БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 5, с. 915-919

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК [612.223.12: 615.834]: 612.127]-092.4

ЭФФЕКТ ОЗОНА НА КИСЛОРОДТРАНСПОРТНУЮ ФУНКЦИЮ КРОВИ

ПРИ РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМАХ ВОЗДЕЙСТВИЯ В ОПЫТАХ in vitro

Гродненский государственный медицинский университет, 230009, Гродно, ул. М. Горького, 80, Беларусь

E-mail: zinchuk@grsmu.by

Поступила в редакцию 02.04.2018 г.

После доработки 30.10.2019 г.

Принята к публикации 16.06.2020 г.

Изучен эффект озона на кислородтранспортную функцию крови экспериментальных животных

в опытах in vitro. Инкубация крови с озонированным физиологическим раствором (концентрация

О₃ - 2, 6, 10 мг/л) в течение 30 и 60 мин обуславливает изменение кислородтранспортной функции

крови, проявляющееся в увеличении напряжения кислорода, степени оксигенации и уменьшении

сродства гемоглобина к кислороду. Действие данного фактора увеличивает содержание таких

газотрансмиттеров, как монооксид азота и сероводород, что имеет значение для модификации

кислородсвязующих свойств крови.

Ключевые слова: озон, кровь, кислород, газотрансмиттеры.

DOI: 10.31857/S0006302920050099

крови экспериментальных животных в опытах

Фармакологическая терапия в ряде случаев

in vitro при различных режимах воздействия.

имеет негативные последствия, что определяет

интерес к альтернативным немедикаментозным

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

методам лечения, в частности к озонотерапии,

Опыты выполняли на двадцати белых крысах-

нашедшей в последние годы широкое примене-

самцах массой 250-300 г, содержавшихся в стан-

ние в клинической практике [1]. Озон (О₃) обла-

дартных условиях вивария. Под адекватным нар-

дает большим разнообразием физиологических

козом (50 мг/кг тиопентала натрия интраперито-

эффектов, в том числе влияет на систему крови.

неально) проводили забор смешанной венозной

Воздействие озоно-кислородной смесью с кон-

крови из правого предсердия в объеме 8 мл в

центрацией озона 10-100 мкг/л на кровь собак

предварительно подготовленный шприц с гепа-

обуславливало выраженное увеличение уровня

рином из расчета 50 ЕД на 1 мл крови.

напряжения кислорода [2]. Установлено, что ин-

Объектом исследования явилась кровь, кото-

кубация озона в интервале доз 1-3 мг/л с эритро-

рая была разделена на четыре эксперименталь-

цитарной массой приводит к увеличению содер-

ные группы по 10 проб в каждой. Во всех группах

жания АТФ и 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ), в

к 3 мл крови добавляли 1 мл изотонического

то время как высокие концентрации озона (5-

(0.9%) раствора хлорида натрия: в первую (кон-

11 мг/л) не вызывают подобного эффекта [3]. При

трольную) группу вводили 0.9%-й раствор NaCl

введении крысам после кровопотери отмытых

без озонирования, в кровь остальных групп -

эритроцитов (0.5 мл) и озонированного физиоло-

озонированный NaCl с О₃ в концентрации 2 мг/л

гического раствора (2 мл с концентрацией озона

(вторая группа), 6 мг/л (третья группа) и 10 мг/л

2 мг/л) происходит увеличение электрофоретиче-

(четвертая группа), после чего пробы перемеши-

ской подвижности красных клеток крови, улуч-

вали. Время инкубации составило 30 и 60 мин.

шаются реологическое состояние крови и микро-

Физиологический раствор барботировали озоно-

циркуляция, что позволяет оптимизировать про-

кислородной смесью при помощи озонотерапев-

цесс транспорта кислорода в ткани [4]. Однако

тической установки УОТА-60-01 (ООО «Медо-

эффект озона непосредственно на кислородсвя-

зон», Россия), в которой предусмотрено измере-

зующие свойства крови недостаточно изучен.

ние концентрации озона оптическим методом в

ультрафиолетовом диапазоне. Его содержание в

Целью данного исследования являлось изучение

изотоническом растворе хлорида натрия через

эффекта озона на кислородтранспортную функцию

30 мин составляло 0.86, 2.78, 5.26 мг/л при исход-

Сокращения: 2,3-ДФГ - 2,3-дифосфоглицерат, СГК - по-

ной концентрации 2, 6 и 10 мг/л соответственно;

казатель сродства гемоглобина к кислороду.

через 60 мин его концентрация равнялась нулю.

915

916

ЗИНЧУК, БИЛЕЦКАЯ

Показатели кислородтранспортной функции

нимальной концентрацией озона по сравнению с

крови, такие как напряжение кислорода (рО₂) и

контролем. Также установлено значимое сниже-

степень оксигенации (SO₂), и кислотно-основно-

ние значения концентрации НСО_3- в группе с

го состояния (напряжение углекислого газа

концентрацией озона 2 мг/л при экспозиции 30 и

(рСО₂), стандартный бикарбонат (SBC), реаль-

60 мин. Подобная динамика изменений наблюда-

ный/стандартный недостаток (избыток) буфер-

лась и по отношению к показателям ТСО₂, SBC.

ных оснований (АВЕ/SBE), гидрокарбонат

При этом значительно повышается уровень

(НСО_–), концентрация водородных ионов (рН),

АВЕ/SBE по сравнению с контролем. Получен-

общая углекислота плазмы крови (ТСО₂)) опре-

ные результаты свидетельствуют о сдвиге кислот-

но-основного состояния в щелочную сторону,

деляли при 37°С на газоанализаторе Stat Profile

усиливающемся с увеличением концентраций

pHOx plus L (NOVA Biomedical Corporation,

озона, но с сохранением его в диапазоне нор-

США). Сродство гемоглобина к кислороду (СГК)

мальных значений.

оценивали спектрофотометрическим методом по

показателю р50 (рО₂ крови при 50%-м насыще-

При инкубации крови с озонированным фи-

нии ее кислородом). По формулам, приведенным

зиологическим раствором с различной концен-

в работе [5], рассчитывали значение р50_станд и по-

трацией озона отмечается выраженный рост на-

пряжения кислорода. Так, в группе с концентра-

ложение кривой диссоциации оксигемоглобина.

цией озона 2 мг/л этот параметр возрастает при

Продукцию NO измеряли по содержанию нит-

экспозиции 30 и 60 мин. При наибольшей кон-

рат/нитритов (NO_3-/NO_2-) в плазме крови с по-

центрации озона (10 мг/л) отмечается наиболь-

мощью реактива Грисса на спектрофотометре

ший прирост рО₂. Подобная тенденция наблюда-

PV1251C (ЗАО «СОЛАР», Беларусь) при длине

ется и по отношению к степени насыщения крови

волны 540 нм. Содержание сероводорода (H₂S)

кислородом, которая возрастает при экспозиции

определяли спектрофотометрическим методом,

30 и 60 мин в сравнении с контролем. Показатель

основанном на реакции между сульфид-анионом

значения СГК р50_реал при воздействии данным

и кислым раствором солянокислого N,N-диме-

фактором возрастает (рис. 1а). При концентра-

тил-парафенилендиамина в присутствии хлорно-

ции озона 2 мг/л отмечается его увеличение до

го железа при длине волны 670 нм [6].

31.6 мм рт. ст. (28.6, 36.1; р = 0.049) при экспози-

Все показатели проверяли на соответствие

ции 30 мин и до 32.2 мм рт. ст. (28.5, 37.9;

признака закону нормального распределения с

р = 0.043) при экспозиции 60 мин в сравнении с

использованием критерия Шапиро-Уилка. С

контролем, что свидетельствует о сдвиге кривой

учетом этого были использованы методы непара-

диссоциации оксигемоглобина вправо (рис. 2).

метрической статистики с применением про-

Схожая динамика изменений была и по показате-

граммы Statistica 10.0. Сравнение трех и более не-

лю р50_станд(рис. 1б). С увеличением концентра-

зависимых групп проводили с помощью рангово-

ции озона отмечается уменьшение СГК и соот-

го дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса.

ветственно большая степень сдвига кривой дис-

Достоверность полученных данных, с учетом раз-

социации оксигемоглобина вправо (рис. 2). Как

меров малой выборки и множественных сравне-

видим, полученные данные свидетельствуют об

ний, оценивали с использованием U-критерия

увеличении таких показателей кислородтранс-

Манна-Уитни. Результаты представлены как ме-

портной функции крови, как р50, рО₂, SO₂.

диана (Ме), 25-й и 75-й процентили. При прове-

дении множественных сравнений применяли по-

Суммарное содержание NO_3-/NO_2- в плазме

правку Бонферрони-Холма для определения

крови (рис. 3) в группах с концентрацией озона 2,

критического уровня значимости.

6 и 10 мг/л увеличивается по сравнению с контро-

лем. Уровень другого газотрансмиттера (H₂S) так-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

же возрастает (рис. 4).

В таблице представлены данные о характере

Использование озона демонстрирует широ-

изменения кислородтранспортной функции под

кую вариабельность эффектов его применения,

воздействием озона. В опытных группах при каж-

что может быть обусловлено особенностью реа-

дом последующем увеличении концентрации

лизации этого воздействия, различием в дозах и

данного фактора отмечается уменьшение рСО₂

условиях, в которых он вводится. Активация ме-

при экспозиции 30 и 60 мин. Так, в группе с кон-

таболизма организма наблюдается даже при вве-

центрацией озона 2 мг/л наблюдается уменьше-

дении очень низких доз озона, сопровождающем-

ние данного показателя по сравнению с контро-

ся повышением содержания в крови свободного и

лем при двух рассматриваемых экспозициях со-

растворенного кислорода, интенсификацией ак-

ответственно. В крови животных, которую

тивности ферментов, катализирующих аэробные

подвергали воздействию озонированного 0.9%-го

процессы окисления углеводов, липидов и белков

NaCl, наблюдается сдвиг реакции крови в щелоч-

с образованием энергетического субстрата АТФ

ную сторону, что подтверждается ростом значе-

[7]. Озон обладает выраженным противогипокси-

ния рН при экспозиции 30 и 60 мин в группе с ми-

ческим эффектом, который объясняют улучше-

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020

ЭФФЕКТ ОЗОНА НА КИСЛОРОДТРАНСПОРТНУЮ ФУНКЦИЮ КРОВИ

917

Эффект озона на кислородтранспортную функцию крови при различных режимах экспозиции

Концентрация озона

Показатель

Контроль

2 мг/л

6 мг/л

10 мг/л

Экспозиция 30 мин

SO₂, %

32.3 (30.8, 33.8)

34.1 (32.4, 35.2)*

37.6 (34.8, 38.6)*

39.2 (37.6, 40.7)*

pO_2, мм рт.ст.

22.2 (19.6, 23.3)

24.7 (21.9, 28.7)*

27.5 (26.7, 31.4)*

31.4 (29.2, 33.4)*

рН, ед

7.351 (7.325, 7.372)

7.371 (7.362, 7.391)*

7.393 (7.381, 7.402)*

7.411 (7.390, 7.433)*

pСO₂, мм рт.ст.

39.6 (38.4, 40.2)

37.1 (36.1, 39.4)*

35.4 (34.6, 36.7)*

33.7 (32.8, 35.7)*

21.6 (20.8, 23.5)

20.2 (18.9, 21.3)*

18.15 (18.1, 19.3)*

17.7 (17.4, 18.2)*

НСO_3-, ммоль/л

ТСO₂, ммоль/л

22.75 (21.7, 24.7)

21.4 (20.3, 22.4)*

20.25 (19.5, 20.6)*

19.25 (18.5, 19.7)*

ABE, ммоль/л

-4.05 (-4.7, -3.1)

-5.15 (-7.0, -4.2)*

-6.9 (-7.8, -6.6)*

-7.9 (-9.4, -7.1)*

SBE, ммоль/л

-2.7 (-2.9, -1.4)

-3.45 (-4.4, -2.3)*

-4.2 (-5.6, -3.8)*

-5.5 (-6.1, -5.1)*

SBC, ммоль/л

21.5 (20.7, 21.7)

20.5 (19.0, 21.1)*

19.0 (18.6, 19.4)*

18.2 (17.2, 18.7)*

Экспозиция 30 мин

SO₂, %

30.6 (28.9, 32.4)

32.7 (32.3, 33.9)*

35.8 (33.4, 37.9)*

38.7 (36.8, 40.8)*

pO_2, мм рт.ст.

22.1 (19.0, 23.1)

24.7 (21.4, 28.5)*

28.2 (26.9, 30.6)*

30.9 (28.6, 32.9)*

рН, ед

7.332 (7.330, 7.361)

7.394 (7.382, 7.421)*

7.415 (7.401, 7.432)*

7.433 (7.422, 7.443)*

pСO₂, мм рт.ст.

39.9 (37.3, 41.9)

33.9 (31.1, 39.2)*

30.1 (29.3, 33.6)*

27.5 (27.1, 30.1)*

НСO_3-, ммоль/л

21.5 (20.7, 23.4)

20.45 (19.7, 21.2)*

19.0 (18.5, 19.3)*

17.8 (17.4, 18.3)*

ТСO₂, ммоль/л

22.75 (22.6, 24.6)

21.3 (21, 22.7)*

20.1 (19.4, 20.3)*

18.9 (18.4, 19.3)*

ABE, ммоль/л

-3.95 (-4.4, -3.3)

-5.2 (-7.1, -3.8)*

-7.05 (-7.5, -6.5)*

-7.55 (-8.2, -7.4)*

SBE, ммоль/л

-2.85 (-3.1, -2.2)

-3.4 (-5.7, -2.8)*

-4.7 (-6.5, -4.3)*

-6.3 (-6.5, -5.8)*

SBC, ммоль/л

21.55 (21.3, 22.1)

20.7 (18.8, 21.3)*

19.0 (18.3, 19.6)*

18.0 (17.6, 18.5)*

Примечание. Данные представлены как Ме (25, 75); * - достоверные изменения в сравнении с контролем; величина p

рассчитана с учетом поправки Бонферрони-Холма.

нием реологических свойств крови, повышенной

воздействие озоном (1 или 3‰) на кровь не изме-

отдачей оксигемоглобином кислорода тканям и

няло доставку кислорода, включая СГК и кон-

увеличением скорости микроциркуляции [8]. Се-

центрацию 2,3-ДФГ в эритроцитах [12]. Однако

анс озонотерапии приводит к улучшению реоло-

при исследовании пациентов с периферической

гии крови у пациентов с комплексной патологией

окклюзией артерий озонированная аутогемот-

не только непосредственно после процедур, но и

рансфузия (реинфузия 100 мл аутологичной кро-

в течение двух месяцев после курса, что обуслов-

ви, предварительно подвергнутой воздействию

лено снижением микровязкости мембран, мини-

O₃ в течение 10 мин) повышала значение р50_станд,

мальной прочности агрегатов и скорости спон-

а уровень 2,3-ДФГ существенно не менялся [13].

танной агрегации эритроцитов, возрастанием их

Использование озона в опытах in vitro (в концен-

деформируемости [9].

трации 6.5. 13, 26 и 78 мкг/л) с кровью, взятой от

пациентов с облитерирующим атеросклерозом

В организме СГК в значительной степени

сосудов (стадия II-IV по классификации Фонта-

определяет диффузию кислорода из альвеолярно-

не) и сахарным диабетом второго типа, приводит

го воздуха в кровь, а затем на уровне капилляров

к снижению СГК [14]. Применение данного фак-

в ткань [10]. Сдвиг кривой диссоциации оксиге-

тора при кровопотере у крыс приводит к росту ак-

моглобина вправо направлен на компенсирова-

ние кислородной недостаточности, а в условиях

тивности Na⁺/K⁺-АТФазы, что обусловлено раз-

окислительного стресса, когда нарушена утили-

витием компенсаторных процессов за счет роста

зация кислорода тканями, может усиливаться ак-

концентрации 2,3-ДФГ, уменьшающей СГК, а

тивность процессов свободнорадикального окис-

также за счет снижения концентрации АТФ [15].

ления [11]. Имеются единичные работы о непо-

В результате озонолиза индуцируется каскад ре-

средственном эффекте озона на СГК. Так,

акций, которые в конечном итоге приводят к по-

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020

918

ЗИНЧУК, БИЛЕЦКАЯ

Рис. 2. Эффект озонированного изотонического

раствора на положение кривой диссоциации окси-

гемоглобина при реальных значениях рН и рСО₂

при экспозиции 60 мин: контроль (темные квадра-

ты), концентрация О₃ равна 2 мг/л (треугольники),

6 мг/л (ромбы), 10 мг/л (светлые квадраты).

его сродство к кислороду, а нитрозилгемоглобин

его снижает, положение кривой диссоциации ок-

сигемоглобина определяется соотношением этих

производных [19]. Газотрансмиттеры представля-

ют собой класс физиологически активных ве-

ществ, выполняющих в клетках сигнальную

функцию и с высокой специфичностью участву-

ющих в межклеточной и внутриклеточной ком-

муникации [20]. Взаимодействие NO и H₂S имеет

значение для модификации СГК через образова-

(а) и

Рис. 1. Эффект озона на показатели р50_реал

ние различных дериватов гемоглобина (мeт-,

р50_станд (б); * - достоверные изменения в сравне-

нитрозо-, нитрозил- и сульфогемоглобины), мо-

нии с контролем, величина p рассчитана с учетом

поправки Бонферрони-Холма.

дулирование внутриэритроцитарной системы

формирования кислородсвязывающих свойств

крови, а также опосредовано через системные ме-

вышению уровня 2,3-ДФГ, облегчая высвобож-

ханизмы формирования функциональных

дение кислорода из оксигемоглобина [16]. Дан-

свойств гемоглобина [21]. Наблюдаемый рост га-

ный промежуточный метаболит гликолиза

зотрансмиттеров (NO, H₂S), отмечаемый в наших

является важным фактором внутриэритроцитар-

ной системы регуляции кислородсвязующих

свойств крови, обеспечивающих ее адаптивные

изменения. Можно предположить, что отмечае-

мый в ряде работ положительный клинический

эффект озонотерапии [17] обусловлен, как это на-

блюдалось в наших опытах, сдвигом кривой дис-

социации оксигемоглобина вправо, способству-

ющим улучшению потока кислорода в ткани.

Механизм выявленной нами модификации

СГК связан с изменением содержания таких газо-

трансмиттеров, как монооксид азота и сероводо-

род. Эффект озона на СГК реализуется как непо-

средственно через вклад в функционирование си-

стем цистеин/цистин и L-аргинин-NO, так и

через модификацию функциональных свойств

Рис. 3. Концентрация нитрат/нитритов в плазме

при инкубации крови с озонированным изотониче-

гемоглобина. Газотрансмиттер NO является ал-

ским раствором: 1 - контроль, 2 - 2 мг/л О₃, 3 -

лостерическим эффектором СГК [18]. Образуе-

6 мг/л О₃, 4 - 10 мг/л О₃; * - достоверные измене-

мые им при взаимодействии с гемопротеидом

ния в сравнении с контролем; величина p рассчита-

мeтгемоглобин и нитрозогемоглобин повышают

на с учетом поправки Бонферрони-Холма.

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020

ЭФФЕКТ ОЗОНА НА КИСЛОРОДТРАНСПОРТНУЮ ФУНКЦИЮ КРОВИ

919

региональной комиссии по биомедицинской

этике.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. А. В. Змызгова и В. А. Максимов, Клинические ас-

пекты озонотерапии (Первая образцовая типогра-

фия, М., 2003).

2. С. П. Перетягин, К. Н. Конторщикова и А. А. Мар-

тусевич, Медицинский альманах

2, 101 (2012).

3. В. Н. Крылов, И. С. Дерюгина, А. В. Симутис и др.,

Биомедицина 2, 37 (2014).

4. А. В. Дерюгина, Я. В. Галкина, И. С. Симутис и др.,

Изв. Уфимского научного центра РАН 1, 41 (2017).

Рис. 4. Содержание сероводорода в плазме при

инкубации крови с озонированным изотоническим

5. J. W. Severinghaus, J Appl. Physiol. 21 (5), 1108 (1966).

раствором: 1 - контроль, 2 - 2 мг/л О₃, 3 - 6 мг/л

6. E. J. Norris, C. R. Culberson, S. Narasimhan, et al.,

; * - достоверные изменения в

О₃, 4 - 10 мг/л О₃

Shock.

36 (3), 242 (2011).

сравнении с контролем; величина p рассчитана с

7. Н. А. Шаназарова, Н. Ю. Лисовская, Е. В. Лисов-

учетом поправки Бонферрони-Холма.

ский и др., Медицинские науки 2, 113 (2016).

8. Р. Р. Исхакова и Ф. Р. Сайфуллина, Казанский

мед. журн. 94 (4), 510 (2013).

опытах, несомненно вносит вклад в изменение

кислородтранспортной функции крови.

9. Л. Н. Катюхин, Физиология человека 6, 100 (2016).

10. В. В. Зинчук и Н. В. Глуткина, Рос. физиол. журн.

им. И. М. Сеченова 99 (5), 537 (2013).

ВЫВОДЫ

11. A. David, Blood, Cells, Molecules and Diseases 70,

Таким образом, инкубация крови с озонирован-

2017). DOI: 10.1016/j.bcmd.2017.10.006

ным физиологическим раствором в диапазоне кон-

12. B. K. Ross, M. P. Hlastala, and R. Frank, Arch. Envi-

центраций от 2 до 10 мг/л обуславливает изменение

ron. Health 34 (3), 161 (1979).

кислородтранспортной функции крови, проявляю-

13. R. Giunta, A. Coppola, C. Luongo, et al., Ann. Hema-

щееся в увеличении рО₂, SO₂ и уменьшении СГК,

tol. 80 (12), 745 (2001).

выраженность которых усиливается с увеличением

14. L. Coppola, R. Giunta, G. Verrazzo, et al., Diabete

концентрации озона. Действие данного фактора

Metab. 21 (4), 252 (1995).

увеличивает содержание таких газотрансмиттеров,

15. А. В. Дерюгина, Я. В. Галкина и А. А. Мартусевич,

как NO и H₂S, что имеет значение для модификации

Биорадикалы и антиоксиданты 3 (3), 33 (2016).

кислородсвязывающих свойств крови. Очевидно,

16. Л. С. Ковальчук, Проблемы здоровья и экологии

противогипоксическое действие озона реализуется

2 (12), 93 (2007).

через механизмы, изменяющие кислородтранс-

17. И. С. Чекман, А. О. Сыровая, В. А. Макаров и др.,

портную функцию крови.

Озон и озонотерапия (Цифрова друкарня № 1,

Харьков, 2013).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

18. V. V. Zinchuk and L. V. Dorokhina, Nitric Oxide 6 (1),

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

29 (2002).

интересов.

19. В. В. Зинчук и Т. Л. Степуро, Биофизика 131 (1), 32

(2006).

20. О. И. Сукманский и В. П. Реутов, Успехи физиол.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

наук 3, 30 (2016).

Манипуляции на животных были выполнены

21. В. В. Зинчук, М. Э. Фираго и И. Э. Гуляй, Рос. фи-

в соответствии с рекомендациями и разрешением

зиол. журн. им. И. М. Сеченова 99 (8), 890 (2017).

Different Ozone Dosage Effects on Oxygen Transport in Blood, in vitro Experiments

V.V. Zinchuk and E.S. Biletskaya

Grodno State Medical University, ul. Gorkogo 80, Grodno, 230009 Belarus

The effects of ozone on oxygen transport in blood from the experimental animals were studied in vitro. Incubation

of blood with ozonated water (О₃ concentration of 2, 6, 10 mg/L) for 30 and 60 minutes caused a change in oxygen

transport by blood, resulting in raised oxygen tension, increased oxygenation and a reduced affinity of hemoglobin

for oxygen. As a result, the amounts of the gaseous transmitters such as nitric oxide and hydrogen sulfide, increase

significantly contributing to modification of the blood oxygen binding properties.

Keywords: ozone, blood, oxygen, gaseous transmitters

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020