БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 5, с. 865-871

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.29:615

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ МАРКИРОВАНИЯ ДНК

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ КРАСИТЕЛЯМИ БЛИЖНЕГО

ИНФРАКРАСНОГО ДИАПАЗОНА

В.Е. Кузнецова, А.В. Чудинов, Т.В. Наседкина

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Моcква, ул. Вавилова, 32

E-mail: nased@biochip.ru

Поступила в редакцию 08.07.2020 г.

После доработки 16.07.2020 г.

Принята к публикации 17.07.2020 г.

Исследована эффективность маркирования ДНК пpоизводными 5′-тpифоcфатов 2′-дезокcиуpиди-

на, содержащих цианиновый краситель Cy7 в качестве флуорофора. Два флуоресцентно-меченых

аналога Cy7-dUTP различались химическим строением линкера, соединяющего нуклеотид с флуо-

рофором. Эффективность полимеразной цепной реакции и ингибирование модифицированными

нуклеотидами исследовали методом ПЦР в реальном времени. Эффективность включения марки-

рованных нуклеотидов в продукты ПЦР оценивали методом количественного электpофоpеза. Эф-

фективность маркирования ДНК-мишени оценивали по связыванию флуоресцентно-меченых

продуктов ПЦР с матрицей олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных в гидрогелевых ячей-

ках биологического микрочипа (биочипа) с регистрацией результатов в ближнем инфракрасном

диапазоне методом цифровой люминесцентной микроскопии. Показано, что увеличение длины

линкера приводит к более эффективному встраиванию маркированного нуклеотида. Тем не менее

оба соединения обеспечивали высокую чувствительность и специфичность анализа ДНК с исполь-

зованием аллель-специфичной гибридизации на биочипе.

Ключевые слова: флуоресценция, модифицированные нуклеотиды, цианиновые красители ближнего ИК-

диапазона, ПЦР в реальном времени, эффективность ПЦР, биологические микрочипы, аллель-специ-

фичная гибридизация.

DOI: 10.31857/S0006302920050038

но», фоновая флуоресценция потенциально мо-

При исследовании биологически активных

жет быть еще ниже [6, 7]. Среди органических

макромолекул используют разные форматы про-

красителей большой интерес представляют индо-

ведения анализа. Один из таких форматов осно-

трикарбоцианиновые красители, аналоги Cy7 с

ван на регистрации результатов анализов, прове-

денных на поверхности твердой подложки с ис-

максимумами поглощения и флуоресценции в

ближней инфракрасной области. Эти красители

пользованием микроколичеств исследуемого

достаточно стабильны в условиях проведения мо-

вещества [1-3]. Для визуализации результатов

лекулярно-биологического анализа и обладают

широко используют флуоресцентные красители,

высокими коэффициентами молярной экстинк-

которыми маркируют макромолекулы, участвую-

щие в процедуре анализа. Наиболее часто ис-

ции и высокими квантовыми выходами флуорес-

ценции [8-10].

пользуемые красители флуоресцируют в видимой

области спектра, где существенная фоновая флу-

ДНК-полимеразы могут воспринимать дезок-

оресценция компонентов анализа может вызвать

сиуридинтрифосфаты, маркированные цианино-

значительные помехи. Использование красите-

выми красителями, в качестве субстратов и встра-

лей Cy5 с флуоресценцией в области 650-670 нм

ивать флуоресцентно-меченые нуклеотиды в

способствует снижению фоновой флуоресцен-

синтезируемую de novo цепь ДНК в ходе полиме-

ции [4, 5]. В ближней инфракрасной области 750-

разной цепной реакции (ПЦР) [1-3]. Ранее было

1000 нм, также известной как «биологическое ок-

показано, что флуоресцентно-меченые аналоги

Cy5-dUTP, различающиеся структурой цианино-

Сокращения: ПЦР - полимеразная цепная реакция, Cy7-

dUTP и Cy5-dUTP - флуоресцентно-меченые аналоги 5'-

вого флуорофора, а также химическим строением

трифосфат-2'-дезоксиуридина.

линкера, соединяющего нуклеотид с флуорофо-

865

866

ШЕРШОВ и др.

ром, влияют на взаимодействие с ДНК-полиме-

красителя EvaGreen. Использовали две коммер-

разой и соответственно на встраивание модифи-

чески доступные полимеразы с горячим стартом:

цированных нуклеотидов в ДНК [4, 5, 9 ].

SynTaq ДНК-полимераза («Синтол», Россия) и

Hot Start Taq ДНК-полимераза («СибЭнзим»,

В настоящей работе исследована эффектив-

Россия). Состав реакционной смеси: 5 мкг ДНК,

ность флуоресцентного маркирования синте-

зируемой de novo ДНК в ходе ПЦР с помощью

дезокcинуклеозидтpифоcфаты (dATP, dGTP,

флуоресцентно-меченых 5′-тpифоcфатов 2′-дез-

dCTP, dTTP) в концентpации 200 мкМ каждый,

окcиуpидина, содержащих индотрикарбо-циани-

1×ПЦР буфер (SynTaq и Hot Start Taq, соответ-

ственно),

1,5 мМ MgCl₂, пpаймеpы в кон-

новый аналог Cy7, в зависимости от химического

строения линкера, соединяющего флуорофор и

центpации 300 нM, 1×EvaGreen (Biotium, CША) и

маркированный нуклеотид. Для проведения ПЦР

0.75 ед. активности полимеpазы на реакцию. Так-

использовали две коммерческие Taq-полимеразы

же в реакцию добавляли один из двух Cy7-dUTP

с горячим стартом. Для оценки факторов, влияю-

(dU83, dU84) в концентpации 20, 8 и 4 мкМ. Реак-

щих на эффективность флуоресцентного марки-

цию проводили на приборе Light-Cycler

рования ДНК, использовали комплексный под-

(Roche, Швейцаpия) по следующей программе:

ход, который ранее был разработан на примере

94°С - 4 мин, 45 циклов (94°С - 15 с, 62°С - 30 с,

аналогов Cy5-dUTP [5]. Ингибирование ПЦР

72°С - 30 с) с детекцией флуоресценции по кана-

нуклеотидами, маркированными флуоресцент-

лу ResoLight.

ной меткой, исследовали методом ПЦР в реаль-

Для оценки показателя динамики ПЦP в

ном времени с использованием интеркалирую-

pеальном вpемени иcпользовали cкоpоcть ампли-

щего красителя SYBR Green. Эффективность

фикации, pаccчитанную по тангенcу угла наклона

включения маркированных нуклеотидов в про-

линейного учаcтка кpивой накопления

дукты ПЦР оценивали на оcновании количе-

флуоpеcцентного cигнала (tgα) [5], которую нор-

ственного анализа электpофоpегpамм по каналам

мировали на скорость ПЦР без добавления моди-

SYBR Green I и Cy7. Общую эффективность мар-

фицированных нуклеотидов.

кирования ДНК оценивали по связыванию флуо-

Пpодукты ПЦP разделяли электpофоpезом в

ресцентно-меченых продуктов ПЦР с набором

2%-м агаpозном геле и проводили детекцию по

олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных в

каналу SYBR Green I с помощью системы гель-

гидрогелевых ячейках биочипа с регистрацией ре-

документирования Gel Doc XR+ (Bio-Rad, США)

зультатов в ближнем инфракрасном диапазоне ме-

и по каналу Cy7 с использованием исследователь-

тодом цифровой люминесцентной микроскопии.

ского анализатора гелей. Анализатор гелей имел

Комбинация этих методов позволила провести

поле регистрации 15 × 15 см, был снабжен ртут-

сравнительную оценку маркированных нуклеоти-

ной лампой и встроенным прибором с зарядовой

дов и выбрать оптимальные варианты, обеспечива-

связью RTE/CCD-1536-K/1 (Roper Scientific,

ющие высокую чувствительность и специфичность

Sarasota, США). Возбуждение флуоpеcценции

анализа ДНК методом гибридизации с иммобили-

проводили на длинах волны

615-645 нм,

зованными олигонуклеотидами.

флуоpеcценцентные сигналы регистрировали в

диапазоне пpопуcкания 810-830 нм.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Электрофореграммы анализировали с помо-

ДНК выделяли из лейкоцитов периферической

щью программы ImageI. Эффективность встраи-

крови человека с помощью набора QIAamp DNA

вания (Eff) исследуемых Cy7-dUTP опpеделяли

Blood Mini Kit (Qiagen, Германия) согласно ин-

как долю флуоpеcцентно-меченого пpодукта в

струкции производителя. В качестве мишени для

общем количеcтве наpаботанного продукта:

амплификации использовали участок гена CDYL2,

Eff = I_Cy7/(I_SG⋅ Q_Cy7⋅ ε_Cy7), т.е. как отношение

содержащий полиморфизм rs13329835 A>G. Были

суммарной интенсивности сигналов по каналу

использованы следующие праймеры: CDYL2_F -

Cy7 (I_Cy7 = S ⋅ I_средн , где S - площадь, занимаемая

5'-CCAGTGAGGCCAGTACCATCATTT-3' (For-

флуоресцентно-меченым продуктом, I_средн

ward primer) и CDYL2_R - 5'-TCATTGGATCTCAT-

среднее локальное значение флуоресценции

TACTGGTGGTGGAGCTTTGGGTAT-3' (Reverse

ПЦР-продукта ) к интенсивности сигналов по ка-

primer). Размер продукта составлял 113 п.о. После-

налу SYBR Green I (I_SG = S ⋅ I_средн), с учетом кван-

довательность обратного праймера включала локус-

тового выхода (Q_Cy7) и коэффициента молярной

специфичную часть и адаптер (малые прописные),

экстинкции (ε_Cy7).

что позволяло асимметрично нарабатывать ПЦР-

продукт в ходе одноэтапной ПЦР для последующей

Для проведения аллель-специфичной гибриди-

гибридизации на биочипе.

зации с флуоресцентно-меченым ПЦР-продуктом

Влияние различных Cy7-dUTP на прохожде-

использовали иммобилизованные олигонуклеоти-

ние ПЦP исследовали с помощью ПЦР в реаль-

ды, позволяющие определять два аллеля гена CDYL

ном времени в присутствии интеркалирующего

(аллель A и аллель G). В ячейках биочипа были им-

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ МАРКИРОВАНИЯ ДНК

867

Рис. 1. Химическое строение изученных аналогов Cy7.

мобилизованы ДНК-зонды 5'-CTAATAGGCACA-

шения (ДО) pаcсчитывали по фоpмуле

GAGAGATC-NH2-3' (CDYL2_A) и 5'-CTAATAGG-

ДО = ΣIA/ΣIG, где ΣIA - cумма значений cигна-

CGCAGAGAGAT-NH2-3' (CDYL2_G), ячейки на

лов ячеек c иммобилизованными олигонуклеоти-

чипе продублированы.

дами CDYL2_A, ΣIG - cумма значений cигналов

ячеек c иммобилизованными олигонуклеотидами

В состав реакции входили 1×ПЦР буфер, 4 мМ

CDYL2_G.

MgCl₂, 0.2 мМ каждого дезоксинуклеозидтри-

фосфата, 2.5 ед. полимеразы SynTaq («Синтол»,

Россия), по 1 пМ локус-специфичных прайме-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ров,

100 пМ универсального праймера

5'-

Исследовали два производных 5'-тpифоcфат-2'-

TCATTGGATCTCATTA-3’, 10 нг ДНК и исследу-

дезокcиуpидина, связанных по 5'-положению с цви-

емые Cy7-dUTP в концентрациях 20, 8, 4 и 2 мкМ.

терионными индотрикарбоцианиновыми красите-

Гибридизацию на биочипе осуществляли в смеси,

лями (аналогами Cy7) и имеющих линкеры раз-

содержащей 25% формамида, 5×SSPE, 50 об. %

личного химического строения. Цвитерионное

ПЦР-продукта, в течение 6-8 ч при 37°С, после

строение красителя обеспечивает его высокую гид-

инкубации биочип промывали и высушивали.

рофильность и уменьшает неспецифическое связы-

Флуоресцентные сигналы регистрировали на

вание с ДНК и ДНК-полимеразой, а также влияет

портативном цифровом люминесцентном мик-

на суммарный электрический заряд красителя. В

роскопе, с возбуждением в области 615-645 нм и

данном исследовании оба соединения имели сум-

регистрацией флуоpеcцентных сигналов в диапа-

марный нейтральный заряд [6, 11, 12]. Модифика-

зоне пpопуcкания 810-830 нм. Изображения ана-

ция урацила по 5'-положению через транс-алкено-

лизировали с помощью программы ImaGeWare

вую связь направляет модифицирующую группу в

(ООО «БИОЧИП-ИМБ», Россия).

широкую бороздку двунитевой ДНК, а протяжен-

ный линкер отдаляет флуорофор от нуклеотида.

Использовали образцы ДНК с известными ге-

Структурная формула исследованных флуоресцент-

нотипами по локусу CDYL2 rs13329835: гомозиго-

та A/A, гетерозигота A/G и гомозигота G/G. Для

но-меченых производных дезоксиуридинтрифос-

фата приведена на рис. 1, их оптические характери-

определения эффективности маркирования

стики представлены в таблице.

ПЦР-продукта оценивали среднее значение ин-

тенсивности флуоресцентного сигнала от совер-

В качестве мишени использовали последова-

шенных дуплексов. Диcкpиминационные отно- тельность гена CDYL2, содержащую полимор-

Оптические характеристики исследованных флуоресцентно-меченых производных дезоксиуридинтрифосфата

Cокращенное

Заместитель

Фрагмент

Квантовый

ε ⋅10^-5, M^-1см^-1

λ^absmax,нм

λ^emmax, нм

наименование

флуорофора R¹

линкера Х

выход Q, %

dU83

-(CH₂)₃N⁺(CH₃)₃

-СH₂-

1,95

744

767

dU84

-(CH₂)₃N⁺(CH3)3

1,99

744

767

(CH₂₎₅NHCOCH₂-

Примечание. Измерения проведены в фосфатно-солевом буфере (0.15 M NaCl, 10 mM калий-фосфат, pH 7.4).

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020

868

ШЕРШОВ и др.

Рис. 2. Ингибирование полимеразной цепной реакции в зависимости от концентрации Cy7-dUTP. По оси y - ско-

рость реакции в присутствии Cy7-dUTP, нормированная на скорость реакции без добавления модифицированного

нуклеотида: (а) - ПЦР с полимеразой SynTaq, (б) - ПЦР с полимеразой Hot Start Taq. По оси абсцисс - концентрация

Cy7-dUTP.

физм rs13329835 A>G. Белок CDYL2 играет важ-

Green I) с учетом спектральных характеристик

ную роль в развитии опухолевых клеток (рост, ме-

красителей: квантового выхода Q и коэффициен-

тастазирование, пластичность), в т.ч. при раке

та молярной экстинкции e. Следует отметить, что

молочной железы. Также показана роль поли-

оба производных близки по своим спектральным

морфизма rs13329835 в повышении риска разви-

характеристикам (см. таблицу).

тия рака молочной железы [13].

Результаты анализа электрофореграмм для по-

Влияние Cy-7-dUTP на скорость амплифика-

лимераз SynTaq и Hot Start Taq представлены на

ции изучали методом ПЦР в реальном времени с

рис. 4. Эффективность встраивания маркирован-

использованием интеркалирующего красителя

ных нуклеотидов в растущую цепь ДНК возраста-

EvaGreen, который встраивается в образующуюся

ет с ростом концентрации маркированных три-

в процессе реакции двухцепочечную ДНК и на-

фосфатов: 4 мкМ < 8 мкМ < 20 мкМ.

чинает флуоресцировать. Каждый из исследуе-

Для соединения dU84 наблюдается заметное

мых Cy7-dUTP добавляли в трех концентрациях:

увеличение встраивания маркированных нуклео-

20, 8 и 4 мкМ. В реакции использовали две ком-

тидов по сравнению с dU83, что связано с удлине-

мерческие Taq-полимеразы - SynTaq и Hot Start

нием линкера, соединяющего флуорофор с нук-

Taq. Результаты представлены на рис. 2. Видно,

леиновым основанием. Аналогичная картина бы-

что в случае обеих полимераз добавление любого

ла получена ранее для красителей Cy5 и Cy3 [9].

из Cy7-dUTP в концентрации 4 или 8 мкм прак-

Ранее было показано, что в ряду трифосфатов

тически не приводит к снижению скорости реак-

с электронейтральными красителями эффектив-

ции. Эффект ингибирования проявляется в при-

ность встраивания маркированных нуклеотидов

сутствии 20 мкм Cy7-dUTP, однако он выражен в

несколько выше для цвитерионных красителей

разной степени для двух различных производных.

на протяженном линкере, эта же закономерность

Наименьшее влияние оказывал dUCy83, а в слу-

выявлена нами для соединений Cy7-dUTP [8, 9,

чае dU84 наблюдали заметное снижение скорости

14]. Таким образом, в ряду исследованных марки-

реакции (более чем в два раза).

рованных трифосфатов наиболее эффективно

Cпособность изучаемых модифициpованныx

встраиваются в растущую цепь ДНК соединения

нуклеотидов встраиваться в ДНК в ходе ПЦР оце-

с цвитерионным красителем на более протяжен-

нивали на оcновании количественного анализа

ном линкере и с суммарным элетронейтральным

электpофоpегpамм, полученныx для продуктов

зарядом (dU84). Такая картина воспроизводима в

ПЦР в реальном времени, по каналам SYBR

случае обеих полимераз - SynTaq и Hot Start Taq.

Green I и Cy7 (рис. 3).

Общую эффективность маркирования ДНК

Эффективность встраивания маркированных

оценивали при связывании флуоресцентно-ме-

нуклеотидов Taq-полимеразами определяли по

ченых продуктов ПЦР с матрицей олигонуклео-

отношению количества флуоpеcцентно-мечено-

тидных зондов, иммобилизованных в гидрогеле-

го пpодукта (определен на канале Cy7) к общему

вых ячейках биочипа с измерением интенсивно-

количеcтву наpаботанного в pеакции полноpаз-

сти флуоресценции красителей в составе ДНК-

меpного пpодукта (определен на канале SYBR

дуплексов. На интенсивность флуоресцентных

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ МАРКИРОВАНИЯ ДНК

869

Рис. 3. - Электрофореграммы ПЦР-продуктов, полученных в реакции с полимеразами SynTaq (а) и Hot Start Taq (б).

Вверху - детекция по каналу SYBR Green, внизу - по каналу Cy7. 1, 2, 3 - dU83; 4, 5, 6 - dU84; в концентрациях 20, 8

и 4 мкМ каждый соответственно; 7 - продукт ПЦР без модифированного нуклеотида; 8 - маркер длины фрагментов

PUC19.

сигналов помимо эффективности встраивания

зондами и элементами биочипа. Также имеет зна-

маркированных нуклеотидов в анализируемую

чение количество наработанного продукта при

ДНК-мишень влияет яркость флуоресценции

проведении ПЦР. Поэтому общая эффектив-

красителей. Кроме того, красители, связанные с

ность маркирования ДНК, определяемая по ре-

ДНК-мишенью, могут влиять на константу свя-

зультатам гибридизационного анализа продуктов

зывания с комплементарным зондом, неспеци-

ПЦР, является интегральной величиной, кото-

фически связываться с некомплементарными рая, собственно, и представляет интерес.

Рис. 4. Результаты количественного определения эффективности встраивания модифицированных нуклеотидов для

двух полимераз: SynTaq (а) и Hot Start Taq (б). По оси ординат - нормированное значение эффективности

встраивания (эффективность встраивания в процентном отношении к максимальному значению для dU84), по оси

абсцисс - различные соединения Cy7-dUTP в концентрации 20, 8 и 4 мкМ соответственно.

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020

870

ШЕРШОВ и др.

там гибридизационного анализа, представлена на

рис. 5. Для полимеразы Hot Start Taq были полу-

чены аналогичные результаты.

Интенсивность флуоресцентных сигналов для

обоих Cy7-dUTP возрастает с ростом концентра-

ции маркированных трифосфатов в ПЦР смеси:

2 мкм < 4 мкм < 20 мкм (рис. 5) и коррелирует с

эффективностью встраивания модифицирован-

ных нуклеотидов в ДНК (см. рис. 4). Это означа-

ет, что цвитерионные красители Cy7 как таковые

не влияют на эффективность гибридизационного

анализа ДНК.

При сравнении картин гибридизации для

dU83 и dU84 наблюдается увеличение интенсив-

ности флуоресцентных сигналов в ряду

Рис. 5. Результаты гибридизационного анализа. По

dU83<dU84 (рис. 5), что также коррелирует с эф-

оси ординат

- интенсивность флуоресцентного

фективностью встраивания модифицированных

сигнала от совершенных дуплексов. По оси абсцисс -

различные соединения Cy7-dUTP в концентрации

нуклеотидов в ДНК (см. рис. 4). Таким образом,

20, 8, 4 и 2 мкМ соответственно.

для исследованных маркированных трифосфатов

интенсивность флуоресцентных сигналов при

проведении гибридизационного анализа выше

Эффективность флуоресцентного маркирова-

для цвитерионного соединения с более протя-

ния ДНК трифосфатами Cy7-dUTP в ходе ПЦР с

женным линкером при суммарном электроней-

полимеразой SynTaq, определенная по результа-

тральном заряде (рис. 5).

Примеры гибридизационных картин пред-

ставлены на рис. 6а. Как видно, для гомозигот

A/A и G/G сигналы от совершенных дуплексов

заметно превышают сигналы от несовершенных

дуплексов. При гетерозиготном генотипе A/G

происходит эффективное связывание с ячейками

биочипа, содержащими олигонуклеотиды, ком-

плементарные обоим алеллям. Также было рас-

считано дискриминационное отношение для

всех трех вариантов генотипа: гомозигот «дикого

типа», гетерозигот и гомозигот по «мутации». В

случае обоих маркированных трифосфатов полу-

ченные значения дискриминационных отноше-

ний позволяют достоверно разделить все три ге-

нотипа - A/A, A/G и G/G - как в случае dU84,

так и в случае dU83 (рис. 6б).

Следует отметить, что даже при минимальных

концентрациях Cy7-dUTP (2 мкм) наблюдается

достаточно высокий уровень флуоресцентных

сигналов. Одной из проблем при использовании

цвитерионных цианиновых красителей является

их невысокая химическая стабильность и низкий

квантовый выход [15, 16]. Исследованные нами

производные

5'-тpифоcфат-2'-дезокcиуpидина

(аналоги Cy7-dUTP) демонстрируют высокую

стабильность и высокий выход флуоресценции,

эффективное включение флуоресцентно-мече-

ных нуклеотидов в растущую цепь ДНК с SynTaq

и Hot Start Taq ДНК-полимеразами и, таким об-

Рис. 6. Результаты гибридизационного анализа на

разом, обеспечивают высокую чувствительность

биологическом микрочипе при концентрации 2 мкМ

и специфичность анализа ДНК при гибридиза-

Cy7-dUTP (dU83 или dU84) в однораундовой ПЦР:

ции с иммобилизованными олигонуклеотидами.

(а)

- картины распределения флуоресцентных

сигналов; (б) - дискриминационные отношения для

Тот факт, что выявленные закономерности вос-

трех генотипов (A/A, A/G, G/G соответственно).

производятся при использовании двух различных

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ МАРКИРОВАНИЯ ДНК

871

Taq ДНК-полимераз, также подтверждает досто-

3. M. Emelyanova, L. Ghukasyan, I. Abramov, et al., On-

верность полученных данных.

cotarget 8 (32), 52304 (2017).

4. В. Е. Шеpшов, В. Е. Кузнецова, Ю. П. Лыcов и др.,

Биофизика 60 (6), 1216 (2015).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

5. Т. C. Лиcица, В. Е. Шеpшов, М. А. Cпицын и др.,

Работа выполнена при финансовой поддержке

Биофизика 62 (3), 464 (2017).

Федеральной целевой программы «Исследования

6. V. E. Kuznetsova, M. A. Spitsyn, V. E. Shershov, et al.,

и разработки по приоритетным направлениям

Mendeleev Commun. 26, 95 (2016).

развития научно-технологического комплекса

России на

2014-2020 годы» (соглашение

7. М. А. Спицын, В. Е. Кузнецова, В. Е. Шершов

№ 05.604.21.0234, уникальный идентификатор

и др., Биоорган. химия 43 (4), 444 (2017).

проекта RFMEFI60419X0234).

8. M. A. Spitsyn, V. E. Kuznetsova, V. E. Shershov, et al.,

Dyes and Pigments 147, 199 (2017).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

9. O. A. Zasedateleva, V. A. Vasiliskov, S. A. Surzhikov,

et al., Nucl. Acids Res. 46, е732018 (2018).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

10. Д. О. Фесенко, Т. О. Гусейнов, С. А. Лапа и др. Мо-

интересов.

лекуляр. биология 52 (3), 533 (2018).

11. P. J. Finn, L. Sun, S. Nampalli, et al., Nucl. Acids Res.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

30 (13), 2877e85 (2002).

12. K. Sato, A. P. Gorka, T. Nagaya, et al., Bioconjug.

Настоящая работа не содержит описания ка-

Chem. 27 (2), 404e13 (2016).

ких-либо исследований с использованием людей

и животных в качестве объектов.

13. Y. Hamdi, M. B. Rekaya, S. Jingxuan, et al., BMC

Cancer 18 (1), 1295 (2018).

14. V. E. Shershov, V. E. Kuznetsova, S. A. Lapa, et al.,

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Mendeleev Commun. 27, 360 (2017).

1. Т. В. Наседкина, О. Е. Громыко, М. А. Емельянова

15. P. L. Southwick, L. A. Ernst, E. W. Tauriello, et al., Cy-

и др., Молекуляр. биология 48 (2), 2014.

tometry 11, 418e30 (1990).

2. Д. О. Фесенко, И. С.Абрамов, В. Е. Шершов и др.,

16. O. Mader, K. Reiner, H. I. Egelhaaf, et al., Bioconjug.

Молекуляр. биология 52 (6), 997 (2018).

Chem. 15, 70e8 (2004).

Study of the Eficiency of DNA Labelling Using Near Infrared Fluorescent Dyes

V.E. Shershov, A.Yu. Ikonnikova, V.A. Vasiliskov, S.A. Lapa, R.A. Miftakhov, V.E. Kuznetsova,

A.V. Chudinov, and T.V. Nasedkina

Engelhard Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, ul. Vavilova 32, Moscow, 119991 Russia

The efficiency of DNA labelling with derivatives of 2'-deoxyuridine-5'-triphosphates, containing Cy7 cy-

anine dye as a fluorophore, was assessed. The two fluorescent Cy7l abeled dUTP analogues were distin-

quished from one another by the chemical structure of the linker used to connect the fluorophore to the nu-

cleotide. The efficiency of polymerase chain reaction and inhibition by modified nucleotides were investigat-

ed by real-time PCR. The efficiency of incorporation of labeled nucleotides into PCR products was evaluated

by quantitative electrophoresis. The efficiency of target DNA labelling was evaluated by binding of fluores-

cence-labeled PCR products to a matrice of oligonucleotide probes immobilized in hydrogel drops of biolog-

ical microarray (biochip) with near infrared hybridization results recorded by digital luminescent microscopy.

The increase of the linker length has been shown to result in more efficient incorporation of the labeled nu-

cleotide. However, both compounds provided high sensitivity and specificity of DNA analysis using allele-

specific hybridization on a biochip.

Keywords: fluorescence, modified nucleotides, near infrared cyanine dyes, real-time PCR, PCR efficiency, biolog-

ical microarray, allele-specific hybridization

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020