БИОФИЗИКА, 2020, том 65, № 6, с. 1114-1117

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 576.32/.36

ОСОБЕННОСТИ БИОФИЗИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФОРМЕННЫХ

ЭЛЕМЕНТОВ КРОВИ ЛЮДЕЙ ПОЖИЛОГО ВОЗРАСТА В УСЛОВИЯХ

МЕХАНИЧЕСКОГО СТРЕССА in vitro

Белгородский национальный исследовательский университет, 308015, Белгород, ул. Победы, 85

E-mail: sladkova@bsu.edu.ru

Поступила в редакцию 05.03.2020 г.

После доработки 21.04.2020 г.

Принята к публикации 20.05.2020 г.

Изучены особенности биофизических свойств форменных элементов крови людей пожилого воз-

раста в условиях механического стресса in vitro, который, согласно литературным данным, запускает

сигнальный каскад пуринергической рецепторной системы. Установлено, что жесткость клеточной

поверхности эритроцитов, гранулоцитов, лимфоцитов и тромбоцитов при этом снизилась, а потен-

циал поверхности стал более положительным. Полученные экспериментальные данные могут иг-

рать роль в расширении знаний о влиянии механической деформации на лейкоциты и тромбоциты,

которые являются основными регуляторами гомеостатических процессов в микроциркуляторном

русле, так и на эритроциты, участвующие в регуляции сосудистого тонуса артериол и оксигенации

тканей у лиц пожилого возраста.

Ключевые слова: механический стресс, пуринергическая сигнальная система, форменные элементы

крови, потенциал поверхности, модуль Юнга.

DOI: 10.31857/S0006302920060101

лы АТФ [5], в результате чего запускаются пара- и

Старение организма в превалирующем боль-

аутокринные сигнальные механизмы [6]. В меж-

шинстве случаев сопровождается развитием сер-

клеточном пространстве молекула АТФ распада-

дечно-сосудистых заболеваний, во многом обу-

ется до АДФ, АМФ и аденозина [7], которые яв-

словленных молекулярно-клеточными возраст-

ляются агонистами пуринергических рецепторов,

ными изменениями эндотелия

[1], а также

широко представленных на форменных элемен-

реологических показателей крови [2]. Подобные

тах крови.

нарушения могут быть связаны с изменением в

функционировании пуринергических рецепто-

В связи с вышеизложенным целью работы

ров форменных элементов крови и клеток эндо-

явилось изучение особенности биофизических

телия. В ряде исследований приведены данные о

свойств форменных элементов крови людей по-

значительной роли пуринергической сигнализа-

жилого возраста в условиях механического стрес-

ции в развитии различных сердечно-сосудистых

са in vitro.

патологий - инфаркта миокарда, сердечной не-

достаточности, гипертензии, инсульта, тромбоза

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

[3]. Кроме того, у людей пожилого и старческого

возраста значительно повышается вероятность

Эксперименты выполнены на крови здоровых

развития инфекционных заболеваний. В первую

людей-добровольцев пожилого возраста (от 60 до

очередь это связано со снижением функциональ-

75 лет, n = 30), проходивших диспансеризацию на

ной активности иммунной системы. Важную

базе областной клинической больницы г. Белго-

роль в механизмах старения иммунной системы

рода. Забор крови осуществляли из локтевой

играет пуринергическая регуляция иммуноком-

вены с участием специализированного медперсо-

петентных клеток, отвечающих за воспалитель-

нала.

ные реакции в организме [4].

Модель механического стресса in vitro осу-

Было показано, что в условиях механической

ществляли согласно методике, описанной в рабо-

деформации эритроциты высвобождают молеку- те [8]. Данная модель позволяет создать условия,

которые максимально приближены к физиологи-

Сокращениe: АСМ - атомно-силовая микроскопия.

ческим параметрам микроциркуляторного русла

1114

ОСОБЕННОСТИ БИОФИЗИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

1115

[9]. В одноразовый туберкулиновый шприц (объ-

ностного потенциала в режиме зонда Кельвина.

емом 1 мл) помещали 0.5 мл цельной крови, пу-

Готовили суспензию клеток для измерения по-

зырьки воздуха были тщательно убраны. Затем

верхностного потенциала и осуществляли проце-

суспензию клеток пропускали через 25-милли-

дуру его измерения согласно способу, изложен-

метровую одноразовую иглу. Инъекцию выпол-

ному в работе [11]. Для работы использовали кан-

няли путем размещения груза массой 1 кг на верх-

тилеверы с токопроводящим титановым

нем конце внутреннего поршня шприца, кото-

покрытием серии NSG03/TiN (Nanoworld,

рый был закреплен вертикально. Выпрыскивали

США). Из каждой пробы сканировали по 20 кле-

кровь в микроцентрифужные пробирки объемом

ток каждой популяции, обработку полученных

2 мл. Расстояние от кончика иглы до дна пробир-

сканов проводили в программе Nova (NT-MDT,

ки составляло 15 мм, напряжение сдвига стенки

Зеленоград, Россия).

находилось в пределах 6600 дин/см². Средняя

Жесткость клеточной поверхности оценивали

скорость в игле достигала 5100 см/с, а время про-

по числовым данным модуля Юнга. В основе ме-

хождения форменных элементов равнялось

тода регистрации модуля Юнга лежит измерение

0.6 мс. Следовательно, клетки подвергались воз-

степени деформации поверхности образца при

действию относительно высокого напряжения в

взаимодействии его с вершиной зонда АСМ. В

течение очень короткого времени. Опытные про-

работе использованы модифицированные АСМ-

бы крови подвергали механическому стрессу,

зонды, изготовленные коллективом авторов на

контрольные оставляли без воздействия.

основе полимерных микросфер с радиусом за-

кругления 5 мкм [12]. Измерение модуля Юнга

С целью оценки концентрации макроэргиче-

осуществляли на АСМ ИНТЕГРА Вита в режиме

ских соединений при проведении механического

силовой спектроскопии, согласно алгоритму,

стресса in vitro измеряли их содержание в исследу-

описанному в работе [13]. Из каждой пробы ска-

емых пробах колориметрическим методом [10],

нировали по 20 клеток каждой популяции.

используя фотометр КФК-3 (ЗОМЗ, Сергиев По-

сад, Россия). Концентрацию соединений рассчи-

Результаты экспериментальных исследований

тывали по разности оптических плотностей со-

обрабатывали методами вариационной статисти-

держимого пробирки, в которой провели гидро-

ки. Достоверность различий между контрольны-

лиз фосфатных связей, и пробой без гидролиза

ми и опытными пробами определяли с использо-

фосфатных связей, используя для этого калибро-

ванием t-критерия Стьюдента при p < 0.05 и нор-

вочный график. Калибровочный график строи-

мальном распределении. В работе приведены

ли, используя раствор фосфат-ионов (ГСО 7791-

средние величины (М) и величины статистиче-

2000) в концентрациях от 50 до 500 мкг/мл с ша-

ской ошибки среднего (m).

гом в 50 мкг/мл. Измерение концентрации мак-

роэргичексих соединений выполняли в трех по-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

вторностях для каждой пробы.

При моделировании сдвиговой деформации кле-

Цельную кровь разделяли на эритроцитарную,

ток крови концентрация макроэргичексих соедине-

лейкоцитарную и тромбоцитарную массы путем

ний в крови составила 0.021 ± 0.001 мкмоль/л, что в

центрифугирования при 1500 об/мин в течение

2.6 раза выше по сравнению с контролем

5 мин. Затем отбирали плазму, обогащенную

(0.008 ± 0.001мкмоль/л).

тромбоцитами, и дополнительно центрифугиро-

вали при 2500 об/мин в течение 15 мин, при этом

В условиях механического стресса показано

получали чистую взвесь тромбоцитов. Лейкоци-

изменение биофизических свойств форменных

тарное кольцо отбирали в отдельную пробирку,

элементов крови. Так, потенциал поверхности

полученную суспензию лейкоцитов с помощью

эритроцитов, гранулоцитов, лимфоцитов и тром-

магнита для клеточной сепарации EasySep Magnet

боцитов стал более положительным - увеличился

и набора для выделения лимфоцитов Easy-

соответственно на 30, 32.2, 27.5 и 54.3% (р < 0.05)

Sep/EasySep Direct Human Total Lymphocyte Isola-

по сравнению с контролем (табл. 1).

tion Kit (StemCell Technologies, США) разделяли

При механическом воздействии на клетки мо-

на гранулоциты и лимфоциты.

дуль Юнга форменных элементов крови людей

пожилого возраста снизился: эритроцитов на 22%

Биофизические свойства поверхности фор-

(р < 0.05), гранулоцитов на 19% (р < 0.05), лимфо-

менных элементов крови изучали с использова-

цитов на 23% (р < 0.05) и тромбоцитов на 40%

нием атомно-силового микроскопа (АСМ)

(р < 0.05) по сравнению со значениями в контро-

ИНТЕГРА ВИТА (конфигурация на базе инвер-

ле (табл. 2).

тированного оптического микроскопа Olympus

IX-71, производитель NT MDT, Зеленоград, Рос-

В нашем исследовании воспроизведены усло-

сия). Электрические свойства мембраны эритро-

вия механического «стресса» in vitro, которые, со-

цитов, гранулоцитов, лимфоцитов и тромбоцитов

гласно литературным данным, могут быть при-

оценивали, выполняя на АСМ измерения поверх-

ближены к физиологическим характеристикам

БИОФИЗИКА том 65

№ 6

2020

1116

СЛАДКОВА, СКОРКИНА

Таблица 1. Потенциал поверхности форменных элементов крови

Клеточная популяция

Контроль, мВ

Опыт, мВ

Эритроциты

-15.2 ± 0.8

-10.7 ± 1.2*

Гранулоциты

-25.8 ± 1.2

-17.5 ± 0.6*

Лимфоциты

-39.6 ± 0.2

-28.7 ± 0.3*

Тромбоциты

-16.2 ± 1.3

-7.4 ± 1.1*

Примечание. * - Статистически значимые различия между показателями по t-критерию Стьюдента (p < 0.05).

Таблица 2. Модуль Юнга форменных элементов крови

Клеточная популяция

Контроль, мВ

Опыт, мВ

Эритроциты

4.2 ± 0.01

3.3 ± 0.01*

Гранулоциты

6.3 ± 0.01

5.1 ± 0.01*

Лимфоциты

4.7 ± 0.02

3.6 ± 0.01*

Тромбоциты

4.5 ± 0.03

2.7 ± 0.02*

Примечание. * - Статистически значимые различия между показателями по t-критерию Стьюдента (p < 0.05).

микроциркуляторного русла и способствуют ак-

плазмалеммы гранулоцитов. Рядом работ показа-

тивации пуринергической сигнальной системы

но, что рецепторы к пуриновым соединениям на

форменных элементов крови [8, 9, 14, 15]. В про-

поверхности гранулоцитов, доминирующими

бах крови, подвергшихся механическому «стрес-

подтипами которых являются P2Y1, P2Y2, P2Y4,

су», установлено повышение концентрации мак-

P2Y6 и P2Y11 [20], необходимы для ориентации

роэргических соединений в 2.6 раза, что может

клеток и движения в ответ на хемотаксические

быть связано с экскрецией эритроцитами моле-

стимулы [19, 21]. Важным моментом в нашем ис-

кул АТФ в межклеточное пространство в ответ на

следовании является установление повышения

силовое воздействие со стороны смещающихся

заряда поверхности тромбоцитов, возможно по-

слоев плазмы [1].

средствам связывания продуктов распада макро-

Влияние механического стресса наблюдали в

эргических соединений с Р2Y-рецепторами тром-

изменении биофизических свойств форменных

боцитов [20]. Известно, что тромбоциты прини-

элементов периферической крови людей пожи-

мают активное участие в формировании

лого возраста. В частности, увеличение заряда

внеклеточных ловушек нейтрофилов. Так, увели-

мембраны и снижение жесткости эритроцитов

чение поверхностного потенциала как грануло-

может быть связано с воздействием таких макро-

цитов, так и тромбоцитов может ухудшать про-

эргических соединений, как АТФ и ее производ-

цессы взаимодействия между собой их поверхно-

ных на P2Y13-рецепторы на клеточной поверхно-

стей, что в свою очередь приведет к снижению

сти за счет изменения работы ионных каналов,

воспалительного ответа иммунокомпетентными

клетками в крови людей пожилого возраста.

селективных по отношению к Са²⁺ [16]. Актива-

ция этих рецепторов на мембране эритроцита мо-

Таким образом, при моделировании механи-

жет сопровождаться не только изменениями их

ческого стресса in vitro показано увеличение кон-

функций, но и морфологии клетки, ионного со-

центрации макроэргических соединений в крови

става цитоплазмы и состояния белков цитоскеле-

людей пожилого возраста. Вместе с тем под влия-

та [17]. Аналогичный механизм изменения био-

нием механического стресса произошло сниже-

физических свойств под действием макроэргиче-

ние модуля Юнга и увеличение заряда плазма-

ских соединений может быть характерен и для

леммы у всех четырех популяций форменных эле-

лимфоцитов. На поверхности этих клеток лока-

ментов крови. Полученные экспериментальные

лизованы рецепторы семейства P2X, которые

данные играют важную роль в расширении зна-

представляют собой мембранные ионные каналы

ний о влиянии механической деформации на

[18], контролирующие концентрацию цитозоль-

лейкоциты и тромбоциты, которые являются ос-

ного Ca²⁺ [19].

новными регуляторами гомеостатических про-

При повышении концентрации макроэргиче-

цессов в микроциркуляторном русле, и на эрит-

ских молекул наблюдали также снижение жест-

роциты, участвующие в регуляции реологических

кости и увеличение поверхностного потенциала

показателей и снабжении тканей кислородом.

БИОФИЗИКА том 65

№ 6

2020

ОСОБЕННОСТИ БИОФИЗИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

1117

Дальнейшее изучение морфологии и функцио-

2. Е. В. Узикова, М. Ю. Милорадов и В. Н. Левин,

нальных свойств форменных элементов крови в

Ярославский педагогич. вестн. 3 (3), 108 (2011).

условиях сдвиговой деформации мембран может

3. G. Burnstock, Keio J. Med. 62, 63 (2013).

дать возможность подойти к решению проблем

4. D. Erlinge and G. Burnstock, Purinergic Signalling 1, 1

по коррекции патологических состояний (нару-

(2008).

шение иммунных реакций, нарушение микро-

5. R. Sprung, R. Sprague, and D. Spence, Anal. Chem. 74

циркуляции в сосудистом русле, прогрессирова-

(10), 2274 (2002).

ние сердечно-сосудистых патологий), сопровож-

6. A. Baroja-Mazo, H. Barbera-Gremades, and

дающих старение организма.

P. Pelegrini, Biochim. Biophys. Acta 1828 (1),

(2013).

7. G. G. Yegutkin, Biochim. Biophys. Acta 1783 (5), 673

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

(2008).

Исследование выполнено при финансовой

8. T. Oonishi, K. Sakashita, and N. Uyesaka, Am. J.

Physiol. Soc. 273, 1828 (1997).

поддержке Российского научного фонда по меро-

приятию «Проведение инициативных исследова-

9. A. Trautmann, Sci. Signal. 2 (56), pe6 (2009).

ний молодыми учеными», 2018-2020 гг. (соглаше-

10. Т. Л. Алейникова и Г. В. Рубцова, Руководство к

ние № 18-75-00041).

практическим занятиям по биохимии (Высшая

школа, М., 1988).

11. Е. А. Сладкова и М. Ю. Скоркина, Биофизика 59

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

(2), 310 (2014).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

12. М. Ю. Скоркина, М. З. Федорова, Е. А. Сладкова и

Н. А. Забиняков, Патент РФ № 2466401, Бюл.

интересов.

№ 31. Опубликовано 10.11.2012.

13. М. Ю. Скоркина, М. З. Федорова, А. В. Муравьев

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

и др., Клет. технол. в биол. и мед. 3, 172 (2012).

Исследования выполнены с соблюдением тре-

14. M. Ellworth, C. Ellis, and D. Goldman, Physiology 24,

107 (2009).

бований Хельсинской декларации, было получе-

15. J. Evans, W. Gratzer, N. Mohandas, and K. Parker, J.

но информированное согласие всех субъектов

Sleep, Biophys. J. 94(10), 4134 (2008).

эксперимента в соответствии с рекомендациями

16. D. H. Lee, K. S. Park, I. D. Kong, et al., BMC Immu-

(Декларация по этическим принципам медицин-

nol. 7, 22 (2006).

ских исследований, в которых участвуют люди,

17. L. Wang, G. Olivercrona, and M. Götberg, Circ. Res.

принятая 52-й Генеральной ассамблеей Всемир-

96 (2), 189 (2005).

ной медицинской ассоциации, Эдинбург, Шот-

18. R. A. North, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol Sci.

ландия, октябрь 2000 г.).

371 (1700), 20150427 (2016).

19. W. G. Junger, Nat. Rev. Immunol. 11 (3), 201 (2011).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

20. E. R. Lazarowski, Purinergic Signalling 8, 359 (2012).

1. A. Olivieri, M. Pala, and F.Gandini, PLoS One 8 (7),

21. M. D. Ita and M. H. Vargas, Life Sci. 145 (5), 85

34 (2013).

(2016).

Peculiarities of Biophysical Properties of the Formed Elements in the Blood

of the Elderly under Mechanical Stress in vitro

E.A. Sladkova and M.Yu. Skorkina

Belgorod National Research University, ul. Pobedy 85, Belgorod, 308015 Russia

This study explores the peculiarities of biophysical properties in blood cells of the elderly under mechanical

stress, applied in vitro, which, according to the literature data, triggers the signaling pathways engaged by pu-

rinergic receptor activation. Along with it, we detected a decrease in the stiffness of the cell surface of red

blood cells, granulocytes, lymphocytes and platelets and the surface potential became more positive. Our

findings could increase knowledge about the effect of mechanical deformation on leukocytes and platelets,

which are the main regulators of homeostatic processes in the microvasculature, and on red blood cells in-

volved in the regulation of vascular tone of arterioles and tissue oxygenation in the elderly.

Keywords: mechanical stress, purinergic signaling system, surface potential, Young's modulus

БИОФИЗИКА том 65

№ 6

2020