БИОФИЗИКА, 2021, том 66, № 2, с. 213-218

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.3

УЛЬТРАЗВУК ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ДИАПАЗОНА ВЛИЯЕТ

НА ФОРМИРОВАНИЕ МИКРОЧАСТИЦ ЛЬДА

Институт биофизики клетки РАН - обособленное подразделение ФИЦ «Пущинский научный центр биологических

исследований РАН», 142290, Пущино Московской области, Институтская ул., 3

E-mail: sdg7@list.ru

Поступила в редакцию 26.11.2019 г.

После доработки 25.11.2020 г.

Принята к публикации 30.11.2020 г.

Изучено образование микрочастиц льда при замерзании водных криозащитных растворов. Форма

и размер частиц зависела от состава замороженного раствора. В процессе замерзания растворов при

облучении ультразвуком частотой 0.88 МГц и интенсивностью 1 Вт/см² изменяется форма микро-

частиц льда. Происходит формирование более округлых микрочастиц. В многокомпонентных рас-

творах эффективность воздействия ультразвука с данной частотой и интенсивностью на процессы

замерзания растворов и формирование микрочастиц льда заметно снижается.

Ключевые слова: кpиозащитные pаcтвоpы, кpиомикpоcкопия, микpочаcтицы льда, pаcтpеcкивание

льда, ультразвук.

DOI: 10.31857/S0006302921020010

различных биологических материалов в зависи-

При охлаждения водных растворов возникно-

вение точки зарождения вызывает рост кристал-

мости от параметров ультразвука [6, 7].

лов льда по всему объему этого раствора и замер-

Из физической и коллоидной химии нам из-

зание [1].

вестно, что воздействие ультразвука высокой

После замерзания всего объема жидкости

мощности излучения может привести к разруше-

дальнейшее ее охлаждение до сверхнизких темпе-

нию ковалентных связей в воде и водных раство-

ратур приводит к формированию растрескиваний

рах, в частности, молекула воды может распасть-

за счет термомеханических напряжений в масси-

ся на ионы Н⁺ и ОН^-, в дальнейшем образуя со-

ве льда [2]. Наличие растворенных примесей из-

единение Н₃О [8-10]. Однако интенсивность

меняет как температуру начала образования кри-

сталлов льда [3], так и температуру начала рас-

используемого нами ультразвукового излучения

трескивания и формирования микрочастиц льда

не выходит за терапевтический диапазон, поэто-

[4]. От формы частиц льда может зависеть степень

му разрушение ковалентных связей в нашем слу-

повреждения живых клеток, подвергаемых замо-

чае маловероятно. В то же время при распростра-

раживанию [5].

нении ультразвуковой волны происходит колеба-

тельное движение молекул среды, в результате

Внешние условия существенно изменяют

которого, возможно, происходит изменение па-

формирование частиц льда при замерзании, что

раметров среды и снижается скорость охлажде-

позволяет улучшать эффективность криозащит-

ных растворов, используя дополнительные физи-

ния растворов.

ческие воздействия.

Ранее нами было показано, что скорость охла-

Использование ультразвука при заморажива-

ждения раствора влияет на форму и размер мик-

нии водных растворов приводит к возникнове-

рочастиц льда, образующихся при их замерзании

нию дополнительных точек зарождения кри-

[4]. При этом при уменьшении скорости охлажде-

сталлов льда, в результате чего появляется воз-

ния увеличивались как периметр, так и площадь

можность изменять процесс криоконсервации

микрочастиц льда. Мы предположили, что ис-

пользование ультразвука при охлаждении раство-

Сокращения: ФР - физиологический раствор, Me₂SO -

ра приведет также к изменению площади, пери-

диметилсульфоксид, ЯЖ

- яичный желток, ДВ

дистиллированная вода.

метра и фактора формы микрочастиц льда [11].

213

214

САДИКОВА, АНДРЕЕВ

живали синхронно с опытными, но без ультразву-

ковой обработки.

Для замораживания растворов использовали

кварцевые камеры Фукса-Розенталя. Контролем

являлись пробы, замораживаемые без ультразву-

кового излучения.

С помощью видеоокуляра криомикроскопа

регистрировали сформированные микрочастицы

льда при температуре -196°С. Размер частиц льда

определяли при обработке изображения про-

граммой Trace 1.24b. Для характеристического

описания частиц в плоскости использовали изо-

периметрический фактор.

Изопериметрический фактор определяли по

полученным данным площади и периметра, ха-

рактеризующим форму микрочастиц льда (фак-

Рис. 1. Экспериментальная установка: 1 - пенопла-

тор формы, параметр F_f). Значение данного фак-

стовая коробка объемом 8 · 10³ см³; 2 - пенопласто-

тора можно вывести из изопериметрического не-

вый плотик; 3 - кварцевая камера Фукса-Розенталя;

равенства:

4 - ультразвуковой генератор УЗД 1.01Ф (Россия), ча-

стота 0.88 МГц; 5 - компьютер; 6 - ATT-2006 - элек-

4πS ≤ P²,

(1)

тронный термометр с термопарой (медь/константан,

где S - площадь, P - периметр.

диаметр 0.1 мм), термопара в опытном образце, на пе-

риферии; 7 - опытный и контрольный образцы.

Равенство достигается, когда кривая является

идеальной окружностью. Доказательство этого

неравенства было приведено в работе [13]. Если

МЕТОДЫ

мы имеем замкнутую кривую, то фактор формы

Используемые растворы. Все рабочие растворы

будет выражен как

готовили на дистиллированной воде. Использо-

F_f = 4πS/P²,

(2)

вали следующие образцы: физиологический рас-

твор для осетровых рыб [12] (ФР), 10% диметил-

где P - длина периметра замкнутой кривой, S -

сульфоксида на физиологическом растворе

площадь круга с тем же периметром.

(ФР + Me₂SO), 10% диметилсульфоксида и 10%

Обычно F_f ≤ 1, но в случае, если кривая являет-

яичного желтка (ЯЖ) на физиологическом рас-

ся идеальным кругом, F_f = 1. Таким образом, фак-

творе (ФР + Me₂SO + ЯЖ). Состав физиологиче-

тор F_fвыражает степень отклонения формы дан-

ского раствора (в мM): NaCl - 84, KCl - 3,

ной фигуры от окружности. Данный фактор мы

CaCl₂ - 3, NaHCO₃ - 23, pH 7.6.

использовали для описания микрочастиц льда,

Для сравнения брали дистиллированную воду

которые образуются при глубоком охлаждении

(ДВ).

льда, полученного из криозащитных растворов.

Площадь и периметр частиц льда измеряли по по-

Экспериментальная установка. Для заморажи-

лученным экспериментальным микрофотогра-

вания с использованием ультразвука использова-

фиям. Используя эти данные, мы рассчитывали

ли установку (рис. 1), которая состоит из пено-

безразмерный коэффициент, характеризующий

пластового бокса для замораживания образцов в

степень округлости.

парах жидкого азота до -150°С. После того как

температура среды достигала -150°С, образец по-

Cтатиcтичеcкую обpаботку пpоводили c помо-

мещали в жидкий азот (-196°С). Для регистрации

щью пpогpаммы SigmaPlot 13 (Demo). Pезультаты

использовали микроскоп Orthoplan (Carl Zeiss,

были представлены в виде cpеднего аpифмети-

Германия) с видеоокуляром ВР-32 (Россия).

чеcкого ± cтандаpтная ошибка (М ± m) для

P ≤ 0.05.

Раствор замораживали при направленном воз-

действии ультразвуковой волны частотой

0.88 МГц и интенсивностью 1 Вт/см². В качестве

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

источника излучения использовали аппарат для

На рис. 2 можно увидеть изображения микро-

ультразвуковой терапии УЗТ 1.01Ф (Россия).

частиц льда. Видно, что при облучении замора-

Источник излучения находился на расстоянии

живаемого раствора ультразвуком размер микро-

2 см от образца все время замораживания в тон-

частиц льда уменьшается. Также заметно, что

ком слое (0.2 мм). Объем образца - 10 мкл. В ка-

микрочастицы для раствора «ФР + Me₂SO» ста-

честве контроля брали образцы, которые замора-

новятся более округлыми с размытыми граница-

БИОФИЗИКА том 66

№ 2

2021

216

САДИКОВА, АНДРЕЕВ

Видно, что по мере усложнения состава рас-

твора за счет антифризных компонентов (Me₂SO)

и липидно-белкового комплекса (яичный жел-

ток) увеличивается форм-фактор и одновремен-

но снижается эффект ультразвука.

Процесс замерзания растворов при воздей-

ствии ультразвукового облучения сложен и зави-

сит от многих факторов. Нами было показано

[16], что воздействие ультразвука на раствор в на-

чале охлаждения убирает низкотемпературный

скачок, который происходит из-за эффекта пере-

охлаждения. Вероятно, это происходит из-за по-

стоянного акустического давления ультразвуко-

вой волны на замораживаемый раствор, влияния

ультразвука на температуру и вязкости раствора,

что приводит к образованию дополнительных то-

чек зарождения. После достижения заморажива-

Рис. 3. Изопериметрический фактор для микроча-

стиц льда растворов в контроле и с использованием

емого раствора низких температур, физические

ультразвука (температура -196°С): 1 - ДВ, 2 - ФР,

свойства раствора изменяются таким образом,

3 - Me₂SO + ФР, 4 - Me₂SO + ФР + 10% ЯЖ.

что нужно учитывать влияние ультразвука на

упругость и механическое напряжение образо-

вавшего льда в виде воздействия продольных

ми. При облучении криозащитного раствора с до-

сдвиговых волн и, как следствие, изменение об-

бавлением яичного желтка границы микрочастиц

щей скорости деформации среды под действием

стираются.

ультразвука.

В результате обработки данных был определен

Авторы работы [17] показали зависимость об-

основной параметр для анализа изменения харак-

разования микротрещин при замерзании крио-

тера образования льда - фактор формы (рис. 3,

протекторов в тонких слоях от общей скорости

таблица).

деформации среды, которая является суммой

скорости упругой деформации, скорости вязкой

Показано, что ультразвук оказывает влияние

деформации и скорости термической деформа-

на формирование микрочастиц льда. Из рис. 3

ции:

видно, что при облучении ультразвуком фактор

формы микрочастиц увеличивался. Это говорит о

dσ σ

ε=

+β

(3)

том, что под воздействием ультразвуковой волны

E dt

3η

формируются микрочастицы льда более округлой

где σ - механическое напряжение, E - модуль

формы. Это согласуется с экспериментами, опи-

упругости, η - вязкость, β - коэффициент тепло-

санными в работе [14], которые показали, что в

вого расширения, Т - температура, t - время.

среднем округлость микрочастиц льда 10%-го

Так как в нашей работе замерзание растворов

раствора маннита увеличивается под воздействи-

происходит в тонком слое, можно сказать, что мы

ем ультразвука и при увеличении акустической

имеем только продольное распространение уль-

мощности.

тразвуковой волны. Поэтому исходя из того, что

Образование льда, в котором при прочих рав-

скорость распространения продольных волн име-

ных условиях формируются более округлые ча-

ет зависимость от модуля упругости и плотности

среды, модуль упругости можно выразить через

стицы, способствует повышению выживаемости

плотность (ρ) и скорость продольной волны (с)

клеток в процессе криоконсервации-оттаивания

[15].

как Е = с²ρ.

Величина изопериметрического фактора для микрочастиц льда исследованных растворов

ДВ

ФР

ФР + Me₂SO

ФР + Me₂SO + ЯЖ

F_k

F_us

F_k

F_us

F_k

F_us

F_k

F_us

0.67 ± 0.03

0.74 ± 0.02

0.72 ± 0.03

0.77 ± 0.03

0.79 ± 0.03

0.82 + 0.02

0.86 ± 0.02

0.89 ± 0.02

БИОФИЗИКА том 66

№ 2

2021

УЛЬТРАЗВУК ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ДИАПАЗОНА

217

В нашем случае при замерзании водных рас-

ности замораживаемых клеток. Одним из повре-

творов образование микротрещин приблизитель-

ждающих факторов при криоконсервации живых

но начинается после -50°С (для воды) и ниже [4].

организмов является разрушение клеток микро-

Авторы работы [17] указывают, что при низких

частицами льда. Как видно из нашего исследова-

температурах вклад вязкости в скорость упругой

ния, использование ультразвука может быть пер-

деформации невелика. Также можно сказать, что

спективным для модификации образующихся

при использовании ультразвука с параметрами

микрочастиц в сторону формирования более

1 Вт/см² при низких температурах вклад ультра-

округлых и менее травмирующих биоматериал

звука в термическую деформацию будет невелик.

форм при криоконсервации. Мы предполагаем,

В результате в выражении (3) значимым останет-

что использование ультразвука может быть эф-

ся только первый компонент.

фективным инструментом при создании новых

способов и методов криоконсервации генетиче-

Известно, что механическое напряжение мож-

ского материала.

но выразить через силу, действующую на единицу

площади σ = F/S. В нашем случае F - это сила ра-

диационного давления, которую можно записать

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

как F = 2IS/c, где I - интенсивность ультразвука,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

S - площадь сечения, c - скорость звука в среде.

интересов.

В результате преобразования получаем:

ε=

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая работа не содержит описания ис-

Видно, что в нашем случае основной вклад в

следований с использованием людей и животных

образование микротрещин вносит скорость и ин-

в качестве объектов.

тенсивность звука, и плотность среды.

При изменении состава замораживаемой сре-

ды скорость звука и плотность существенно изме-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

няются в зависимости от солевых или органиче-

1. A. I. Zhmakin, Fundamentals of Cryobiology: Physical

ских включений. Из выражения (4) мы видим, что

Phenomena and Mathematical Models (Springer, Ber-

скорость деформации среды значительно умень-

lin, 2008).

шается с ростом скорости звука и плотности

2. Y. Rabin and P. S. Steif, in Advances in Biopreservation,

среды.

Ed. by J. G. Baust and J. M. Baust (Taylor & Francis

Group, 2007), pp. 359-379.

Как было сказано ранее, с увеличением кон-

3. А. Г. Стромберг и Д. П. Семченко, Физическая хи-

центрации солей и органических добавок при об-

мия (Высш. шк., М., 1999).

лучении ультразвуком фактор формы продолжает

4. А. А. Андpеев, Д. Г. Cадикова, Н. А. Ивличева и

увеличиваться. В это же время вклад ультразвука

А. В. Борода, Биофизика 62 (2), 213 (2017).

при формировании микрочастиц льда снижается.

5. F. W. Kleinhans, J. F. Guenther, D. M. Roberts and

На рис. 3 показано, что чем более сложный рас-

P. Mazur, Cryobiology 52 (1), 128 (2006).

твор используется, тем меньший вклад ультразву-

6. R. Chow, R. Blindt, R. Chivers, and M. Povey, Ultra-

ка при формировании микрочастиц. В то же

sonics 43, 227 (2005).

время увеличивающаяся размытость границ мик-

7. R. Chow, R. Blindt, A. Kamp, and P. Grocutt, Ultra-

рочастиц при ультразвуковом воздействии, веро-

son. Sonochem. 11, 245 (2004).

ятно, связана с уменьшением скорости деформа-

8. A. Hottot, K. Nakagawa, and J. Andrieu, Chem. Eng.

ции среды во время ее замерзания.

Res. Des. 86, 193 (2008).

Предполагается что стеклование криозащит-

9. В. И. Кабачный и др., Физическая и коллоидная

ного раствора также увеличивает шансы получить

химия (Изд-во НФАУ, Харьков, 2001).

качественный материал после криоконсерва-

10. Н. В. Попова и С. А. Фатеева, Вестн. ЮУрГУ. Сер.

ции-оттаивания [18]. В нашем случае (рис. 2ж,з)

«Пищевые и биотехнологии» 2 (1), 30 (2014).

наблюдается тенденция к стиранию границ мик-

11. Д. Г. Садикова и А. А. Андреев, Евразийское науч-

рочастиц льда. Возможно, используя ультразву-

ное объединение, № 6-3 (52), 162 (2019).

ковое воздействие на замерзание растворов при

12. E. Burzawa-Gerard, B. F. Goncharov, A. Dumas, and

других режимах (например, используя другие ча-

Y. A. Fontaine, Gen. Comp. Endocrinol. 29 (4), 498

стоты), мы сможем приблизиться к эффекту пол-

(1976).

ного стирания границ микрочастиц или к стекло-

13. E. Schmidt, Die Brunn-Minkowskische I. Math.

ванию в будущем, что является следующим эта-

Nachr. 1, 81 (1948).

пом нашей работы.

14. M. Saclier, R. Peczalski, and J. Andrieu, Chem. Engi-

Можно предположить, что воздействие уль-

neer. Sci. 65, 3064 (2010).

тразвука в ходе замораживания криозащитных

15. A. A. Andreev, D. G. Sadikova, E. N. Gakhova, et al.,

растворов будет способствовать лучшей сохран-

Biophysics 54 (5), 612 (2009).

БИОФИЗИКА том 66

№ 2

2021