно улуч-

емый в клинической практике метод сохранения

шающим качество и продолжительность жизни.

донорских органов, предназначенных для транс-

Ежегодно в мире выполняется около

140000

плантации человеку - статическая холодовая

трансплантаций [1], из них в России - порядка

консервация [3], которая не позволяет обеспе-

2200 трансплантаций [2]. При этом количество

чить их жизнеспособность и нормальную, про-

пациентов, ожидающих операции, как в России,

гнозируемую начальную функцию трансплантата

так и в мире в четыре-пять раз превышает количе-

при сроках консервации более 24 ч для почки,

ство проводимых операций. Ограничения на чис-

12 ч - для печени и 6 ч - для сердца [4]. При таких

780

ОЦЕНКА СОХРАННОСТИ МИОКАРДА КРЫСЫ

781

сроках хранения, особенно в отношении сердца,

боты стало подтверждение высоких органопро-

крайне затруднена логистика, в результате чего

тективных свойств газовой смеси на основе

становится невозможным осуществлять забор ор-

монооксида углерода при гипотермической кон-

гана в городах, удаленных от медицинских кли-

сервации на простых биологических моделях па-

ник, в которой осуществляется трансплантация.

пиллярной мышцы и изолированного сердца

По этой причине значительная часть и так огра-

крысы, а также исследование возможности мас-

ниченного донорского ресурса просто теряется.

штабирования подхода газовой консервации с

переходом от миокарда крысы массой 1.0-1.5 г к

В рамках работы по поиску новых научных

сердцу крупных лабораторных животных, сопо-

подходов к длительному хранению органов наше

ставимому по размеру и массе с сердцем человека

внимание привлекли тканевые газовые мессен-

(220-300 г).

джеры, такие как оксид азота (NO), сероводород

(H₂S) и монооксид углерода (CO). Данные моле-

кулы обладают высокой реакционной способно-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

стью, играют важную роль в регуляции различ-

Животные. Исследование выполнено на сам-

ных физиологических и патологических реакций

цах крыс линии Wistar массой 250 ± 20 г (n = 40) и

и способны влиять на метаболизм как при физио-

самцах баранов романовской породы массой

логической температуре, так и при гипотермии.

33 ± 4 кг (n

= 9), полученных из вивария

Кроме того, они легко проникают через клеточ-

ИБК РАН.

ные мембраны и обладают высокой скоростью

диффузии в тканях, а значит, будут легко прони-

Исследование папиллярной мышцы сердца кры-

кать в ткани трансплантата и легко удаляться из

сы. В исследование были включены две группы

них без специальных процедур.

животных. В контрольной группе «К» (n = 5) крыс

наркотизировали, выделяли сердце, выделяли

Среди газовых мессенджеров наиболее пер-

папиллярную мышцу и помещали ее в установку

спективным представляется монооксид углерода

для изучения сократительной активности в ответ

(СО). В литературе имеются данные об органо-

на электростимуляцию. В опытной группе (груп-

протекторных свойствах этого газа при тепловой

па «СО», n = 5) крыс наркотизировали, выделяли

и холодовой ишемии и об уменьшении негатив-

сердце, осуществляли консервацию и хранение

ных последствий ишемии/реперфузии [5-9]. В

сердца под давлением CО при 4°С в течение 24 ч,

отдельных работах приводятся данные о двух-

выделяли папиллярную мышцу и помещали ее в

трехкратном улучшении физиологических пока-

установку для изучения сократительной активно-

зателей сердечного и почечного трансплантата,

сти в ответ на электростимуляцию.

подвергшихся обработки монооксидом углерода

по сравнению с контролем [10, 11]. В то же время

Оценка сохранности изолированного сердца

информация о влиянии этого газа достаточно

крысы.

противоречива, что объясняется большими вари-

Оценка максимальной продолжительности ра-

ациями условий экспериментов. Так, в разных

боты сердца крысы на перфузионном стенде. В ис-

исследованиях используются концентрации СО

следование были включены три группы живот-

от десятков миллионных долей до повышенных

ных. В контрольной группе «К» (n = 5) крыс нар-

значений, обеспечиваемых давлением в 3-4 атм,

котизировали, выделяли сердце, помещали

различаются стадии воздействия (непосредствен-

сердце на стенд и реперфузировали оксигениро-

но перед извлечением органа, во время отключе-

ванным раствором Тироде, содержащим антиок-

ния кровотока или на стадии реперфузии in vivo

сидант пероксиредоксин-6 (далее раствором Ти-

или ex vivo), также варьирует форма введения СО

роде), при 37°С до полной остановки сокращений

(ингаляция, насыщение перфузионного раствора

с целью фиксировать максимальное время рабо-

газом, помещение органа в атмосферу газа, введе-

ты. В опытной группе «КСЛ» (n = 5) крыс нарко-

ние в раствор хранения либо в кровоток препара-

тизировали, выделяли сердце, осуществляли ста-

тов-доноров СО). В серии недавних работ [12, 13]

тическую холодовую консервацию в растворе

показана высокая сохранность трансплантатов

препарата «Кустодиол» (Др. Франц Кёлер Хеми

сердца и задней конечности крысы при (24+)-ча-

ГмбХ, Германия) и хранение сердца при 4°С в те-

совой холодовой консервации под давлением

чение 24 ч, помещали сердце на стенд и реперфу-

смеси монооксида углерода и кислорода.

зировали раствором Тироде при 37°С в течение

Нами ранее была произведена оценка опти-

3+ ч. В опытной группе «СО» (n = 5) крыс нарко-

мальной формы воздействия монооксидом угле-

тизировали, выделяли сердце, осуществляли кон-

рода на ткани сердца при гипотермической кон-

сервацию и хранение сердца под давлением газо-

сервации, а также исследованы возможные

вой смеси при 4°С в течение 24 ч, помещали серд-

варианты конструкции аппаратной базы, необхо-

це на стенд и реперфузировали раствором Тироде

димой для внедрения данного подхода в биоме-

при 37°С до полной остановки сокращений. Ста-

дицинскую практику [14]. Целями настоящей ра-

дию помещения на стенд и перфузии сердца для

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

782

ФЕСЕНКО (мл.) и др.

всех трех групп проводили одновременно в па-

1 мл из расчета 50 МЕ/мл. Спустя 5 мин проводи-

раллельных экспериментах.

ли продольную срединную стернотомию, осто-

рожно разводили ребра и вырезали сердце с ча-

Оценка инфарктной зоны. В исследование были

стью аорты длиной не менее 1 см. Сердце поме-

включены три группы животных: «К» (n = 5),

щали в охлажденный до 4°С раствор Тироде,

«КСЛ» (n = 5) и «СО» (n = 5). Эксперименты про-

вводили в аорту канюлю и фиксировали ее лига-

водили, как описано в предыдущем разделе, за

турой.

исключением того, что через 15 мин после начала

перфузии раствором Тироде сердца снимали со

Далее промывали сердце раствором Тироде

стендов, готовили срезы и проводили их

(36°С) на модифицированной двухконтурной

окрашивание на наличие инфарктных зон.

установке перфузии по Лангендорфу с двумя под-

ключенными термостатами MiniStat 230 (Huber,

Оценка сохранности изолированного сердца ба-

Германия) и двумя перистальтическими насоса-

рана. В исследование были включены две группы

ми LongerPump BT100-2J (Китай). После отмыв-

животных. В контрольной группе «К» (n = 4) ба-

ки сердца от крови проводили переключение пер-

ранов наркотизировали, выделяли сердце, поме-

фузии с теплового контура на холодовой, подво-

щали сердце на стенд и реперфузировали раство-

дили термостатирующую рубашку и в течение

ром Тироде, через 5-15 мин работы на стенде ре-

5 мин перфузировали сердце консервирующим

троградной перфузии сердце снимали и

раствором «Евро-Коллинз» (4°С) с добавлением

разрезали на сегменты, часть препаратов фикси-

антибиотика цефтриаксона (0.1 мг/мл). По до-

ровали в 10%-м формалине для последующего ги-

стижении состояния кардиоплегии сердце сни-

стологического анализа, часть препаратов окра-

мали вместе с канюлей с установки и помещали в

шивали на инфарктные зоны. В опытной группе

охлажденную до 4°С камеру.

СО (n = 5) баранов наркотизировали, выделяли

сердце, осуществляли консервацию и хранение

Наркотизацию баранов проводили в два этапа.

сердца под давлением газовой смеси при 4°С в те-

Внутримышечно вводили препарат «Ксила» из

чение 24 ч, затем помещали сердце на стенд и ре-

расчета 0.015 мл на 1 кг массы. Спустя 10 мин по-

перфузировали раствором Тироде. Далее прово-

сле наступления выраженного седативного эф-

дили забор материала как для контрольной груп-

фекта внутримышечно вводили препарат «Золе-

пы «К».

тил 100» из расчета 15 мг на 1 кг массы (во время

операции могли дополнительно вводить препарат

Исследование электрической сократимости па-

«Золетил» для поддержания анестезии). Наркоти-

пиллярной мышцы сердца крысы. После выделе-

зированное животное фиксировали на операци-

ния сердца (группа «К») либо после гипотермиче-

онном столе в положении на спине. Проводили

ского хранения (группа «СО») без предвари-

интубацию трахеи с последующим подключени-

тельного отогрева хирургически выделяли

ем животного к аппарату искусственной вентиля-

папиллярную мышцу с сухожилием и прилегаю-

ции легких. Проводили полную продольную сре-

щим фрагментом стенки желудочка. Мышцу за

динную стернотомию. Выделяли основные сосу-

сухожильную часть прикрепляли к механотрону

ды сердца (верхнюю и нижнюю полые вены,

6Х-2М (Россия), исследование проводили с по-

аорту и легочный ствол). Под полые вены подво-

мощью автоматизированной установки на основе

дили нить (шовный материал 3/0, 2/0) через ма-

персонального компьютера и плат АЦП-ЦАП

гистральную силиконовую трубку, концы нити

собственного производства. Препарат перфузи-

выводили из грудной полости. На нижнюю по-

ровали раствором Тироде (36°С) с помощью пе-

лую вену накладывали Z-образный шов и вводи-

ристальтического насоса со скоростью 2 мл/мин.

ли гепарин из расчета 300 ME на кг массы тела.

Раствор Тироде оксигенировали смесью О₂ (95%)

После удаления иглы шов затягивали. В аорту

и СО₂ (5%). Стационарную зависимость «часто-

вводили кардиоплегическую канюлю, дистальнее

та-сила» изучали в интервале частот от 0.003 до

сердца накладывали сосудистый зажим на аорту.

3 Гц. Эффект потенциации паузой исследовали

Затягивали лигатуры на полых венах и подавали

на фоне частоты стимуляции 1 Гц. Для анализа

холодный (4°С) раствор «Евро-Коллинз» с добав-

функционального ответа папиллярной мышцы

лением антибиотика цефтриаксона (0.1 мг/мл) до

на адренергическую стимуляцию вводили препа-

полной остановки сердечных сокращений (300-

рат изопротеренол в концентрации 1 мкМ. Ис-

400 мл/мин), сердце дополнительно обкладывали

следование проводили в течение 3+ часов.

льдом. После остановки сердца накладывали со-

Наркотизация животных, выделение сердца и

судистый зажим на нижнюю полую вену дисталь-

подготовка к консервации. Наркотизацию крысы

нее лигатуры, сердце деликатными ножницами

осуществляли смесью, состоящей из 20 мкл пре-

выделяли из грудной полости, пересекали полые

парата «Золетил 100» и 80 мкл препарата «Ксила».

вены, аорту, легочный ствол и легочные вены.

После достижения наркоза проводили продоль-

Сердце помещали в чашу с холодным раствором

ную срединную лапаротомию, далее в нижнюю

«Евро-Коллинз». В аорту вводили канюлю и на-

полую вену вводили раствор гепарина объемом

кладывали кисет (шовный материал 4/0), далее

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

ОЦЕНКА СОХРАННОСТИ МИОКАРДА КРЫСЫ

783

Газовая

смесь

Манометр

Газовая

смесь

НО₂

175

V ≈ 5533 см³

V ≈ 64 см³

Рис. 1. Схематичное изображение камер для гипотермического хранения сердца крыс и баранов.

орган помещали на марлевый столик в охлажден-

винчивали крышку и нагнетали газовую смесь,

ную до 4°С камеру.

состоящую из монооксида углерода и кислорода в

соотношении 4 : 3 при итоговом давлении в каме-

В дальнейшем после выделения сердца (см.

ре 6 атм (избыточное давление) (см. рис. 1). Далее

раздел «Результаты») в аорту и легочный ствол до-

камеру помещали на хранение в емкость, напол-

полнительно вводили стенты для фиксации

ненную водой, охлажденной до 4°С для стабили-

клапанов в открытом состоянии, из полостей

зации температуры, и помещали в холодильник с

сердца сливали раствор хранения для лучшего на-

температурой 4°С. После 24 ч камеру извлекали

сыщения газовой смесью. Затем в аорту вводили

из холодильника и проводили дегазацию, плавно

канюлю и накладывали кисет, далее орган поме-

в ручном режиме сбрасывая давление в течение

щали на марлевый столик в охлажденную до 4°С

15 мин до атмосферного.

камеру.

Реперфузия сердца лабораторных животных.

Консервация сердца. Камеры - малую для

Сердце крысы после гипотермического хранения

сердца крысы на основе химического реактора

подключали к установке ретроградной перфузии

Vivor (Premex, Швейцария) (материал - сталь)

по Лангендорфу. Затем промывали препаратом

или большую для сердца барана собственного из-

«Кустодиол» в течение 5 мин при 4°С со скоро-

готовления (материал - пластик) (рис. 1) - пред-

стью 6-8 мл/мин, далее переключали перфузию

варительно охлаждали до температуры 4°С. С це-

на тепловой контур с раствором Тироде (37°С) с

лью поддержания влажности в камере во время

пероксиредоксином-6 в концентрации 0.1 мг/мл.

консервации на дно наливали дистиллированную

Перфузию проводили со скоростью 8 ± 2 мл/мин.

воду до уровня в 1 см. После выделения сердца и

Раствор Тироде оксигенировали смесью О₂ (95%)

помещения его в камеру (сердце крысы подвеши-

и СО₂ (5%).

вали в камере за канюлю вставленную в аорту;

сердце барана помещали на марлевый столик)

Реперфузию сердца баранов осуществляли на

проводили продувку газовой рабочей смесью, с

марлевом столике путем подключения к аорте

целью вытеснения воздуха из камеры. Все работы

сердечно-легочного насоса от аппарата искус-

с газом выполняли под тягой. Далее плотно за-

ственного кровообращения Stockert (Германия).

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

784

ФЕСЕНКО (мл.) и др.

Вначале сердце промывали 800 мл раствора «Ку-

ния между группами «К» (1.8 ± 0.3 отн. ед.) и «CO»

стодиола» при 4°С со скоростью 200 мл/мин. Да-

(1.4 ± 0.2 отн. ед.) в ответ на введение бета-миме-

лее сердце перфузировали в течение 5-15 мин

тика.

раствором Тироде (37°С) со скоростью 300-

Оценка сохранности изолированного сердца

400 мл/мин с добавлением в первые минуты

крысы после 24-часовой гипотермической консер-

пероксиредоксина-6 (0.1 мг/мл). Раствор Тироде

вации под давлением газовой смеси на основе моно-

оксигенировали смесью О₂ (95%) и СО₂ (5%).

оксида углерода. Был проведен анализ трех экспе-

риментальных групп (рис. 4а) - группы «К» с ну-

Анализ инфарктной зоны сердца. После репер-

левым временем хранения, группы

«КСЛ» с

фузии в течение 5-15 мин сердца разрезали с по-

временем хранения 24 ч при температуре 4°С в

лучением срезов толщиной 2 мм. Полученные

стандартном для трансплантологической практи-

срезы выдерживали в 1%-м растворе хлорида три-

ки консервирующем растворе

«Кустодиол» и

фенилтетразолия в фосфатном буфере при 37°С в

группы «СО» с временем хранения 24 ч при тем-

течение 20 мин. Размер инфаркта измеряли с ис-

пературе 4°С под давлением газовой смеси на ос-

пользованием программного обеспечения ImageJ

нове монооксида углерода. Общее время работы

и выражали в процентах от общей площади ис-

сердца после помещения на стенд и проведения

следуемого образца.

ретроградной перфузии оксигенированным рас-

Гистологический анализ. Сердце барана фик-

твором Тироде в группах «К» и «СО» значимо не

сировали в растворе 10%-го формалина в течение

различалось, составив 195.3 ± 7.9 мин и 177.0 ±

24 ч. Далее проводили стандартную проводку ма-

14.8 мин соответственно (рис. 4в). В обеих груп-

териала с последующим заключением в парафи-

пах функциональная активность изолированного

новые блоки. Полученные на микротоме срезы

сердца постепенно и практически синхронно

окрашивали гематоксилином и эозином и три-

снижалась во времени: после одного часа работы

хромом по Массону. Далее проводили микроско-

наступала остановка желудочков, после трех ча-

пическое исследование полученных препаратов

сов - предсердий. В группе «КСЛ» не удалось за-

при увеличении ×400.

регистрировать возникновение функциональной

Статистическая обработка. Значения представ-

активности после разогрева на этапе помещения

лены как среднее ± стандартное отклонение. Зна-

на перфузионный стенд после гипотермической

чимость различий определяли с использованием

консервации. Ткань сердца визуально была более

t-критерия Стьюдента. Значения с p < 0.05 счита-

темной по сравнению с контролем. Анализ ин-

лись статистически значимыми. Обработку ре-

фарктных зон миокарда с помощью окрашивания

зультатов производили с использованием про-

трифенилтетразолием хлоридом (рис. 4б) через

граммного обеспечения SigmaPlot 12.5.

15 мин после реперфузии в группах «К» и «CO»

практически не выявил пораженных участков.

Кроме того, не было отмечено значимой разницы

РЕЗУЛЬТАТЫ

между обеими группами (группа «К» - 3.0 ± 1.3%,

Сократимость папиллярной мышцы сердца кры-

группа «СО» - 3.8 ± 1.5%). Напротив, в группе

сы после 24-часовой гипотермической консервации

«КСЛ» регистрировали обширные инфарктные

зоны, составившие 76.8 ± 8.3% от площади окра-

под давлением газовой смеси на основе монооксида

шивания.

углерода. Общее время работы с периодом адапта-

ции папиллярной мышцы в контроле и в опыте не

Оценка сохранности изолированного сердца

отличалось, составив 3.5 ± 0.3 ч. Уровень сокра-

барана после 24-часовой гипотермической консер-

тимости в контрольной и опытной группах укла-

вации под давлением газовой смеси на основе моно-

дывался в нормальное распределение силы со-

оксида углерода. Предварительная оценка про-

кращения у экспериментальных животных (1.0-

должительности работы контрольного изолиро-

3.0 мН). В опытной группе «СО» в интервале от

ванного сердца барана на перфузионном стенде

низких до средних частот зависимость «частота-

выявила, что используемые условия (в отсутствие

сила» сохраняла отрицательную направленность,

возможности адекватной перфузии донорской

что характерно для нормального миокарда крысы

кровью) не позволяют обеспечить длительную и

(рис. 2). Также в опыте отмечали наличие выра-

стабильную работу сердца. Продолжительность

женного эффекта потенциации паузой (рис. 2г),

сокращений контрольных сердец составила от

соответствующее контролю. В области высоких

10 мин до получаса. В этой связи в качестве ос-

частот (1-3 Гц) регистрировали менее выражен-

новного метода оценки сохранности изолирован-

ный либо вовсе отсутствующий по сравнению с

ного сердца барана после гипотермической кон-

контролем прирост силы сокращения. При сти-

сервации под давлением газовой смеси был вы-

муляции изопротеренолом в группе «СО» отмеча-

бран гистологический анализ с взятием образцов

ли положительный инотропный эффект на введе-

через 5-15 мин после возобновления сокращений

ние препарата (рис. 3). Не отмечено значимого

на этапе реперфузии после консервации. Возоб-

различия показателей прироста силы сокраще-

новление сокращений сердца в группе СО реги-

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

ОЦЕНКА СОХРАННОСТИ МИОКАРДА КРЫСЫ

785

(а)

(б)

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

0.003

0.03

0.2

0.4

0.6

1.0

2.0

0.003

0.03

0.2

0.4

0.6

1.0

2.0

0.015

0.1

0.3

0.5

0.8

1.5

3.0

0.015

0.1

0.3

0.5

0.8

1.5

3.0

Частота стимуляции, Гц

(в)

(г)

1 мН

0.5 мН

1 мин

Рис. 2. (а) и (б) -Зависимости силы сокращения от частоты стимуляции в папиллярных мышцах сердца крысы

соответственно в контрольной и опытной (после 24-часовой консервации при температуре 4°С под давлением газовой

смеси с монооксидом углерода, n = 5) группах; по оси абсцисс - частота стимуляции, по оси ординат - сила

стационарного изометрического сокращения в отн.ед. по отношению к силе сокращения на частоте стимуляции

0.1 Гц, принимаемой за единицу; данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение. (в) и (г) -

Репрезентативные записи сокращения папиллярных мышц соответственно в контроле и опыте при частоте

стимуляции 1 Гц, демонстрирующие наличие выраженного эффекта потенциации паузой в обеих группах.

стрировали во всех пяти опытных экспериментах.

вый отек интерстиция и, в меньшей степени, пе-

В первом эксперименте в группе СО на секции

риваскулярный отек (рис. 5в,г). Среди других на-

было визуально выявлено затемнение миокарда в

рушений были отмечены легкая степень склероза

области межжелудочковой перегородки. Оценка

эпикарда, белковая дистрофия кардиомиоцитов

инфарктной зоны срезов миокарда методом

от легкой до умеренной степени выраженности,

окрашивания трифенилтетразолием хлоридом

под эндокардом и в глубине миокарда - отдель-

выявила обширные инфарктные зоны (рис. 5д) в

ные группы кардиомиоцитов в состоянии бал-

области межжелудочковой перегородки по срав-

лонной дистрофии. В целом состояние миокарда

нению с наружными участками ткани. В этой свя-

опытной группы характеризовалось как «умерен-

зи методика консервации была модифицирована

ные ишемически-реперфузионные повреждения

с введением в полость сердца стентов, препят-

трансплантата сердца без каких-либо необрати-

ствующих смыканию створок аортального и ле-

мых нарушений».

гочного клапанов для облегчения доступа газовой

смеси в полость сердца. После модификации ме-

ОБСУЖДЕНИЕ

тодики консервации инфарктные зоны в области

межжелудочковой перегородки практически не

В настоящем исследовании для подтвержде-

выявлялись (рис. 5е).

ния высоких органопротективных свойств газо-

Анализ с помощью световой микроскопии по-

вой смеси монооксида углерода и кислорода мы

казал, что миокард как контрольной, так и опыт-

исследовали особенности зависимости силы со-

ной групп сохранял нормальную структуру ткани,

кращения от частоты стимуляции папиллярной

было достаточно трудно найти различия между

мышцы сердца крысы. Сохранение сократимости

ними (рис. 5а-г). Наиболее выраженной патоло-

на низких частотах и наличие выраженного эф-

гией в группе «СО» являлись умеренный очаго-

фекта потенциации паузой (резкий начальный

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

786

ФЕСЕНКО (мл.) и др.

Рис. 3. Сравнительный анализ функционального ответа папиллярной мышцы сердца крысы на адренергическую

стимуляцию изопротеренолом в контроле (ν = 5) и после 24-часовой консервации при температуре 4°С под давлением

газовой смеси с монооксидом углерода (n = 5). (а) - Гистограмма прироста силы сокращения в контрольной и

опытной группах; по оси ординат - сила стационарного изометрического сокращения в отн.ед. по отношению к силе

сокращения на частоте стимуляции 0.3 Гц, принимаемой за единицу; данные представлены как средние значения ±

стандартное отклонение. (б) и (в) - Репрезентативные записи прироста силы сокращения папиллярных мышц

соответственно в контроле и опыте.

всплеск уровня сокращения после пауз в электри-

Биологическая модель папиллярной мышцы

ческой стимуляции) в опыте соответствовали

может быть использована для исследования меха-

контролю, что свидетельствует о сохранении

низма органопротективного действия высоких

кальцийаккумулирующей способности сар-

(до 0.1 мл газа на 1 мл воды при используемом

коплазматического ретикулума. Выраженный

давлении) концентраций монооксида углерода,

положительный инотропный эффект, наблюдав-

который в настоящее время остается неясным. В

шийся в ответ на введение бета-миметика изо-

качестве отправной гипотезы мы предполагаем,

что СО связывается с гемсодержащими белками

протеренола, свидетельствует о сохранении нор-

митохондрий, блокируя энергетическую систему

мальной адренергической регуляции миокарда. В

кардиомиоцитов и, таким образом, останавливая

области высоких частот (1-3 Гц) в опыте отсут-

метаболизм в клетках.

ствовала положительная ветвь зависимости «ча-

стота-сила», что может говорить о блокировании

Сравнительный анализ продолжительности

частотно-зависимой активации кальциевого тока

сократительной работы нативного изолирован-

L-типа. Однако окончательно вывод о данном

ного сердца крысы, сердца после 24-часового

нарушении можно будет сделать только при уве-

хранения в консервирующем растворе «Кусто-

личении выборки. В целом продолжительность

диола» и сердца после 24-часового хранения в га-

работы мышцы, характер зависимости «частота-

зовой смеси наглядно (во всех пяти экспери-

сила», близкий к показателям интактного мио-

ментах реперфузия образцов из трех групп

карда? и сохранение способности к ответу на сти-

проводилась одновременно) продемонстрировал

муляцию изопротеренолом свидетельствуют о

практически идентичную функциональную со-

высокой функциональной сохранности миокарда

стоятельность сердец из групп интактного кон-

после пролонгированной консервации под давле-

троля и «СО». С нашей точки зрения это говорит

нием газовой смеси.

об исключительном уровне сохранности ткани

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

ОЦЕНКА СОХРАННОСТИ МИОКАРДА КРЫСЫ

787

(а)

«К»

«КСЛ», 24 ч

«СО», 24 ч

(б)

(в)

100

240

210

180

150

120

«К»

«КСЛ» «СО»

«К»

«КСЛ» «СО»

Группа

Рис. 4. Функциональная оценка изолированного сердца крысы после 24-часовой гипотермической консервации в

консервирующем растворе «Кустодиола» и под давлением газовой смеси с монооксидом углерода по сравнению с

интактным контролем. (а) - Репрезентативная обработанная фотография эксперимента; (б) - оценка инфарктной

зоны срезов миокарда после 15 мин ретроградной перфузии методом окрашивания трифенилтетразолием хлоридом

(n = 5); (в) - общая продолжительность работы сердца от момента реперфузии до остановки сокращения предсердий

(n = 5). Данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение.

сердца в группе «СО», несмотря на в три-четыре

растворе «Кустодиола» восстановить не удалось.

раза более высокую длительность хранения по

По данным регистровых исследований и отчетов

сравнению со стандартно используемыми в

национальных служб донорства и транспланта-

трансплантологической практике консервирую-

ции органов на сегодняшний день раствор гисти-

щими растворами.

дина-триптофана-кетоглутарата (HTK, «Кусто-

Следует также отметить, что длительная - до

диол», Германия) наряду с раствором Универси-

трех и более часов - продолжительность работы

тета Висконсина (США) являются двумя

сердца на стенде как в контрольной, так и в опыт-

главными растворами (> 90% всех случаев транс-

ных группах была связана в том числе с

плантаций органов), используемыми в мире для

использованием в перфузионном растворе при-

статической холодовой консервации. Сравнение

родного антиоксиданта пероксиредоксина-6,

результатов трансплантаций, выполненных с ис-

обеспечивающего снижение ишемически-репер-

пользованием этих консервирующих растворов, в

фузионных повреждений [15]. Ни одно сердце

течение многих лет является темой научных ис-

после 24-часового хранения в консервирующем

следований и публикаций. При этом достоверных

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

788

ФЕСЕНКО (мл.) и др.

Рис. 5. (а)-(г) - Световая микроскопия срезов сердца барана после 24-часовой гипотермической консервации под

давлением газовой смеси с монооксидом углерода: окрашивание гематоксилином и эозином сердца в контрольной (а)

и опытной (в) группах, окрашивание трихромом по Массону в контрольной (б) и опытной (г) группах, размер каждого

снимка составляет 750 мкм в ширину; (д) - оценка инфарктной зоны срезов миокарда левого желудочка и

межжелудочковой перегородки в группе «СО» в эксперименте № 1; (е) - оценка инфарктной зоны срезов миокарда

левого желудочка и межжелудочковой перегородки в группе «СО» в экспериментах № 2-5 (n = 4); данные

представлены как средние значения ± стандартное отклонение.

и клинически значимых преимуществ какого-ли-

срок в разы превышает допустимые для «Кусто-

бо одного консервирующего раствора на сего-

диола» сроки холодовой ишемии сердца (4-6 ч).

дняшний день не выявлено [16-18].

В то же время эти результаты подчеркивают пре-

имущество газовой консервации.

В России для гипотермического хранения ор-

ганов преимущественно используется «Кусто-

Одной из главных целей исследования явля-

диол». Нулевые результаты, полученные при его

лось изучение возможности масштабирования

использовании в условиях 24-часовой консерва-

подхода газовой консервации с переходом от

ции, были ожидаемы с учетом того, что данный

миокарда крысы массой 1.0-1.5 г к сердцу круп-

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

ОЦЕНКА СОХРАННОСТИ МИОКАРДА КРЫСЫ

789

ных лабораторных животных, сопоставимому по

количеств газа, которые могли бы вызвать токси-

размеру и массе с сердцем человека (220-300 г)

ческие эффекты после реперфузии.

для того чтобы оценить перспективы использова-

В работе [12] был исследован уровень карбок-

ния СО в клинической практике. Было неочевид-

сигемоглобина в крови крыс, которым была осу-

ным, окажется ли достаточно используемых ре-

ществлена гетеротопическая пересадка сердца,

жимов газовой консервации для адекватного на-

подвергнутого гипотермическому хранению под

сыщения и защиты тканей миокарда при резком,

давлением СО; было показано отсутствие значи-

на два порядка, увеличении массо-объемных ха-

мых различий в уровне карбоксигемоглобина в

рактеристик органа.

опытной и контрольной группах. В наших экспе-

риментах для контроля возможных утечек газа

В качестве тест-объекта было выбрано сердце

использовали бытовые датчики СО. Анализ воз-

барана (вес животных 30-40 кг), имеющее массу

можных сценариев разгерметизации камеры по-

140-160 г, что сопоставимо с массой сердца чело-

казывает, что с учетом используемых объемов

века. Первый эксперимент выявил недостаточ-

газовой смеси такая разгерметизация не приведет

ность насыщения газом внутренних областей

к повышению уровня СО свыше предельно допу-

сердца, что было подтверждено анализом ин-

стимой концентрации в рабочих помещениях

фарктных зон срезов межжелудочковой перего-

родки методом окрашивания трифенилтетразо-

площадью более 5 м².

лием хлоридом. Однако путем изменения усло-

Как показано в нашем исследовании, резуль-

вий консервации с раскрытием просветов

таты консервации сердца под давлением газовой

аортального и легочного клапанов эту проблему

смеси, содержащей монооксид углерода, суще-

удалось решить, и в последующих экспериментах

ственно превосходят по максимальному времени

инфарктные зоны во внутренних отделах сердца

консервации наиболее распространенный способ

барана не выявлялись. Во всех пяти эксперимен-

хранения в консервирующих растворах при тем-

тах в опытной группе сокращения сердца само-

пературе 4°С. Сегодня в мире активно разрабаты-

произвольно восстанавливались после начала

вается еще один подход к хранению донорских

перфузии. Результаты гистологического анализа

органов, основанный на нормотермической пер-

не показали значительных различий в сердцах ба-

фузии оксигенированной донорской кровью, а

рана контрольной и опытной групп. Миокард

также использовании систем активного поддер-

обеих групп сохранял нормальную структуру тка-

жания температуры и мониторинга физиологиче-

ни и характеризовался как умеренные ишемиче-

ского состояния органа. Многие из предложен-

ски-реперфузионные повреждения транспланта-

ных сегодня перфузионных комплексов пред-

та сердца.

ставляют собой модернизированные аппараты

экстракорпоральной мембранной оксигенации

Полученные результаты подтверждают пер-

или искусственного кровообращения. Ряд экспе-

спективность использования газовой консерва-

риментальных и клинических исследований по-

ции с монооксидом углерода для консервации

казал улучшение функции органов и исходов

сердца крупных животных, а в дальнейшем и че-

трансплантации при использовании таких

ловека. Насколько нам известно, настоящее ис-

машин.

следование является первым, подтверждающим

данный факт на модели сердца лабораторного

Среди продуктов, которые находятся на завер-

животного, чьи размеры и масса сопоставимы с

шающих стадиях клинических исследований,

таковыми у человека.

можно отметить систему Organox Metra (Organox,

Великобритания) для консервации печени [19] и

Рассматривая возможности использования га-

комплексы OCS Heart [20], OCS Liver [21], OCS

зовых смесей на основе СО для консервации ор-

Lung [22] для консервации сердца, печени и лег-

ганов, необходимо затронуть вопросы безопасно-

ких соответственно (Transmedics, США). Опи-

сти их применения. CO - газ без цвета и запаха,

санные эффекты включают в себя продление вре-

который проявляет токсичность, связываясь с ге-

мени консервации до 30% без увеличения часто-

моглобином крови с образованием карбоксиге-

ты плохой начальной функции трансплантата.

моглобина и предотвращая доставку кислорода в

Так, средняя продолжительность перфузии 75 из

ткани. Он является одним из ключевых поражаю-

93 пересаженных сердец при исследовании ком-

щих факторов при пожарах. В наших экспери-

плекса OCS Heart составила 6.35 ч [20]. Общими

ментах пересаживаемый орган предварительно

недостатками комплексных перфузионных си-

отмывали от крови консервирующими раствора-

стем являются сложная конструкция, большие

ми, поэтому такой путь реализации токсического

габариты, низкая энергетическая автономность,

эффекта не затрагивался. Вместе с тем в дальней-

высокая стоимость как основного аппарата

шем необходимо будет подтвердить на модели

(~15 млн руб. [23]), так и расходных материалов

крупных лабораторных животных, что после де-

(~2,5 млн руб. на одну операцию), что ограничи-

газации системы в тканях не остается остаточных

вает использование данных устройств. Развитие

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

790

ФЕСЕНКО (мл.) и др.

подхода газовой консервации может предоста-

вации биологических объектов», рег. номер

вить новый метод хранения и транспортировки

АААА-А17-117032050021-0).

донорского органа, сопоставимый по стоимости с

классической статической холодовой консерва-

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

цией, но при этом существенно более эффектив-

ный.

Исследования проводили в соответствии с

требованиями Европейской конвенции по защи-

В нашем исследовании мы использовали газо-

те животных 2010/63/EU. Экспериментальный

вую смесь, в которую помимо монооксида угле-

протокол был одобрен этическим комитетом

рода входит кислород. Общее давление газовой

ИБК РАН.

смеси составляло 6 атм при соотношении СО : О_2,

равном 4 : 3. Использование кислорода как фак-

тора, снижающего ишемически-реперфузион-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ные повреждения сердца, имеет длительную ис-

1. Global Observatory on Donation and Transplantation.

торию. Так, с начала 1960-х гг. разрабатывается

URL: http://www.transplant-observatory.org.

метод консервации донорского сердца ex vivo, за-

2. С. В. Готье и С. М. Хомяков, Вестн. транспланто-

ключающийся в нагнетании в коронарное русло

логии и искусственных органов 21 (3), 7 (2019).

увлажненного газообразного кислорода (персуф-

3. R. S. Mangus, et al., Transplantation 86, 298 (2008).

ляция кислородом) [24]. Обоснование метода

персуфляции состоит в обеспечении адекватной

4. В. И. Шумаков, Трансплантация сердца: руковод-

доставки кислорода в миокард во время транс-

ство для врачей (Медицинское Информационное

портировки для снижения гипоксии. Показано,

Агентство, М., 2006).

что антеградная кислородная персуфляция до-

5. M. C. Ott, J. R. Scott, A. Bihari, et al., FASEB J. 19

норского сердца свиньи обеспечивает лучшее

(1), 106 (2005).

функциональное восстановление после орто- и

6. J. S. Neto, A. Nakao, K. Kimizuka, et al., Am. J. Physi-

гетеротопической трансплантации, чем холодо-

ol. Renal. Physiol. 287 (5), 979 (2004).

вая консервация [25]. Поскольку использование

7. A. Nakao, A. M. Choi, and N. Murase, J. Cell. Mol.

каждого газа в отдельности не приводило к вос-

Med. 10 (3), 650 (2006).

становлению сократимости сердца крысы после

8. M. D. Musameh, C. J. Green, B. E. Mann, et al., J.

24-часовой консервации (данные не приведены),

Heart Lung Transplant. 26 (11), 1192 (2007).

мы подтвердили более ранние гипотезы о том, что

оба газа необходимы для снижения патологиче-

9. L. E. Otterbein, R. Foresti, and R. Motterlini, Circ.

ских процессов в миокарде. Оптимизация состава

Res. 118 (12), 1940 (2016).

смеси, соотношения используемых газов, давле-

10. A. Nakao, J. S. Neto, S. Kanno, et al., Am. J. Trans-

ния, а также разработка автоматизированного

plant. 5 (2), 282 (2005).

комплекса хранения являются предметом наших

11. A. Nakao, G. Faleo, H. Shimizu, et al., Kidney Int. 74

дальнейших исследований. Для окончательного

(8), 1009 (2008).

подтверждения эффективности и безопасности

12. N. Hatayama, M. Inubushi, M. Naito, et al., Sci. Rep.

газовой консервации для хранения органов необ-

6, 1 (2016).

ходимы исследования с использованием биоло-

13. N. Hatayama, S. Hirai, M. Naito, et al., Sci. Rep. 8 (1),

гических моделей орто- и гетеротопической пере-

1 (2018).

садки на крупных лабораторных животных (бара-

14. Е. Е. Фесенко, Н. Э. Швирст, Е. Л. Гагаринский

ны, свиньи и др.).

и др. Патент RU 2707532 (2019).

15. Н. В. Грудинин, В. К. Богданов, М. Г. Шарапов

БЛАГОДАРНОСТИ

и др., Вестн. трансплантологии и искусственных

органов 22 (2), 20 (2020).

Авторы выражают признательность В.К. Бог-

16. Á. L. Szilágyi, P. Mátrai, P. Hegyi, et al., World J. Gas-

данову за оказанную помощь при проведении хи-

troenterol. 24 (16), 1812 (2018).

рургических операций на крупных животных,

Н.П. Можейко за оказанную помощь при рас-

17. Y. Li, S. Guo, G. Liu, et al., Artif. Organs 40 (5), 489

шифровке гистологических препаратов, а также

(2016).

Сектору оптической микроскопии и спектрофо-

18. J. M. O’Callaghan, S. R. Knight, R. D. Morgan, and

тометрии ЦКП ПНЦБИ РАН.

P. J. Morris, Am. J. Transplant. 12 (4), 896 (2012).

19. . M. Manzia, L. Toti, C. Quaranta, et al., Int. J. Surg.

Rep. 57, 163 (2019).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

20. J. N. Schroder, D. D’Alessandro, F. Esmailian, et al., J.

Работа выполнена в рамках государственного

Heart Lung Transplant. 38 (4), S42 (2019).

задания Министерства образования и науки РФ

21. H. Mergental and G. R. Roll, Clin. Liver Dis. 10 (4), 97

(тема «Разработка новых подходов к криоконсер-

(2017).

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

ОЦЕНКА СОХРАННОСТИ МИОКАРДА КРЫСЫ

791

22. G. Loor, G. Warnecke, M. Villavicencio, et al., J. Heart

24. T. M. Suszynski, M. D. Rizzari, W. E. Scott, et al., J.

Lung Transplant. 37 (Suppl. 4), S147 (2018).

Cardiothorac. Surg. 8, 105 (2013).

23. OCS Heart system for heart transplant, Medtech innova-

25. С. М. Минасян, М. М. Галагудза, Ю. В. Дмитриев

tion briefing (2016). URL: https://www.nice.org.uk/ad-

и др., Регионарное кровообращение и микро-

vice/mib86/chapter/The-technology.

циркуляция 13 (3), 4 (2014).

Evaluation of Preservation of Rat Myocardium and Isolated Sheep Heart Following

Prolonged (24 Hour) Hypothermic Preservation after Exposure to a Gaseous Mixture

Composed of Carbon Monoxide and Oxygen

E.Е. Fesenko (Jr.)*, E.L. Gagarinsky*, A.S. Averin*, N.V. Grudinin**, A.E. Gurin*, N.V. Shishova*,

N.E. Shvirst*, M.V. Goltyaev*, and A.L. Kovtun***

*Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

**Shumakov Federal Scientific Center of Transplantology and Artificial Organs,

Shukinskaya ul. 1, Moscow, 123182 Russia

***Foundation for Advanced Research, Berezhkovskaya nab. 22/3, Moscow, 121059 Russia

High organoprotective properties of a gaseous mixture of carbon monoxide (CO) and oxygen (O₂) were prov-

en after prolonged (24 hour) hypothermic preservation of papillary muscle and isolated rat heart at 4°C. It

was shown that hypothermic preservation in a high-pressure gaseous mixture of CO and O₂(6 atm.) is effec-

tive in restoring the contractile activity of the rat heart after 24 hours of storage at 4°C. The isolated, retro-

grade perfused Langendorff heart perfomed physically relevant mechanical work, the duration of which was

similar to that of the intact control. When heart was stained with triphenyltetrazolium chloride, no infarcted

regions of the myocardium were detected. We found that tissue is able to sustain function at a high level after

preservation in response to electrically stimulated contractile activity of the papillary muscles of the heart. In

the test group, the relationship between frequency/intensity - the degree of potentiation effect induced by a

pause - a response to stimulation with isoproterenol corresponds to that of normal rat myocardium, on the

whole. For the first time, preservation of the sheep heart comparable in size and weight to a human heart

has been successfully applied using a gaseous mixture composed of carbon monoxide and oxygen. In all ex-

periments in the test group, a normal heartbeat spontaneously restored after the start of perfusion. There were

no significant histological differences between sheep hearts from the test and control groups. The myocardi-

um in the test group maintained a normal tissue structure. We have expanded a CO preservation approach to

sheep heart, its 24-hour preservation time is 4 times longer than the maximum preservation time of standard

static cold storage. The results obtained on the large laboratory animal heart model show that the proposed

hypothermic preservation appears helpful for prolonged storage of the human heart..

Keywords: carbon monoxide, oxygen, gas, organ, transplantation, storage, heart, rat, sheep, preservation, hypo-

thermia

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020