БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 4, с. 792-797

БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ

УДК 616.419

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА

ПЕРВИЧНОГО МИЕЛОФИБРОЗА И ЭССЕНЦИАЛЬНОЙ

ТРОМБОЦИТЕМИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПЬЮТЕРНОГО

КЛАСТЕРНОГО АНАЛИЗА МЕГАКАРИОЦИТАРНОГО РОСТКА

МИЕЛОИДНОЙ ТКАНИ

*Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова МЗ РФ,

191015, Санкт-Петербург, Кирочная ул., 41

**Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА РФ,

191024, Санкт-Петербург, 2-я Советская ул., 16

***Санкт-Петербургский государственный университет»,

199034, Санкт-Петербург, Университетская набережная, 7/9

E-mail: Zakhariy@list.ru

Поступила в редакцию 22.11.2019 г.

После доработки 27.01.2020 г.

Принята к публикации 03.02.2020 г.

Изучены особенности гистотопографических характеристик мегакариоцитарного ростка в биопси-

ях костного мозга больных эссенциальной тромбоцитемией и первичным миелофиброзом в префи-

бротической стадии с мутацией JAK2 или CALR с помощью частного метода машинного обучения

без учителя - алгоритма кластеризации DBSCAN. Исследовали 95 биопсий костного мозга больных

эссенциальной тромбоцитемией и первичным миелофиброзом. Оценивали следующие характери-

стики гистотопографии мегакариоцитов: среднее количество мегакариоцитов в одном кластере,

среднее количество кластеров и мегакариоцитов на 1 мм² среза. Получена статистически значимая

модель логистической регрессии (χ²= 14.703, p = 0.023, Nagelkerke R² = 19.6%). Анализ гистотопо-

графических характеристик мегакариоцитов позволил правильно дифференцировать эссенциаль-

ную тромбоцитемию и первичный миелофиброз в 71.6% случаев. Различия гистотопографических

характеристик мегакариоцитов в биоптатах костного мозга у больных эссенциальной тромбоците-

мией и первичным миелофиброзом с мутацией JAK2 или CALR, выявленные помощью алгоритма

кластеризации DBSCAN, позволяют связать нозологическую форму заболевания и особенности

строения мегакариоцитарного ростка, а также создать модель логистической регрессии, способную

дифференцировать эти болезни.

Ключевые слова: эссенциальная тромбоцитемия, первичный миелофиброз, гистотопография мегакарио-

цитов, кластерный анализ.

DOI: 10.31857/S0006302920030225

заболевания (считается, что тест имеет достаточ-

Эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ) и пер-

ную диагностическую точность, если его чувстви-

вичный миелофиброз (ПМФ) относятся к группе

тельность и специфичность превышают 80%) [2].

«Ph-негативных» хронических миелопролифера-

Гистотопографические и морфологические

тивных новообразований (МПН). Гистологиче-

аномалии мегакариоцитов важны для дифферен-

ское исследование биопсий костного мозга отно-

циальной диагностики ЭТ и ПМФ. При ПМФ

сится к большим диагностическим критериям

различимы компактные группы и скопления ме-

МПН [1]. Чувствительность этого метода иссле-

гакариоцитов в виде тесно сомкнутых клеток

дования в диагностике МПН варьирует от 32,5 до

(плотные кластеры), которые могут содержать

75%, специфичность - 92-98% в зависимости от

более десяти мегакариоцитов. Характерно распо-

ложение мегакариоцитов и их скоплений вокруг

Сокращения: ЭТ

- эссенциальная тромбоцитемияю,

расширенных кровеносных синусоидов и возле

ПМФ - первичный миелофиброз, МПН - миелопроли-

поверхности костных балок. Ядра мегакариоци-

феративные новообразования, префибрПМФ - первич-

ный миелофиброз в префибротической стадии.

тов часто имеют гиполобулярное строение (обла-

792

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА

793

ковидные ядра) . При ЭТ скопления мегакарио-

цитов более разреженные, клетки не соприкаса-

ются друг с другом (рыхлые кластеры),

мегакариоциты распределены в костном мозге

более однородно, их тропность к поверхностям

костных балок и кровеносным синусам выражена

слабее (рис. 1). Ядра при ЭТ гиперплоидные,

дольчатые, напоминают венок или, как их назы-

вают в англоязычных руководствах, - «staghorn»-

like («ядра типа оленьих рогов»).

Несмотря на возросшую роль гистологическо-

го исследования биопсий костного мозга в поста-

новке диагноза МПН, данные о воспроизводимо-

сти этого критерия диагностики противоречивы.

В ряде публикаций представлены данные о сов-

падении диагнозов МПН в 76-88% случаев [3-6].

Другие работы свидетельствуют о более низкой

воспроизводимости результатов гистологическо-

го исследования костного мозга - совпадение ди-

агнозов в 62-70% случаев. Наибольшую труд-

Рис. 1. Эссенциальная тромбоцитемия. Стрелками

ность представляет дифференциальная диагно-

отмечены рыхлый (1) и плотный (2) кластеры мегака-

стика между ЭТ и ПМФ в префибротической

риоцитов.

стадии (префибрПМФ) - совпадение морфоло-

гических диагнозов наблюдается лишь у 53%

больных [7-10]. Авторы работы [11] показали, что

гистотопографические признаки, недоступные

при гистологическом исследовании биопсий

человеческому глазу.

костного мозга больных МПН мнение трех из че-

Цель исследования - найти отличия гистото-

тырех врачей-патологоанатомов о формировании

пографических характеристик мегакариоцитар-

плотных кластеров мегакариоцитов совпало в

ного ростка в биопсиях костного мозга больных

88% случаев, согласованность мнения трех спе-

ЭТ и ПМФ в префибротической стадии с мутаци-

циалистов из четырех о наличии рыхлых класте-

ей JAK2 или CALR с помощью частного метода

ров мегакариоцитов или их отсутствии наблюда-

машинного обучения без учителя - алгоритма

лось в 71 и 73% случаев соответственно. Оценка

кластеризации DBSCAN (Density-Based Spatial

плотности кластеризации мегакариоцитов субъ-

Clustering of Applications with Noise).

ективна и варьирует даже у врачей, специализи-

рующихся в гематопатологии: каппа Коэна = 0.21

(граница между плохой и удовлетворительной

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

степенью согласованности) [2].

Метаанализ, проведенный авторами работы

В патологоанатомическом отделении клини-

[12], продемонстрировал, что у больных ЭТ ча-

ческой молекулярной морфологии СЗГМУ им.

стота обнаружения мутаций JAK2 и CALR состав-

И.И. Мечникова МЗ РФ в период 2012-2018 гг.

ляет 31.3-72.1% и 12.6-50% соответственно, у па-

были отобраны для исследования 95 биопсий

циентов с ПМФ мутацию JAK2 можно обнару-

костного мозга больных «Ph-» МПН с выявлен-

жить в 25.0-85.7% случаев, мутацию CALR - у

ной мутацией JAK2 или CALR. Распределение по

10-100% больных. Доказана роль драйверных му-

группам было следующим: ЭТ с мутацией JAK2 -

30 больных, ЭТ с мутацией CALR - 30 больных,

таций JAK2 и CALR как прогностических и пре-

префибрПМФ с мутацией JAK2 - 25 больных и

диктивных биомаркеров у больных ЭТ и ПМФ,

но влияние мутационного статуса на простран-

префибрПМФ с мутацией CALR - 10 больных. У

всех пациентов определяли JAK2V617F-статус с

ственные характеристики мегакариоцитарного

помощью метода полиморфизма длин рестрик-

ростка в костном мозге изучено мало [13].

ционных фрагментов. Наличие мутации гена

Для улучшения качества диагностики ЭТ и

CALR проводили методом прямого секвенирова-

префибрПМФ при гистологическом исследова-

ния по Сенгеру на автоматической капиллярной

нии биопсий костного мозга и изучении связи

системе MegaBACE 1000 DNA Analysis System

мутационного профиля с особенностями строе-

(Amersham Biosciences, Великобритания). Все мо-

ния мегакариоцитарного ростка может быть по-

лекулярно-генетические исследования были вы-

лезно внедрение алгоритмов машинного обуче-

полнены в лаборатории молекулярной генетики

ния, способных распознавать морфологические и

РосНИИГТ ФМБА России.

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

794

АСАУЛЕНКО и др.

Таблица 1. Гистотопографические характеристики мегакариоцитов у больных эссенциальной тромбоцитемией

и первичным миелофиброзом в префибротической стадии с мутациями JAK2 или CALR

Параметр

ЭТ JAK2

ЭТ CALR

ПМФ JAK2

ПМФ CALR

Количество

5.9 ± 2.4

7.2 ± 2.9

8.0 ± 4.3

7.4 ± 1.5

мегакариоцитов в кластере

21.7 ± 12.7

20.2 ± 9.8

25.6 ± 16.0

17.9 ± 6.7

Мегакариоциты, мм²

2.66 ± 1.02

2.09 ± 0.96

2.34 ± 1.09

1.87 ± 0.72

Кластеры, мм²

Таблица 2. Переменные, включенные в модель логистической регрессии

Стандартная

Предиктор

Вальд

Exp (B) (95% ДИ)

ошибка

Количество

0.350

0.212

2.723

0.099

1.420 (0.936-2.152)

мегакариоцитов в кластере

-0.091

0.113

0.658

0.417

0.913 (0.732-1.138)

Мегакариоциты, мм²

0.365

1.056

0.120

0.729

1.44 (0.18-11.40)

Кластеры, мм²

-1.588

0.583

7.420

0.006

0.204 (0.065-0.640)

Мутация

Гистологические срезы костного мозга, окра-

РЕЗУЛЬТАТЫ

шенные гематоксилином и эозином или азуром и

Морфометрические характеристики гистото-

эозином, с помощью сканера Pannoramic 250

пографии мегакариоцитов в биопсиях костного

Flash III (3DHISTECH, Венгрия) переводили в

мозга у больных ЭТ и префибрПМФ с мутациями

цифровой формат. В программе Pannoramic View-

JAK2 или CALR представлены в табл. 1.

er определяли координаты каждого мегакариоци-

Выявлена статистически значимая связь меж-

та. Координаты всех мегакариоцитов каждого

ду заболеванием, мутацией и гистотопографиче-

среза экспортировали в MS Excel и конвертирова-

скими характеристиками мегакариоцитов,

ли в txt-формат. Обработка координат с целью

F = 3,185, p = 0.001; Wilks’ Λ = 0.739.

анализа особенностей расположения мегакарио-

цитов в костном мозге была выполнена на языке

Модель логистической регрессии на основе

программирования Python с помощью алгоритма

кластеризации и мутационного статуса была ста-

кластеризации DBSCAN [15]. В биопсиях костно-

тистически значима (χ2 = 14,703, p = 0.023,

го мозга оценивали следующие характеристики:

Nagelkerke R² = 19,6%). Коэффициент при сво-

среднее количество мегакариоцитов в одном кла-

бодном члене равнялся -2,19 (1,19). Включенные

стере, среднее количество мегакариоцитарных

переменные представлены в табл. 2.

кластеров и мегакариоцитов на 1 мм² среза. Для

Качество дифференциальной диагностики ЭТ

анализа использовали следующие параметры ал-

и префибрПМФ с использованием логистиче-

горитма: минимальное количество соседних ме-

ской регрессии отражено в табл. 3.

гакариоцитов, необходимых для образования

кластера - 3, максимальное расстояние между

Как видно из табл. 3, процент корректных

ними - 100 мкм, расстояние между мегакариоци-

предсказаний диагноза ЭТ значительно выше,

тами - евклидово. Для описания связи гистото-

чем процент корректных предсказаний префибр-

пографических характеристик мегакариоцитов и

ПМФ. Вероятность правильного диагноза со-

наличия мутации JAK2 или CALR с диагнозом

ставляет 71,6%. Обоснованность модели провере-

на на тестовой и контрольной выборке путем по-

использовали многофакторный дисперсионный

строения модели логистической регрессии на 75 и

анализ и логистический регрессионный анализ.

Проведение многофакторного дисперсионного

25% исходных данных.

анализа, построение логистической регрессии и

Для демонстрации зависимости количества

кривой ошибок были выполнены с использова-

верно классифицированных диагнозов одного за-

нием пакета R.

болевания от количества неверно классифициро-

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА

795

Таблица 3. Процент корректных предсказаний диагноза заболевания на основе переменных, включенных в

модель логистической регрессии

Процент корректных предсказаний

Фактическое заболевание

Процент корректных предсказаний

ЭТ

ПМФ

ЭТ

90.0

ПМФ

40.0

Общий процент

71.6

ванных диагнозов другого заболевания построена

x_n = y, что при всех i = 1, …, n-1 объект xi+1 непо-

кривая ошибок (операционная характеристика

средственно плотно-достижим из x_i.

приемника). Площадь под кривой ошибок = 72,5

«Шум» - объекты, не достижимые ни из одно-

(95% ДИ 61,8-83,1) свидетельствует о хорошем

го другого объекта.

качестве модели (рис. 2).

Число кластеров K алгоритм DBSCAN опреде-

ляет в процессе работы.

ОБСУЖДЕНИЕ

Принцип работы алгоритма DBSCAN:

Полученные результаты подтверждают разли-

1. Задаются значения параметров ε и M.

чия в расположении мегакариоцитов у пациентов

2. Если все объекты x ∈ V уже просмотрены, за-

с ЭТ и префибрПМФ с мутациями JAK2 или

вершить выполнение алгоритма. В противном

CALR, которые не воспринимаются глазом при

случае выбирается любой из них и отмечается как

микроскопическом исследовании и могут быть

просмотренный.

обнаружены лишь с применением алгоритмов

3. Если x - корневой объект, создается новый

машинного обучения. Выявленная статистиче-

кластер (K : = K + 1), следует переход к пункту 4;

ски значимая связь между заболеванием, мутаци-

в противном случае точка x помечается как

онным статусом и гистотопографическими ха-

«шум», следует переход к шагу 1.

рактеристиками мегакариоцитов (табл. 1) демон-

стрирует влияние мутаций JAK2 или CALR на

4. В созданный кластер включаются все объек-

пространственные характеристики мегакариоци-

ты, которые являются плотно-достижимыми из

тарного ростка в костном мозге. Результаты логи-

(корневого) объекта x, следует переход к шагу 2.

стической регрессии свидетельствуют о большей

В этой работе точечные объекты представляют

связи мутационного статуса и пространственных

собой экспортированные координаты мегака-

особенностей расположения мегакариоцитов у

риоцитов, определенные при исследовании от-

больных ЭТ, чем у пациентов с префибрПМФ

(табл. 3). Использование алгоритма кластериза-

ции DBSCAN для оценки гистотопографии мега-

1.0

кариоцитов позволяет оценить плотность класте-

ризации, размеры кластеров мегакариоцитов и

выраженность гиперплазии мегакариоцитарного

0.8

ростка. Методика кластеризации заключается в

группировке объектов, расположенных близко

друг к другу, и определении областей с малой

0.6

плотностью расположения точечных объектов

как шум. В методике DBSCAN используются сле-

дующие понятия [14, 15]:

0.4

ε - окрестность объекта x;

V - множество всех наблюдений;

U(x,ε) = {y ∈ V: p(x,y) ≤ ε}.

0.2

Корневой объект степени M (для заданного

ε) - объект, ε-окрестность которого содержит не

менее M других объектов. При заданном значе-

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

нии M объект y плотно-достижим из объекта x,

Специфичность

если y ∈ U(x,ε) и объект x является корневым.

Объект y плотно-достижим из объекта x, если

Рис. 2. Кривая ошибок (операционная характеристи-

существуют такие объекты x₁, …, x_n, где x₁ = x,

ка приемника).

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

796

АСАУЛЕНКО и др.

(а)

(б)

Рис. 3. Анализ кластеризации мегакариоцитов в биопсиях костного мозга. (а) - Фрагмент отсканированного гисто-

логического препарата костного мозга больного эссенциальной тромбоцитемией. (б) - Мегакариоциты формируют

отдельные кластеры, отмеченные разными геометрическими фигурами. Мегакариоциты, классифицированные как

«шум», отмечены круглыми аннотациями.

сканированных гистологических препаратов

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

костного мозга (рис. 3).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

интересов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Пространственные отличия мегакариоцитар-

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

ного ростка в биопсиях костного мозга больных

Все процедуры, выполненные в исследовании

эссенциальной тромбоцитемией и первичным

с участием людей, соответствовали этическим

миелофиброзом в префибротической стадии с

стандартам Хельсинкской декларации 1964 г. и ее

подтвержденной мутацией JAK2 или CALR, уста-

последующим изменениям. От участников иссле-

новленные с помощью частного метода машин-

дования было получено информированное доб-

ного обучения без учителя - алгоритма кластери-

ровольное согласие.

зации DBSCAN, показывают целесообразность

применения элементов искусственного интел-

лекта в научной и практической деятельности па-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

толого-анатомических отделений медицинских

организаций.

1. D. A. Arber, A. Orazi, R. Hasserjian, et al., Blood 127

(20), 2391 (2016). DOI: 10.1182/blood-2016-03-643544

2. A. Alvarez-Larrán, A. Ancochea, M. García, et al., Brit.

УЧАСТИЕ АВТОРОВ

Haematol.

166

(6),

911

(2014).

DOI:

10.1111/bjh.12990

Концепция и дизайн исследования - З.П.А. и

Ю.А.К.; сбор и обработка материала - З.П.А.,

3. U. Gianelli, A. Bossi, I. Cortinovis, et al., Modern

Л.Б.П. и А.И.Л.; написание текста - З.П.А. и

Pathol.

27,

814

(2014).

DOI:

10.1038/mod-

Ю.А.К., редактирование - Ю.А.К.

pathol.2013.196

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА

797

4. T. Barbui, J. Thiele, F. Passamonti, et al., J. Clin. Oncol.

11. S. M. Koopmans, F. J. Bot, K. H. Lam, et al., Am. J.

29, 3179 (2011). DOI: 10.1200/JCO.2010.34.5298

Clin. Pathol.

136

(4),

618

(2011).

DOI:

10.1309/ajcp2ug9sggwahua

5. J. Thiele, H. M. Kvasnicka, L. Müllauer, et al., Blood

117, 5710 (2011). DOI: 10.1182/blood-2010-07-293761

12. M. Mejía-Ochoa, P. A. Acevedo Toro, and J. A. Cardo-

na-Arias, BMC Cancer

(1),

590

(2019). DOI:

6. A. B. Madelung, H. Bondo, I. Stamp, et al., Am. J. He-

10.1186/s12885-019-5764-4

matol. 88, 1012 (2013). DOI: 10.1002/ajh.23554

13. T. R. Merlinsky, R. L. Levine, and E. Pronier, Clin. Can-

7. B. S. Wilkins, W. N. Erber, D. Bareford, et al., Blood

cer Res. 25 (10), 2956 (2019). DOI: 10.1158/1078-

111, 60 (2008). DOI: 10.1182/blood-2007-05-091850

0432.CCR-18-3777

8. M. Brousseau, E. Parot-Schinkel, M. P. Moles, et al.,

14. J. Sander, M. Ester, H. P. Kriegel, and X. Xu, Data Min-

Histopathology 56, 758 (2010). DOI: 10.1111/j.1365-

ing Knowledge Discov.

169

(1998). DOI:

2559.2010.03545.x

10.1023/A:1009745219419

9. T. Buhr, K. Hebeda, V. Kaloutsi, et al., Haematologica

15. I. V. Konnov, O. A. Kashina, and E. I. Gilmanova,

97, 360 (2012). DOI: 10.3324/haematol.2011.047811

Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta. Seriya

10. B. S. Wilkins, W. N. Erber, D. Bareford, et al., Blood 111

Fiziko-Matematicheskie Nauki, 161 (3), 423 (2019).

(1), 60 (2007). DOI: 10.1182/blood-2007-05-091850

DOI: 10.26907/2541-7746.2019.3.423-437 (In Russian)

Morphological Differential Diagnosis of Primary Myelofibrosis

and Essential Thrombocythemia with Computer Cluster Analysis

of Megakaryocytic Lineage in Myeloid Tissue

Z.P. Asaulenko*, L.B. Polushkina**, A.I. Lepsky***, and Yu.A. Krivolapov*

*North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov, Kirochnaya ul. 41, St. Petersburg, 191015 Russia

**Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology, 2-ya Sovetskaya ul. 16, St. Petersburg, 191024 Russia

***St. Petersburg State University, Universitetskaya nab. 7/9, St. Petersburg, 199034 Russia

DBSCAN clustering algorithm - unsupervised machine learning algorithm was used to explore particulari-

ties of the histotopographic features of the megakaryocytic lineage in the bone marrow biopsies of patients

with JAK2+ or CALR-mutated essential thrombocythemia and primary myelofibrosis in prefibrotic stage.

We examined 95 bone marrow biopsies of patients with essential thrombocythemia and primary myelofibro-

sis. We evaluated the following histotopographical features of megakaryocytes: the mean quantity of mega-

karyocytes in one cluster, the mean number of clusters and megakaryocytes per 1 mm2 area in section. The

logistic regression model was statistically significant, (χ2 = 14.703, p = 0.023, Nagelkerke R2 = 19.6%). Anal-

ysis of histotopographical features of megakaryocytes helped to differentiate correctly between essential

thrombocythemia and primary myelofibrosis in 71.6% cases. The differences revealed by DBSCAN cluster-

ing algorithm in histotopographical features of megakaryocytes in biopsies of the bone marrow derived from

patients with JAK2+ or CALR-mutated essential thrombocythemia and primary myelofibrosis suggest the

relationship between the nozologic form of the disease and particularities of the development of megakaryo-

cytic lineage and are also useful to create a logistic regression model for differentiating these diseases.

Keywords: essential thrombocythemia, primary myelofibrosis, histotopography of megakaryocytes, cluster analysis

БИОФИЗИКА том 65

№ 4

2020