БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 5, с. 910-914

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 576.32: 576.36

ИЗМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФОРМЕННЫХ ЭЛЕМЕНТОВ

КРОВИ В УСЛОВИЯХ МЕХАНИЧЕСКОГО СТРЕССА in vitro

Белгородский национальный исследовательский университет, 308015, Белгород, ул. Победы, 85

E-mail: sladkova@bsu.edu.ru

Поступила в редакцию 18.11.2019 г.

После доработки 20.04.2020 г.

Принята к публикации 22.05.2020 г.

Изучены электрические свойства форменных элементов крови в условиях моделирования

механического

«стресса» in vitro. Показано увеличение концентрации молекул АТФ в

межклеточном пространстве в ответ на механическое воздействие движущихся слоев плазмы как в

крови здоровых людей, так и больных острым лимфобластным лейкозом. Установлено, что

потенциал поверхности эритроцитов и тромбоцитов становится более положительным как в крови

здоровых людей, так и больных лейкозом. Напротив, для лимфоцитов характерно понижение

отрицательного заряда у здоровых людей и повышение в крови больных острым лимфобластным

лейкозом в ответ на механический стресс.

Ключевые слова: механический стресс, пуринергическая сигнальная система, поверхностный

потенциал, лимфоциты, эритроциты, тромбоциты.

DOI: 10.31857/S0006302920050087

ство АТФ в ответ на механическую деформацию,

Пуринергическая сигнализация представляет

гипоксию и некоторые агенты, а также на после-

собой сложную систему элементов, в которой мо-

дующий некроз и ишемию [4]. Рецепторы P2X7

лекула АТФ и родственные ей молекулы функци-

были описаны в лейкозных лимфоцитах челове-

онируют как межклеточные мессенджеры. Когда

ка. Имеются данные, свидетельствующие о том,

АТФ высвобождается во внеклеточное простран-

что экспрессия и функция рецепторов P2X7, ко-

ство, он активирует специфические рецепторы,

торые могут опосредовать гибель или пролифера-

принадлежащие к семейству P2 [1]. Параллельно

цию клеток в зависимости от уровня активации,

эктонуклеотидазы превращают АТФ в его дефос-

могут коррелировать с тяжестью лимфобластного

форилированные метаболиты, в том числе адено-

лейкоза [6].

зин, который стимулирует рецепторы Р1. Актив-

ность обоих рецепторов влияет на различные кле-

В ряде работ показано, что при прохождении

точные процессы [2]. Известны четыре подтипа

эритроцитов через узкие просветы капилляров в

рецепторов P1 (P1R) (A1, A2A, A2B и A3), восемь

условиях механической деформации они осво-

подтипов P2Y (P2Y1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 14) и семь

бождают молекулы АТФ, которые в межклеточ-

подтипов P2X (P2X1-7) [1]. В основном все под-

ном пространстве деградируют в течение не-

типы рецепторов P1 и P2 экспрессируются им-

скольких секунд, расщепляясь семейством экто-

мунными клетками в зависимости от типа клеток

нуклеотидаз [7] с образованием метаболитов.

и дифференцировки и играют значительную роль

АДФ и аденозин активно взаимодействуют с ре-

в воспалительных процессах.

цепторами А2-семейства на эритроцитарной по-

верхности, что приводит к еще более выраженно-

В последние годы был проведен ряд исследо-

му выбросу АТФ через канал паннексин-1 [8].

ваний патофизиологической роли пуринергиче-

Учитывая тот факт, что механическое воздей-

ской сигнализации и ее терапевтического потен-

ствие на клетки крови может стимулировать ра-

циала при различных заболеваниях [3-5]. Име-

боту пуринергической сигнальной системы, а пу-

ются доказательства того, что опухолевые клетки

риновые рецепторы выполняют роль ионных ка-

различных видов выделяют значительное количе-

налов [9, 10], актуальным является изучение

Сокращениe: ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз.

электрических свойств различных клеточных по-

910

ИЗМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФОРМЕННЫХ ЭЛЕМЕНТОВ КРОВИ

911

пуляций в норме и при развитии патологических

ро перемешивали и оставляли стоять при комнат-

процессов в условиях механического стресса.

ной температуре в течение 10 мин.

Цель работы - изучить изменение электриче-

Контрольную и опытную пробы колориметри-

ских свойств форменных элементов крови в усло-

ровали на фотометре КФК-3 (Россия) против фи-

виях механического стресса in vitro.

зиологического раствора при длине волны

670 нм. Концентрацию АТФ рассчитывали по

разности оптических плотностей между раство-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ром в контрольной пробирке (без гидролиза в

Объектом исследования была периферическая

кислой среде) и опытной пробирке по калибро-

кровь здоровых людей зрелого возраста (n = 30) и

вочному графику. Калибровочный график строи-

людей больных острым лимфобластным лейко-

ли, используя раствор фосфат-ионов (ГСО 7791-

зом (ОЛЛ) (n = 30). Забор периферической крови

2000) в концентрациях от 50 до 500 мкг/мл с ша-

проводили из локтевой вены с участием специа-

гом в 50 мкг/мл. Измерение АТФ выполняли в

лизированного медперсонала лаборатории Бел-

трех повторностях для каждой пробы.

городской областной клинической больницы

Подготовку образцов клеток крови контроль-

имени Святителя Иоасафа в одноразовые сте-

ных и опытных групп выполняли по следующей

рильные вакуумные пробирки, содержащие ан-

схеме. Для разделения форменных элементов на

тикоагулянт ЭДТА-К2 в концентрации 2.0 мг

эритроциты, лейкоциты и тромбоциты контроль-

(0.006843 моль/литр) на 1 мл крови.

ную и опытную пробирку с кровью центрифуги-

Венозную кровь здоровых доноров и больных

ровали 15 мин при 1500 об/мин. Затем нижнюю

ОЛЛ делили на две части: в опытной пробирке

часть плазмы и лейкоцитарное кольцо отбирали в

проводили активацию пуринергических сигналь-

другую пробирку и центрифугировали 10 мин при

ных путей посредством модели «механического

1500 об/мин, убирали надосадочную жидкость.

стресса», контрольную пробирку оставляли ин-

Получали суспензию лейкоцитов, которую с по-

тактной. Механический стресс осуществляли со-

мощью магнита для клеточной сепарации Easy-

гласно методу, описанному в работе [10].

Sep Magnet и набора для выделения лимфоцитов

Концентрацию АТФ в крови определяли коло-

EasySep/EasySep Direct Human Total Lymphocyte

риметрическим методом [11, 12]. Метод основан

Isolation Kit (StemCell) (Thermo Scientific, США)

на отщеплении от АТФ двух остатков фосфорной

разделяли на гранулоциты и лимфоциты. Сус-

кислоты при непродолжительном гидролизе в

пензию тромбоцитов получали согласно методу,

кислой среде. Сравнение содержания органиче-

описанному в работе [13].

ского фосфора в пробах до и после гидролиза дает

Исследование потенциала поверхности клеток

представление о количестве лабильно связанного

осуществляли на атомно-силовом микроскопе

с АТФ фосфора, находящегося в крови. Цельную

ИНТЕГРА Вита (конфигурация на базе инверти-

кровь (0.1 мл) помещали в пробирку, стоящую на

рованного оптического микроскопа Olympus IX-

ледяной бане, гомогенизируя 2.5%-м раствором

71; производитель ЗАО «NT-МDТ», Зеленоград).

ТХУ (1 мл) в течение 5 мин. Затем добавляли 1 мл

Сканирование осуществляли в полуконтактном

физиологического раствора (0.9%) и продолжали

режиме методом зонда Кельвина. Из каждой про-

экстракцию на холоде в течение того же времени.

бы сканировали не менее 15 клеток. Для сканиро-

В две пробирки, контрольную и опытную, отби-

вания использовали кантилеверы с токопроводя-

рали по 0.5 мл полученного раствора. В опытную

щим титановым покрытием серии NSG03/TiN

пробирку добавляли 1 мл 1 М раствора соляной

(Nanoworld, США). Суспензию клеток для изме-

кислоты и помещали в кипящую водяную баню

рения потенциала поверхности и процедуру его

на 10 мин для гидролиза фосфатных связей. Затем

измерения осуществляли согласно способу, изло-

раствор охлаждали, добавляли 1 мл 1 М раствора

женному в работе [14]. Обработку полученных

гидроксида натрия. В контрольную пробирку (без

изображений проводили в программе Nova (ЗАО

кипячения) добавляли 1 мл 1 М раствора гидрок-

«НТ-МДТ», Зеленоград) с использованием ин-

сида натрия и 1 мл 1 М раствора соляной кислоты.

струмента «Point Instruments». На каждой клетке

В обе пробирки добавляли по 7.5 мл физиологи-

определяли значение потенциала поверхности в

ческого раствора. Для проведения качественной

20 участках и рассчитывали среднее значение.

реакции из обеих проб отбирали по 5 мл жидко-

сти в новые пробирки. К каждой добавляли 0.5 мл

Достоверность различий между контрольны-

1 М раствора молибдата аммония, 0.5 мл 1%-го

ми и опытными пробами определяли с использо-

раствора аскорбиновой кислоты и 2 мл физиоло-

ванием t-критерия Стьюдента при p < 0,05 с уче-

гического раствора. Содержимое пробирок быст-

том нормального распределения данных. В рабо-

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020

912

СЛАДКОВА

Эритроциты Лейкоциты Тромбоциты

Контроль

Опыт

Рис. 1. Поверхностный потенциал клеток крови здо-

Рис. 2. Поверхностный потенциал клеток крови

ровых людей. Опыт - под влиянием механического

больных острым лимфобластным лейкозом. Опыт -

стресса in vitro, контроль - интактная кровь; * - ста-

под влиянием механического стресса in vitro, кон-

тистически достоверные различия между контроль-

троль - интактная кровь; * - статистически достовер-

ной и опытной группами по критерию Стьюдента при

ные различия между показателями по критерию

р < 0.05.

Стьюдента при р < 0.05.

те приведены средние величины (М) и величины

Смоделированный механоиндуцированный

статистической ошибки средней (m).

выброс АТФ клетками крови повлиял на их элек-

трические свойства. Изменение потенциала кле-

точной поверхности мы связываем с запуском и

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

реализацией пуринергического сигнального кас-

када под влиянием механического стресса [7]. В

В условия механического стресса уровень АТФ

настоящее время доказано, что на мембране

в крови здоровых людей увеличился в 2.3 раза

эритроцитов нет специфических Р-рецепторов

(p < 0.05) по сравнению с интактной кровью. У

непосредственно для молекулы АТФ, но были

больных ОЛЛ в условиях сдвиговой деформации

идентифицированы рецепторы для АДФ и адено-

концентрация АТФ повысилась в

1.8 раза

зина [16]. Ввиду этого мы предполагаем, что про-

(p < 0.05) по сравнению с контрольной группой.

дукты распада молекул АТФ могли оказать влия-

Показано, что при механическом воздействии

ние на изменение электрических свойств крас-

потенциал поверхности эритроцитов и тромбо-

ных клеток крови за счет входа ионизированного

цитов стал более положительным. Значение заря-

кальция через ионную пору [17], так как пурино-

да эритроцитов увеличилось на 44% (р < 0.05),

вые рецепторы выполняют роль ионных каналов

тромбоцитов на 40% (р < 0.05). Потенциал по-

[9, 10]. В ряде работ описаны рецепторы P2X-се-

верхности лимфоцитов напротив стал более от-

мейства, локализованные на поверхности лим-

рицательным на 47% (р < 0.05) по сравнению с

фоцитов, взаимодействие молекул АТФ с этими

контролем (рис. 1). У больных ОЛЛ в условиях

рецепторами влечет за собой открытие Са²⁺-ион-

механического воздействия потенциал поверхно-

ных каналов [18], что может быть связано с уста-

сти клеток крови стал более положительным по

новленным изменением потенциала поверхности

сравнению с контролем. Так, потенциал поверх-

лимфоцитов. Мы склонны предположить, что

ности эритроцитов был выше на 34% (р < 0.05),

повышение заряда поверхности тромбоцитов

лимфоцитов - на 27% (р < 0.05) и тромбоцитов на

возможно посредством взаимодействия продук-

34% (р < 0.05) (рис. 2).

тов распада АТФ с Р2Y-рецепторами на их по-

Установлено, что в условиях механической де-

верхности [19].

формации клеток крови концентрация АТФ в

В условиях лейкоза заряд эритроцитов и тром-

крови возросла по сравнению с пробами без на-

боцитов повышается по аналогии с клетками здо-

грузки. Полученные данные свидетельствуют о

ровых людей, в то время как для опухолевых лим-

выделении в межклеточное пространство моле-

фоцитов больных ОЛЛ характерно противопо-

кул АТФ при механической стимуляции, что со-

ложное изменение потенциала поверхности по

гласуется с результатами, представленными ря-

сравнению с клетками здоровых людей. Получен-

дом авторов [7, 15].

ные данные могут быть связаны с повышенной

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020

ИЗМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФОРМЕННЫХ ЭЛЕМЕНТОВ КРОВИ

913

экспрессией рецептора P2X7R на поверхности

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

лейкозных клеток [6], вероятно который может

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

быть активирован при силовом воздействии на

интересов.

клетки. Увеличение концентрация АТФ способ-

ствует активации пуринергического рецептора

P2X7R, что ведет к одновременному увеличению

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

содержания внутриклеточного Na⁺ и Ca²⁺ в опу-

Все процедуры, выполненные в исследовании

холевых лимфоцитах, а не только ионов Ca²⁺ [9].

с участием людей, соответствовали этическим

Учитывая данный факт, мы предполагаем, что

стандартам Хельсинкской декларации 1964 г. и ее

приобретение лейкозными лимфоцитами более

последующим изменениям. От участников иссле-

положительного заряда может быть результатом

дования было получено информированное доб-

ровольное согласие.

открытия ионных каналов одновременно для Na⁺

и Ca²⁺. Увеличение заряда тромбоцитов у боль-

ных ОЛЛ может быть связано как с активацией

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

рецепторов P2Y12 и P2Y1 посредством молекулы

1. D. Maleс, Polish J. Pharmacol. Pharmacy 48 (5), 457

АТФ, так и с непосредственным влиянием мета-

(1996).

болических продуктов опухолевых клеток, вызы-

2. C. Cekic and J. Linden, Nature Rev. Immunol. 16 (3),

вающих деполяризацию мембраны тромбоцитов

177 (2016).

[20, 21].

3. H. K. Eltzschig, M. V. Sitkovsky, and S. C. Robson,

Таким образом, показано увеличение концен-

New Engl. J. Med. 367 (24), 2322 (2012).

трации молекул АТФ в межклеточное простран-

4. G. Burnstock and D. V. Francesco, Purinergic signal-

ling 9 (4), 491 (2013).

ство в ответ на механическое воздействие in vitro.

В крови больных ОЛЛ концентрация АТФ ниже

5. M. Yang and W. J. Brackenbury, Frontiers Physiol. 4,

121 (2013).

как в интактной крови, так и при механическом

стрессе, что может быть связано с изменением

6. X. Zhang, Acta Biochim. Biophys. Sin. 41, 362 (2009).

функциональной активности эритроцитов в

7. N. Montalbetti, M. F. L. Denis, O. P. Pignataro, and

условиях опухолевого процесса.

E. Kobatake, J. Biol. Chem. 286 (44), 38397 (2011).

8. A. Baroja-Mazo, H. Barbero-Gremades, and

Полученные данные позволяют предполо-

P. Pelegrini, Biochem. Biophys. Acta 828, 79 (2013).

жить, что механическое воздействие может ока-

9. F. Virgilio, Nature Rev. Cancer 18 (10), 601 (2018).

зывать влияние на электрические свойства плаз-

10. T. Oonishi, K. Sakashita, and N. Uyesaka, Am. J.

малеммы форменных элементов крови как у здо-

Physiol. Soc. 273, 1828 (1997).

ровых людей, так и у больных острым

11. Н. М. Титова, Т. Н. Замай и Г. И. Боровкова,

лимфобластным лейкозом. Важным моментом

Биохимия и молекулярная биология: лаб. практикум

является установление разнонаправленного из-

(ИПК СФУ, Красноярск, 2008).

менения потенциала поверхности лимфоцитов

12. Т. Л. Алейникова и Г. В. Рубцова, Руководство к

здоровых людей и больных ОЛЛ. Так, в норме за-

практическим занятиям по биологической химии

ряд поверхности лимфоцитов становится более

(Высш. школа, М., 1988).

отрицательным, а при развитии лейкоза - более

13. К. И. Таборская, М. Ю. Фролова и Н. В. Кулева,

положительным. Выявленные нами закономер-

Цитология 58 (2), 115 (2016).

ности могут иметь значение в изучении механиз-

14. Е. А. Сладкова и М. Ю. Скоркина, Биофизика 59

мов межклеточных взаимодействий в микроцир-

(2), 310 (2014).

куляторном русле. Также они могут быть учтены

15. J. Evans, W. Gratzer, N. Mohandas, et al., Biophys. J.

при поиске фармакологических регуляторных

94 (10), 4134 (2008).

мишеней с целью поддержания функциональной

16. D. E. Pafundo, C. I. Alvarez, C. A. Krumschnabel, and

активности иммунокомпетентных клеток в усло-

P. J. Schwarzbaum, J. Biol. Chem. 285, 6134 (2010).

виях патологического процесса.

17. A. Kusumi, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Structure 34,

351 (2005).

18. K. Kaczmarek-Hájek, E. Lörinczi, R. Hausmann, and

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

A. Nicke, Purinergic Signal. 8 (3), 375 (2012).

Исследование выполнено при финансовой

19. 19. S. N. Orlov, Purinergic Signal. 3 (3), 231 (2007).

поддержке гранта РНФ по мероприятию «Прове-

20. X. Qian and L. Wen-jun, Cell Biochem. Biophys. 67

дение инициативных исследований молодыми

(3), 1473 (2013).

учеными», 2018-2020 гг., соглашение № 18-75-

21. T. Bose, A. Cieslar-Pobuda, and E. Wiechec, Cell

00041.

Death Disease 6 (2), 101 (2015).

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020