БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 5, с. 1009-1016

БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ

УДК 577.3

ВЛИЯНИЕ ПРИРОДЫ ЛИГАНДА НА ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ

АКТИВНОСТЬ И ЦИТОТОКСИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ БИЯДЕРНЫХ

ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА

О.О. Рябая****, Н.В. Блюхтерова***, В.А. Рыкова***, М.М. Фомина***

*Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН, 119334, Москва, ул. Косыгина, 4

**Институт регенеративной медицины Первого Московского государственного медицинского университета

имени И.М. Сеченова МЗ РФ, 119991, Москва, ул. Трубецкая, 8/2

***Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334, Москва, ул. Косыгина, 4

****Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина МЗ РФ,

115478, Москва, Каширское шоссе, 24

Е mail: larros@list.ru

Поступила в редакцию 23.06.2020 г.

После доработки 23.06.2020 г.

Принята к публикации 29.06.2020 г.

Проведено изучение влияния природы лиганда на ростингибирующий и цитотоксический эффект

генерирующих оксид азота соединений - биядеpных динитpозильныx комплекcов железа, содер-

жащих глутатион и меркаптосукцинат, - в условиях in vivo и in vitro. Установлена преимущественная

противоопухолевая активность комплекcов c глутатионом по сравнению с комплекcами c меркап-

тосукцинатом, ингибирующих развитие опухоли (карцинома легких Льюис) на 90 и 65% по сравне-

нию с контролем соответственно. Обнаружено, что препараты обладают слабо выраженным цито-

токсическим эффектом в отношении культуры клеток опухоли человека МСF7. Расчетная кон-

центрация, вызывающая гибель

50% клеток (ИК₅₀), составляет для комплекcов c мер-

каптосукцинатом 0.8 мкмоль/мл (640 мкг/мл), а для комплекcов c глутатионом значение ИК₅₀ пре-

вышает 2 мкмоль/мл (1600 мкг/мл). Предполагается, что противоопухолевое действие исследован-

ных комплексов железа в значительной степени определяется их способностью включаться в имму-

нокомпетентные клетки, обеспечивающих направленную доставку комплексов к опухолям.

Ключевые слова: биядеpные динитpозильные комплекcы железа, противоопухолевая активность in vivo,

карцинома легких Льюис, цитотоксический эффект in vitro, культура клеток опухоли человека МСF7.

DOI: 10.31857/S0006302920050191

мости от дозового режима, схемы применения,

Ранее нами было обнаружено, что генерирую-

времени оценки эффекта и природы опухолевого

щие оксид азота соединения, такие как моно- и

штамма [1-6].

биядеpные фоpмы динитpозильныx комплекcов

железа (ДНКЖ), содержащие различные лиган-

В продолжение данного направления работ

ды, а также S-нитрозоглутатион, обладают спо-

нами с целью выявления оптимальных подходов

собностью ингибировать развитие ряда cолидных

для дальнейшего исследования доноров оксида

опуxолей мышей (каpцинома легкиx Льюиc, аде-

азота в качестве противоопухолевых агентов

нокарциномы Акатол и Са-755). Противоопухо-

проведено изучение влияния природы лиганда

левый эффект изученных препаратов проявлялся

на ростингибирующий и цитотоксический эф-

при их введении как внутрибрюшинно, так и

фект биядеpных динитpозильныx комплекcов

железа, содержащих глутатион (ДНКЖ-Г) и

внутривенно и колебался в пределах от 60 до 90%

меркаптосукцинат (ДНКЖ-МС) условиях in vivo

торможения роста опухоли, изменяясь в зависи-

и in vitro.

Сокращения: ДНКЖ - динитpозильные комплекcы желе-

за, ДНКЖ-Г - биядеpные динитpозильные комплекcы же-

леза, содержащие глутатион, ДНКЖ-МС - биядеpные ди-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

нитpозильные комплекcы железа, содержащие меркапто-

Препараты. В экспериментах использовали

сукцинат, ТРО

- коэффициент торможения роста

опухоли.

ферросульфат железа (FeSO₄ ⋅

7H₂O, Fluka,

1009

1010

ВАНИН и др.

Швейцария), восстановленный глутатион, мер-

последующим смешиванием этих растворов в

каптосукцинат и нитрит натрия (Sigma, США).

присутствии NO, как это описано ранее [8]. Кон-

Газообразный NO получали в реакции ферро-

центрация ферросульфата в этой смеси составля-

сульфата железа с нитритом натрия в 0.1 М рас-

ла 5 мМ. После пятиминутного встряхивания

творе HCl с последующим разделением NO и

смеси, приводившей к включению всего двухва-

примесного диоксида азота (NO₂) методом низ-

лентного железа в ДНКЖ-МС, NO удаляли из ап-

котемпературной сублимации жидкой смеси этих

парата откачкой, раствор полученного ДНКЖ-

газов в вакуумированной системе, как это описа-

МС замораживали и использовали (после размо-

но в работах [1, 7].

раживания) в экспериментах на животных. Кон-

центрацию препарата ДНКЖ-МС (молекулярная

Биядерная форма динитpозильныx комплекcов

масса 800 Да) оценивали по интенсивности поло-

железа с глутатионом. Синтез ДНКЖ-Г проводи-

сы его оптического поглощения на 360 нм с коэф-

ли согласно описанному ранее «простейшему»

фициентом экстинкции ε, равным 7000 М^-1 см^-1

методу синтеза ДНКЖ с тиолсодержащими ли-

(в пересчете на один атом железа в Б-ДНКЖ).

гандами [1, 8]. В соответствии с этим методом

синтез 5 мМ раствора ДНКЖ с глутатионом про-

Противоопухолевая активность in vivo. Экспе-

водили следующим образом. К 10 мл дистиллиро-

рименты проведены на 75 инбредных мышах ли-

ванной воды на воздухе добавляли 62 мг глутати-

нии BDF₁

- гибриды первого поколения

она (20 мМ), вызывавшего подкисление раствора

1(C57^Bl/6^{× DBA}2^{), самках с массой тела 18-20 г,}

до рН 4.0, с последующим введением в него 28 мг

разведения питомника

«Филиал

«Столбовая»

(10 мМ) сернокислого железа, приводившего к

НЦБМТ ФМБА России».

дальнейшему снижению рН до 3.8. После этого в

В качестве опухолевой тест-системы служила

раствор добавляли 6.9 мг (10 мМ) нитрита натрия,

солидная опухоль мышей - карцинома легких

что приводило к розовому окрашиванию раство-

Льюис, перевиваемая подкожно в соответствии

ра, обусловленному образованием S-нитрозоглу-

со стандартной методикой [9].

татиона. Судя по интенсивности оптического по-

Исследовавшиеся препараты вводили живот-

глощения на 334 нм, характерного для S-нитро-

ным в виде водных растворов внутривенно в хво-

зоглутатиона, реакция заканчивалась через

стовую вену мышей при использовании различ-

полтора часа с образованием 10 мМ этого соеди-

ных дозовых режимов и схем применения.

нения. После этого рН раствора повышали до 7.2,

ДНКЖ-Г вводили в суточных дозах 0.5, 1.0, 2.0,

что приводило к оранжевому окрашиванию рас-

10.0 и 20.0 мкмоль/кг (400, 800, 1600, 8000 и

твора, обусловленному начавшимся процессом

16000 мкг/кг) пятикратно на 1-е, 4-е, 7-е, 11-е и

образования ДНКЖ-Г в растворе при участии S-

14-е сутки после перевивки опухоли. ДНКЖ-МС

нитрозоглутатиона, Fe²⁺и глутатиона [9]. Для

вводили в суточных дозах 2,5 и 5 мкмоль/кг

полного превращения S-нитрозоглутатиона в

(2000 и 4000 мкг/кг) пятикратно на 1-е, 4-е, 7-е,

ДНКЖ-Г требовалось несколько часов. После

10-е и 14-е сутки после перевивки опухоли.

удаления образовавшегося за это время осадка

Оценка противоопухолевой активности пре-

гидроокиси трехвалентного железа путем филь-

паратов проведена при сопоставлении кинетики

трования раствора через фильтровальную бумагу

роста опухолей в группах контрольных и леченых

полученный раствор замораживали в жидком

животных. Показателем ростингибирующего эф-

азоте и использовали (после размораживания) в

фекта препарата служил коэффициент торможе-

экспериментах на животных. Оценку полученно-

ния роста опухоли (ТРО, %), который определял-

го количества ДНКЖ-Г (молекулярная масса

ся из соотношения: ТРО = (Р_С - Р_Т)/Р_С, где Р_Си

846 Да) проводили оптическим методом по ин-

Р_Т - объем (или масса) опухоли в группах кон-

тенсивности характерных для этого комплекса

полос поглощения на 310 и 360 нм, характеризую-

трольных (С) и леченых (Т) животных соответ-

щихся коэффициентами экстинкции ε, равными

ственно. Для изучения кинетики роста опухолей

проводили измерение двух взаимно перпендику-

соответственно, 9200 и 7400 М^-1см^-1 [1]. Соглас-

лярных размеров опухолевого узла на протяже-

но этой оценке концентрация Б-ДНКЖ в раство-

нии всего периода развития опухолей. Объем

ре составляла ∼2.5 мМ или 5 мМ в пересчете на

опухоли вычисляли в соответствии с формулой

один атом железа в комплексе.

для эллипсоида как V = ab²/2, где a - длина, b -

Биядерная форма динитpозильныx комплекcов

ширина и высота опухолевого узла. При оценке

железа с меркаптосукцинатом. Синтез ДНКЖ-МС

массы опухоли плотность опухолевой ткани при-

проводили путем обработки газообразным NO

(при давлении 150 мм рт. ст.) 1 мл раствора ферро-

нимали равной 1 г/см³ [9].

сульфата в дистиллированной воде и 4 мл 15 мМ

Каждая гpуппа животныx, получавшиx

раствора меркаптосукцината в 15 мМ HEPES-бу-

теpапевтичеcкое воздейcтвие, cоcтояла из шести-

фере (рН 7.4), помещенных соответственно в

восьми мышей пpи восьми-десяти животныx в

верхнюю и нижнюю части аппарата Тунберга, с

контpоле. Наблюдение за животными пpодолжа-

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020

ВЛИЯНИЕ ПРИРОДЫ ЛИГАНДА НА ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ АКТИВНОСТЬ

1011

лоcь в течение вcего пеpиода pазвития опуxоли,

изучавшейся культуры опухолевых клеток - ИК₅₀

вплоть до гибели животныx.

(значение концентрации вещества, которая вы-

Статистическая обработка данных проведена

зывает гибель 50% клеток).

путем оценки размеров опухолей (массы опухо-

Статистическая обработка результатов прове-

лей) у контрольных и леченых животных с ис-

дена с помощью программ «Statistica» и «Excel».

пользованием пакета компьютерных программ

Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Цитотоксический эффект in vitro. Сравнитель-

ное изучение цитотоксичности биядерных ди-

Противоопухолевая активность биядерных ди-

нитрозильных комплексов железа с двумя раз-

нитрозильных комплексов железа с глутатионом и

личными лигандами - глутатионом и меркапто-

меркаптосукцинатом in vivo. Исследование влия-

сукцинатом - проведено на модели культуры

ния лиганда на противоопухолевый эффект би-

клеток опухоли молочной железы МСF7 челове-

ядерных динитрозильных комплексов железа

ка, полученной из банка опухолей НМИЦ онко-

проведено на модели карциномы легких Льюис

логии им. Н.Н. Блохина.

при сопоставлении активности препаратов, со-

Действие препаратов in vitro исследовано при

держащих глутатион и меркаптосукцинат.

их использовании в широком диапазоне концен-

Противоопухолевая активность ДНКЖ-Г ис-

траций - от 0.0039 до 2.0 мкмоль/мл (от 3 до

следована в суточных дозах, изменяющихся в

1600 мкг/мл).

диапазоне от 0.5 до 20 мкмоль/кг, вводимых внут-

Оценку цитотоксического эффекта осуществ-

ривенно на 1-е, 4-е, 7-е, 9-е и 11-е сутки после пе-

ляли путем определения доли выживших клеток

ревивки опухоли (рис. 1 и 2, табл. 1).

по отношению к контролю с использованием

Полученные результаты свидетельствуют о не-

стандартного МТТ-теста. Выживаемость клеток в

линейном характере зависимости противоопухо-

культуре оценивали спектрофотометрически по

левого эффекта ДНКЖ-Г от дозы. Как видно, при

окрашиванию жизнеспособных клеток [9, 11].

применении препарата в суточных дозах 0.5, 1.0 и

2.0 мкмоль/кг наблюдается повышение ростин-

Клетки (8 ⋅ 10⁴ клеток/лунка) вносили в 96-лу-

гибирующего эффекта ДНКЖ-Г, вызывающего

ночный планшет в полной среде DMEM

торможение роста опухоли на 57, 73 и 90% соот-

(арт. 41965039, Thermo Fisher Scientific, США), со-

ветственно. Дальнейшее увеличение дозы до 10 и

держащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки,

20 мкмоль/кг приводит к снижению торможения

2 мМ глутамина («ПанЭко», Россия) и 10 Ед/мл пе-

роста опухоли до 70 и 30% по сравнению с кон-

нициллина-стрептомицина («ПанЭко», Россия) в

тролем соответственно (рис. 2).

конечном объеме 200 мкл на лунку и помещали в

CO₂-инкубатор.

Таким образом, исследование противоопухо-

левого эффекта ДНКЖ-Г в широком диапазоне

Через 24 ч проводили замену среды, после чего

доз (от 0.5 до 20 мкмоль/кг в сутки) позволило

добавляли исследуемые препараты в указанных

установить, что оптимальным режимом примене-

концентрациях. В контрольную группу клеток

ния препарата является его внутривенное введе-

препараты не вносили. Клетки инкубировали в

ние в суточной дозе 2 мкмоль/кг, пятикратно с

СО₂-инкубаторе в течение 48 ч, затем добавляли в

интервалом в трое суток, вызывающее ингибиро-

каждую лунку по 20 мкл раствора МТТ-реагента

вание на 90% роста опухоли (карцинома легких

(3-[4,5-диметилтриазол-2-ил]-2,5-дифенил тет-

Льюис), что хорошо согласуется с полученными

разолия бромид) (AppliChem, Германия) в конеч-

ранее данными [4, 9].

ной концентрации 0.5 мг/мл. Клетки инкубиро-

Противоопухолевое действие ДНКЖ-МС изу-

вали в течение 3 ч, затем среду отбирали и добав-

чено при внутривенном введении в суточных до-

ляли к ним по 200 мкл диметилсульфоксида до

зах 2.5 и 5 мкмоль/кг пятикратно в течение четыр-

растворения кристаллов формазана

(37^оС,

надцати суток с интервалом в двое-трое суток

10 мин, при встряхивании).

между инъекциями. Применение препарата в

Оптическую плотность (ОП) раствора форма-

указанных дозах приводит к подавлению разви-

зана определяли спектрофотометрически, при

тия карциномы легких Льюис на 65 и 50% по

длине волны 570 нм, на анализаторе Multiscan FC

сравнению с контролем соответственно. При

(Thermo Scientific, США), выживаемость клеток

этом противоопухолевый эффект, как видно из

высчитывали по формуле: (ОП эксперименталь-

представленных данных, усиливался при сниже-

ной группы / ОП контрольной группы) ⋅ 100%.

нии дозы препарата (рис. 3, табл. 2).

Результаты экспериментов представлены в ви-

Для сравнения противоопухолевой активно-

де зависимостей «доза-эффект», характеризую-

сти исследовавшихся препаратов на всем протя-

щих цитотоксическое действие препаратов и поз-

жении развития карциномы легких Льюис прове-

воляющих определить показатель цитотоксично-

дено сопоставление их ростингибирующего

сти ДНКЖ-Г и ДНКЖ-МС в отношении

эффекта при применении в максимально эффек-

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020

1012

ВАНИН и др.

Рис. 1. Противоопухолевая активность ДНКЖ-Г при внутривенном введении различных доз препарата на модели кар-

циномы легких Льюис: (а) - 1 - контроль, 2-4 - ДНКЖ-Г в суточных дозах 20, 10 и 2 мкмоль/кг соответственно; (б) -

1 - контроль, 2 и 3 - ДНКЖ-Г в суточных дозах 0.5 и 1.0 мкМ/кг соответственно. Дозы ДНКЖ-Г приводятся в пере-

счете на один Fe(NO)₂-фрагмент. Введение препарата осуществляли внутривенно, пятикратно, на 1-е, 4-е, 7-е, 9-е и

11-е сутки после перевивки опухоли.

тивных дозах - 2.0 мкмоль/кг/сутки (ДНКЖ-Г) и

(2.0 мкмоль/кг/сутки или 1600 мкг/кг/сутки), по-

2.5 мкмоль/кг/сутки (ДНКЖ-МС). Как видно из

давляет рост карциномы легких Льюис на 90%, в то

представленных зависимостей, при применении

время как препарат ДНКЖ-МС, введенный в мак-

ДНКЖ-Г показатель торможения роста опухоли

симально эффективной дозе (2.5 мкмоль/кг/сутки

за период наблюдения изменяется незначитель-

или 2000 мкг/кг/сутки), ингибирует развитие опу-

но, всего на 9%, колеблясь в пределах от 96 до

85%, регистрируемых на 7-е и 17-е сутки после пе-

холи не более чем на 65% по сравнению с контролем

ревивки опухоли соответственно. При примене-

(табл. 1 и 2, рис. 4).

нии ДНКЖ-МС показатель ТРО уменьшается за

Иными словами, использование глутатиона в

тот же срок на 30% - с 86 до 56% по сравнению с

контролем (рис. 4).

качестве лиганда обеспечивает на модели карци-

номы легких Льюис несколько более высокую

Сопоставление эффектов препаратов на 16-е сут-

эффективность биядерного динитрозильного

ки развития опухоли свидетельствует о том, что

ДНКЖ-Г, примененный в оптимальной дозе

Рис. 3. Влияние препарата ДНКЖ-МС на развитие

карциномы легких Льюис: 1 - контроль; 2 - ДНКЖ-

Рис. 2. Зависимость противоопухолевого эффекта

МС, 5.0 мкМ/кг в сутки; 3 - ДНКЖ-МС, 2.5 мкМ/кг

ДНКЖ-Г от дозы при внутривенном введении на

в сутки. Введение препарата осуществляли

модели карциномы легких Льюис (оценка эффекта на

внутривенно на 1-е, 4-е, 7-е, 10-е и 14-е сутки после

16-е сутки после перевивки опухоли).

перевивки опухоли

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020

ВЛИЯНИЕ ПРИРОДЫ ЛИГАНДА НА ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ АКТИВНОСТЬ

1013

Таблица 1. Противоопухолевый эффект ДНКЖ-Г в ряде доз при внутривенном введении на модели карциномы

легких Льюис

Торможение роста

Суточная доза,

Средняя масса

Серия опыта, №

Группа

опухоли

мкмоль/кг

опухоли, г

на 16-е сутки, %

ДНКЖ-Г

20.0

2.76 ± 0.54

ДНКЖ-Г

10.0

1.19 ± 0.14

ДНКЖ-Г

2.0

0.37 ± 0.08

Контроль

3.93 ± 0.65

ДНКЖ-Г

1.0

1.2 ± 0.24

ДНКЖ-Г

0.5

1.97 ± 0.13

Контроль

4.54 ± 0.45

Примечание. Введение препарата осуществляли на 1-е, 4-е, 7-е, 9-е и 11-е сутки после перевивки опухоли.

комплекса железа по сравнению с препаратом,

5-22% при воздействии ДНКЖ-Г и на 1-15% при

содержащим меркаптосукцинат.

воздействии ДНКЖ-МС (рис. 5).

Цитотоксический эффект биядерных динитро-

При увеличении концентраций препаратов от

зильных комплексов железа с глутатионом и мер-

0.5 до 2 мкмоль/мл (что соответствует диапазону

каптосукцинатом in vitro. Влияние динитрозиль-

доз от 400 до 1600 мкг/мл) наблюдается постепен-

ных комплексов железа, содержащих различные

ное снижение доли выживших клеток - до 65%

лиганды - ДНКЖ-Г и ДНКЖ-МС, на выживае-

при воздействии ДНКЖ-Г и до 42% при воздей-

мость клеток культуры опухоли человека МСF7

ствии ДНКЖ-МС (рис.5).

изучено в широком диапазоне доз, изменяющих-

Зависимость гибели клеток от концентрации

ся в пределах от 0.0039 до 2.0 мкмоль/мл.

динитрозильных комплексов железа в указанном

диапазоне концентраций - от 0.5 до 2 мкмоль/мл -

Полученные данные свидетельствуют о немо-

показана на рис. 6.

нотонном характере зависимости доли выжив-

ших после воздействия препаратов клеток от

Как видно, максимальный цитотоксический эф-

дозы.

фект выражается в гибели 58% клеток при примене-

нии ДНКЖ-МС (концентрация

1 мкмоль/мл

Как видно из зависимостей, представленных

или 800 мкг/мл) и 35% клеток при применении

на рис. 5, применение препаратов в диапазоне

ДНКЖ-Г (концентрация

2 мкмоль/мл или

концентраций от 0.0039 до 0.125 мкмоль/мл (что

1600 мкг/мл).

соответствует диапазону доз, варьирующих в пре-

делах от 3 до 100 мкг/мл) приводит к некоторому

Расчетная концентрация, вызывающая гибель

увеличению числа выживших клеток. Доля вы-

50% клеток (ИК₅₀), составляет для ДНКЖ-МС

живших клеток превышает уровень контроля на

0.8 мкмоль/мл (640 мкг/мл), а для ДНКЖ-Г зна-

Таблица 2. Противоопухолевый эффект ДНКЖ-МС при внутривенном введении на модели карциномы легких

Льюис

Суточная доза,

Средняя масса

Группа

ТРО на 16-е сутки, %

Критерий Стьюдента t

мкмоль/кг

опухоли, г

3.45 > t_0.01 = 3.05

ДНКЖ-МС

2.5

2.00 ± 0.15

f = 12

2.69 > t_0.05 = 2.22

ДНКЖ-МС

5.0

2.85 ± 0.35

f = 10

Контроль

5.61 ± 0.25

Примечание. Введение препарата осуществляли на 1-е, 4-е, 7-е, 10-е и 14-е сутки после перевивки опухоли.

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020

1014

ВАНИН и др.

Рис. 4. Изменение показателя противоопухолевой

Рис. 6. Влияние динитрозильного комплекса железа с

активности биядерных динитрозильных комплексов

глутатионом (1) и с меркаптосукцинатом (2) на

железа с различными лигандами ДНКЖ-Г и ДНКЖ-

гибель клеток культуры МСF7 человека in vitro.

МС в зависимости от времени оценки эффекта на

модели карциномы Льюис: 1 - ДНКЖ-Г (2.0 мкмоль/

кг/сутки), 2 - ДНКЖ-МС (2.5 мкмоль/кг/сутки).

in vivo, изменяется примерно в одинаковых пре-

делах - от 30 до 16000 мкг/кг в опытах, проведен-

ных на культуре клеток, и от 400 до 16000 мкг/кг в

чение ИК₅₀ превышает

мкмоль/мл

опытах, проведенных на лабораторных животных

(1600 мкг/мл) (рис. 6).

(мыши).

Учитывая, что согласно общепринятым крите-

Полученные результаты свидетельствуют о

риям оценки цитотоксического эффекта веще-

весьма значительной противоопухолевой актив-

ство считается цитотоксически активным при

ности динитрозильных комплексов железа с глу-

значениях ИК₅₀≤ 100 мкг/мл [9], следует при-

татионом и с меркаптосукцинатом, ингибирую-

знать, что динитрозильные комплексы железа с

щих развитие опухоли (карцинома легких Льюис)

глутатионом (ДНКЖ-Г) и с меркаптосукцинатом

на 90 и 65%, соответственно, in vivo, при слабо вы-

(ДНКЖ-МС) не обладают цитотоксическим дей-

раженном цитотоксическом эффекте препаратов

ствием на опухолевые клетки культуры МСF7 че-

в отношении культуры опухолевых клетки чело-

ловека in vitro.

века МСF7 in vitro.

Представляется уместным отметить, при всей

условности такого сопоставления, что диапазон

ОБСУЖДЕНИЕ

доз, использованных в экспериментах in vitro и

Сопоставление результатов исследований

противоопухолевого действия использованных

ДНКЖ на уровне организма (in vivo) и на уровне

клеточной культуры (in vitro) приводит к следую-

щим, казалось бы, взаимоисключающим вы-

водам.

Во-первых, из опытов in vivo следует, что это

действие должно усиливаться по мере понижения

дозы ДНКЖ, вводившейся мышам, тогда как

опыты in vitro показывают, что гибель злокаче-

ственных клеток должна повышаться по мере

увеличения концентрации этих комплексов в

культуральной среде.

Во-вторых, из экспериментов на животных

следует, что для ДНКЖ-МС характерно более

слабое, чем для ДНКЖ-Г, противоопухолевое

действие, а в опытах на культуре клеток обнару-

живается обратная зависимость.

Рис. 5. Влияние динитрозильного комплекса железа с

Эти противоречия можно устранить, если при-

глутатионом (1) и с меркаптосукцинатом (2) на

выживаемость опухолевых клеток культуры МСF7

нять во внимание участие иммунной системы в

человека in vitro.

противоопухолевом действии ДНКЖ, а также

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020

ВЛИЯНИЕ ПРИРОДЫ ЛИГАНДА НА ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ АКТИВНОСТЬ

1015

факт существенно меньшей стабильности

стью инициировать S-нитрозирование тиолсо-

ДНКЖ-МС. Последнее следует из факта более

держащих белков, нарушающее нормальное

быстрого распада этих комплексов при их выдер-

функционирование этих белков, что и приводит к

живании на воздухе при нейтральных и кислых

негативным для клеток и тканей последствиям.

значениях рН. Если ДНКЖ-Г сохранялись в этих

Остается открытым вопрос, какой из указанных

условиях соответственно в течение суток или в те-

компонентов ДНКЖ - молекулы NO или катио-

чение двух-четырех часов, то ДНКЖ-МС распа-

ны нитрозония, высвобождающиеся из ДНКЖ

дались при нейтральных значениях рН за два-три

при их распаде, - мог оказывать решающее цито-

часа, а при рН 1-2 - в течение получаса.

токсическое действие на злокачественные ткани

и клетки.

Участие иммунокомпетентных клеток в про-

тивоопухолевом действии ДНКЖ на уровне орга-

низма определяется способностью этих клеток,

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

например макрофагов, эффективно включать в

себя ДНКЖ [12] с последующей направленной

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

транспортировкой этих комплексов к злокаче-

интересов.

ственным опухолям и их поступлением из макро-

фагов внутрь тканей этих опухолей. При этом

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

следует иметь в виду и то обстоятельство, что им-

мунокомпетентные клетки сами по себе могут

Все применимые международные, националь-

подвергаться токсическому действию ДНКЖ,

ные и институциональные принципы ухода и ис-

естественно, по мере повышения дозы этих ком-

пользования животных при выполнении работы

плексов. Именно поэтому противоопухолевое

были соблюдены.

действие обоих ДНКЖ усиливалось по мере сни-

жения дозы этих комплексов, вводившихся в ор-

ганизм животных, достигая оптимального дей-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ствия при дозах 2.0-2.5 мкмоля/кг веса живот-

А. Ф. Ванин, Л. А. Островская, Д. Б. Корман и др.,

ных. При этих дозах иммунокомпетентные

Биофизика 59 (3), 508 (2014).

клетки сохраняли интактность, целенаправленно

А. Ф. Ванин, Л. А. Островская, Д. Б. Корман и др.,

передавая ДНКЖ в ткани опухолей. При этом ло-

Биофизика 60 (1), 152 (2015).

кальная концентрация ДНКЖ в ближайшем

окружении опухолей из-за преимущественной

А. Ф. Ванин, Л. А. Островская, Д. Б. Корман и др.,

локализации этих комплексов в иммунокомпе-

Биофизика 60 (6), 1157 (2015).

тентных клетках, контактирующих с опухолями,

A. F. Vanin, L. A. Ostrovskaya, and D. B. Korman,

могла быть достаточно высокой.

Austin J. Reprod. Medicine & Infertility 2, 1109 (2015).

В связи с вышесказанным более слабое проти-

А. Ф. Ванин, Л. А. Островская, Д. Б. Корман и др.,

воопухолевое действие ДНКЖ-МС in vivo могло

Биофизика 62 (3), 591 (2017).

быть обусловлено тем, что токсическое действие

А. Ф. Ванин, Л. А. Островская, Д. Б. Корман и др.,

на макрофаги и другие иммунокомпетентные

Биофизика 64 (6), 1216 (2019).

клетки, включающие в себя эти комплексы, мог-

ло иметь место при их более низкой, чем для

A. F. Vanin, A. P. Poltorakov, V. D. Mikoyan, et al., Ni-

ДНКЖ-Г, дозе. В результате иммунокомпетент-

tric Oxide Biol. Chem. 23, 1236 (2010).

ные клетки могли доставлять к опухолям суще-

R. R. Borodulin, L. N. Kubrina, V. O. Shvydkiy, et al.,

ственно меньшее количество ДНКЖ-МС и

Nitric Oxide Biol. Chem. 35, 110 (2013).

тем самым инициировать более слабое, чем

Е. М. Трещалина, О. С. Жукова, Г. К. Герасимова

ДНКЖ-Г, противоопухолевое действие в экспе-

и др., в кн. Руководство по проведению доклиниче-

риментах in vivо.

ских исследований лекарственных средств. Часть 1,

Как сейчас установлено [13], цитотоксическое

под ред. А. Н. Миронова и др. («Гриф и К», М.,

действие ДНКЖ с тиолсодержащими лигандами

2012), сс. 642-657.

определяется их способностью высвобождать при

10.

А. Ф. Ванин, Л. А. Островская, Д. Б. Корман и др.,

распаде как нейтральные молекулы NO, так и ка-

Биофизика 65 (1), 48 (2020).

тионы нитрозония (NO⁺). Первые, связываясь с

11.

Д. Б. Корман, Е. И. Некрасова, Л. А. Островская

ионами супероксида, продуцируют анионы пе-

и др., Биофизика 64 (6), 1138 (2019).

роксинитрита, продукты распада протонирован-

12.

H. Lewandowska, T. M. Stepkowski, S. Meczynska,

ной формы которых - гидроксильные радикалы

et al., J. Inorg. Biochem. 188, 29 (2018).

и диоксид азота - собственно и оказывают токси-

ческое действие на клетки и ткани. Что касается

13.

A. F. Vanin, Dinitrosyl Iron Complexes as a “Working

катионов нитрозония, их цитотоксическое дей-

Form”of Nitric Oxide in Living Organisms (Cambridge

ствие, определяется, по-видимому, их способно-

Scholars Publishing, Cambridge, UK, 2019).

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020

1016

ВАНИН и др.

The Influence of the Ligand Nature on the Antitumour Activity and the Cytotoxic Effect

of the Binuclear Dinitrosyl Iron Complexes

A.F. Vanin*^, **, L.A. Ostrovskaya***, D.B. Korman***, E.I. Nekrasova***, O.O. Riabaya****,

N.V. Bluhterova***, V.A. Rykova***, and M.M. Fomina***

*Semenov Federal Research Center of Chemical Physics, Russian Academy of Sciences, ul. Kosygina 4, Moscow, 119334 Russia

**Institute of Regenerative Medicine, Sechenov First Moscow State Medical University,

Ministry of Health of the Russian Federation, Trubetskaya ul. 8/2, Moscow, 119991 Russia

***Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, ul. Kosigina 4, Moscow, 119991 Russia

****Blokhin National Medical Research Center for Oncology, Ministry of Health of the Russian Federation,

Kashirskoe Shosse 24, Moscow, 115478 Russia

The influence of the ligand nature on the growth-inhibiting and cytotoxic effects of nitric oxide-generating

compounds such as binuclear dinitrosyl iron complexes containing glutathione and mercaptosuccinate was

studied in vivo and in vitro. It was established that complexes with glutathione demonstrated antitumor ac-

tivity prevailing over the effect exerted by complexes with mercaptosuccinate capable of inhibiting tumor

growth (Lewis lung carcinoma) (90% and 65%, respectively, versus control). It was found that these complex-

es are weakly cytotoxic against MCF7 human cancer cell line. Half-maximal inhibitory concentration at

which the viability of cells reduced by 50% (IC₅₀) was equal to 0.8 mM/ml (640 μg/ml) when a complex with

mercaptosuccinate was administered and 2 mM/ml (1600 μg/ml) after injection of a complex with glutathi-

one. It is assumed that the antitumor activity of iron complexes under study is determined by the ability of

these complexes to enter into immunocompetent cells which provide a direct route to tumor tissues.

Keywords: binuclear dinitrosyl iron complexes, in vivo antitumor activity, Lewis lung murine carcinoma, cytotoxic

effect in vitro, MCF-7 human cancer cell line

БИОФИЗИКА том 65

№ 5

2020