БИОФИЗИКА, 2021, том 66, № 2, с. 365-371

БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ

УДК 577.323

УРОВНИ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ДНК В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

И ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК ЛЕЙКОЦИТОВ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ

РАЗНОГО ПОЛА И ВОЗРАСТА

*Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 Пущино, Институтская ул., 3

**Академия биологии и биотехнологии им. Д.И. Ивановского Южного федерального университета,

344090, Ростов-на-Дону, просп. Стачки, 194/1

E-mail: kuzglu@rambler.ru

Поступила в редакцию 25.11.2020 г.

После доработки 25.11.2020 г.

Принята к публикации 11.12.2020 г.

Изучали уровни внеклеточных ядерной и митохондриальной ДНК сыворотки крови и повреждений

ДНК лейкоцитов у здоровых доноров разного пола и возраста. Показано, что базовый уровень по-

вреждений ДНК лейкоцитов и уровни ДНК сыворотки сильно варьируют у разных доноров. Базо-

вый уровень повреждений ДНК лейкоцитов не был ассоциирован с наличием хронических заболе-

ваний или проф. вредности у пожилых доноров. Обнаружили, что концентрации внеклеточных

ДНК в целом выше у мужчин, чем у женщин. Наблюдается тенденция увеличения определяемого

по ΔCt относительного количества копий митохондриальной ДНК у женщин по сравнению с муж-

чинами; у пожилых индивидов оно существенно варьирует у обоих полов, возможно, вследствие

возрастных физиологических изменений. Необходимо учитывать пол и возраст пациентов при ис-

пользовании такого показателя, как уровень внеклеточных ДНК сыворотки крови для диагностики

и мониторинга.

Ключевые слова: доноры разного пола и возраста, внеклеточная ДНК сыворотки крови, %TDNA, Comet

assay, митохондриальная ДНК.

DOI: 10.31857/S0006302921020186

ния фагоцитами [1, 2, 5]. У онкологических боль-

Поиск чувствительных и малоинвазивных

ных регистрировались повышенные уровни

биомаркеров, позволяющих выявить патологиче-

вкДНК, что, как правило, связывали с развитием

ские состояния организма, в первую очередь -

опухоли [6, 8-10], среднее количество вкДНК

сердечно-сосудистые, инфекционные и онколо-

плазмы варьировало от менее 10 нг/мл до более

гические заболевания, в настоящее время остает-

чем 1500 нг/мл [2]. Повышение уровня вкДНК

ся актуальным. Ранее в качестве одного из таких

наблюдали и у перенесших инфаркт миокарда,

биомаркеров предлагалось использовать внекле-

физическую травму, либо воспаление [1, 5]. Что

точную ДНК (вкДНК), которую можно сравни-

касается состава выборки, то в большинстве слу-

тельно легко выделить из биологических жидко-

чаев результаты исследований уровня вкДНК бы-

стей организма, например крови [1-3]. Считает-

ли получены на смешанных группах мужчин и

ся, что вкДНК - это фрагменты ядерного (яДНК)

женщин [11-15], что не позволяет выявить разли-

и митохондриального (мтДНК) геномов, попада-

чия в ее концентрации в зависимости от таких па-

ющие в кровоток в результате разрушения клеток

раметров, как возраст и пол. Однако для практи-

(апоптоз, некроз) или активной секреции ДНК во

ческих целей необходимо знать, как изменяется

внеклеточное пространство [1, 4-7]. У здоровых

концентрация вкДНК в сыворотке/плазме крови

людей концентрация циркулирующей вкДНК

у представителей разных по возрасту и различаю-

низкая, так как большинство нежизнеспособных

щихся по полу групп доноров.

клеток эффективно удаляются из кровообраще-

Известно, что у здоровых доноров источником

Сокращения: %TDNA - процент ДНК в хвосте кометы (per основного количества вкДНК являются ядросо-

cent of DNA in a comet tail), вкДНК - внеклеточная ДНК,

держащие клетки крови [5]. Обнаружено, что

яДНК - ядерная ДНК, мтДНК - митохондриальная ДНК,

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме

уровень повреждений ДНК лейкоцитов перифе-

реального времени.

рической крови, определяемый методом «коме-

365

366

МИТРОШИНА и др.

та-тест» (Comet assay), различался у здоровых до-

возраст которых был 65 лет (48-78 лет). Вторая

норов [16]. В норме уровень повреждений ДНК

группа (группа 2, n = 20) состояла из доноров,

клеток обусловлен как функционированием

средний возраст которых был 26 лет (20-30 лет).

ДНК, так и процессами репарации, поскольку

Венозная кровь была собрана в пробирки, обра-

ДНК постоянно подвергается спонтанной тепло-

ботанные Na₂-ЭДТА. 500 мкл венозной крови

вой и гидролитической деградации, окислению и

центрифугировали при 400 g в течение 20 мин.

метилированию [17]. Показано, что по сравне-

Сыворотка была отобрана, перенесена в отдель-

нию со здоровыми донорами у пациентов с диа-

ную пробирку и заморожена при -20°С. Выделе-

бетом обоих типов, ишемической болезнью серд-

ние вкДНК проводили после размораживания

ца, ожирением, рядом онкологических заболева-

сыворотки по стандартной методике: обработка

ний регистрировалось увеличение уровня

протеиназой К, фенольно-хлороформная экс-

повреждений ДНК лейкоцитов [18-23], что, воз-

тракция c последующим осаждением двойным

можно, вносило вклад в уровень вкДНК. В насто-

объемом этанола с ацетатом натрия до конечной

ящее время метод «комета-тест» используется,

концентрации 0.2 М.

как правило, в токсикологических исследованиях

Количественную оценку экстрагированной

для выявления одно- и двухнитевых разрывов и

двуцепочечной ДНК выполняли с помощью на-

щелочелабильных (апуриновых/апиримидино-

бора Quant-iT^TM dsDNA HS Assay Kit на приборе

вых) сайтов в ДНК индивидуальных клеток. Од-

нако предпринимаются попытки использовать

QubitTM fluorometer (Invitrogen Corp., США).

уровень повреждений ДНК клеток для монито-

Оценку достоверности различий по уровню кон-

ринговых исследований [24]. Как соотносятся

центрации ДНК сыворотки крови осуществляли

показатели уровня повреждений ДНК ядросодер-

на основании U-критерия Уилкоксона (Манна-

жащих клеток крови и концентрации вкДНК сы-

Уитни) (р = 0.05).

воротки/плазмы крови у человека - не известно.

ВкДНК крови доноров использовали в каче-

С другой стороны, несмотря на то что такой пока-

стве матрицы при постановке ПЦР в режиме ре-

затель, как количество вкДНК, не является стро-

ального времени (ПЦР-РВ) на приборе 7300 Real-

го специфичным, он может быть дополнительной

Time PCR System (Applied Biosystem, США) в

характеристикой патологического процесса в

Центре коллективного пользования ИТЭБ РАН.

комбинации с другими маркерами [1].

Праймеры для амплификации фрагментов генов

В настоящей работе мы исследовали кровь

ДНК человека: β-actin

- F

5′-GCACCA-

только здоровых доноров из разных возрастных

CACCTTCTACAATGA-3′ R

5′-GTCATCT-

групп; у пожилых доноров, имеющих хрониче-

TCTCGCGGTTGGC-3′; ND1 - F 5′-CCCTA-

ские заболевания, мы оценивали также уровни

AAACCCGCCACATCT-3′, R 5′- GAGCGATG-

повреждений ДНК лейкоцитов крови. Из-за спе-

GTGAGAGCTAAGGT-3′. Реакционная смесь:

цифичности митохондриального генома мито-

1× буфер SYBR^®Green PCR Master Mix, 250 нМ

хондрии являются чувствительной мишенью к

праймеров, 4 нг матричной ДНК. Условия ПЦР:

воздействию различных повреждающих факто-

50°С, 2 мин - 1 цикл; 95°С, 10 мин - 1 цикл; 95°С,

ров [25]. Поскольку вклад в общий уровень

15 с, 60°С, 1 мин - 40 циклов.

вкДНК вносят яДНК и мтДНК, их уровни мы

ΔCt рассчитывали по формуле ΔCt = Ct_target - Ct_ref,

оценивали отдельно.

где Ct_target- значения Ct, полученные в ходе ПЦР-РВ

Целью настоящей работы было: выявить, как

для митохондриального гена ND1, Ct_ref- значения Ct,

соотносится уровень суммарной вкДНК (ядер-

ной и митохондриальной) и мтДНК сыворотки

полученные в ходе ПЦР-РВ для ядерного гена β-ac-

крови с возрастом и полом у здоровых доноров;

tin. Оценку достоверности различий по значениям Ct

как соотносятся уровни повреждений ДНК с на-

осуществляли на основании U-критерия Уилкоксона

личием хронических заболеваний у пожилых до-

(Манна-Уитни) (р = 0.05).

норов.

Расчет эффективности реакции ПЦР-РВ осу-

ществляли по формуле Е = (10^-1/slope - 1)×100,

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

рекомендованной производителем. При построе-

нии графика зависимости логарифма концентра-

В работе были использованы аликвоты веноз-

ции продукта амплификации и значения Ct на-

ной крови условно здоровых доноров разного по-

блюдалась линейная зависимость. Коэффициен-

ла и возраста, проходивших плановое обследова-

ты наклона (slope) для ND1 составили -3.4, для β-

ние при соблюдении процедуры оформления

actin - 3.6, что соответствует 96 и 90% эффектив-

письменного согласия. Условно здоровыми счи-

ности соответственно.

тались доноры, не имеющие на момент забора

Определение относительного количества

крови инфекционных или обострения хрониче-

мтДНК осуществлялось сравнительным методом

ских заболеваний. Первую группу (группа 1,

n = 30) составили мужчины и женщины, средний

ΔCt (ΔΔCt метод) по формуле 2-ΔΔCt × 100%.

БИОФИЗИКА том 66

№ 2

2021

УРОВНИ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ДНК

367

ΔΔCt = ΔCt_{test sample}- ΔCt_{calib. sample}, где ΔCt_{test sample}-

лом возрасте люди, как правило, испытывают по-

значения ΔCt, полученные при обработке резуль-

следствия работы во вредных условиях и наличия

татов в группах молодых женщин и обеих группах

ряда заболеваний, то в этой связи исследовали

пожилых доноров; calibrator sample - значения

уровни повреждений ДНК лейкоцитов крови у

ΔCt, полученные при обработке результатов в

60-70-летних доноров, имеющих хронические

группе молодых мужчин. Данное значение ΔCt

заболевания вне фазы обострения или без них

было взято в качестве калибратора, поскольку в

(табл. 1). Из табл. 1 видно, что наблюдаются су-

молодом возрасте наблюдается более высокая по

щественные различия в базовых уровнях повре-

сравнению с пожилыми суммарная ферментатив-

ждений ДНК лейкоцитов венозной крови инди-

ная активность, а мужской пол характеризуется

видуумов. %TDNA у доноров № 25 и № 30 был не-

большей стабильностью гормонального фона.

сколько выше контрольного. При этом значение

Значения относительного количества мтДНК в

%TDNA не было ассоциировано с наличием хро-

исследуемых группах выражались в процентах от-

нических заболеваний или проф. вредности, по-

носительно такового в группе молодых доноров-

видимому, вследствие успешно применяемой те-

мужчин, взятого за 100%. При расчете групповых

рапии. Очевидно, что разница в уровнях %TDNA

ΔCt значения Ct_target и Ct_ref были взяты как сред-

индивидуумов обусловлена их генетическими и

эпигенетическими особенностями.

ние арифметические по каждой исследуемой

группе.

Из сыворотки этих проб крови и проб крови

других доноров разного возраста была выделена

Для определения уровня повреждений ДНК

ДНК. Обнаружили, что количество вкДНК, так

лейкоцитов крови использовали щелочную вер-

же как и %TDNA, сильно варьирует у разных до-

сию метода «комета-тест» [26], эксперименты

норов. Поэтому мы предприняли попытку раз-

проводили, как описано в работе [16]. Для приго-

граничения исследуемой популяции на четыре

товления слайдов использовали цельную кровь,

подгруппы по половому и возрастному призна-

разведенную в шесть раз фосфатно-солевым бу-

кам (табл. 2). Из табл. 2 видно, что концентрации

фером, рН 7.2, содержащим 0.001 моль/л ЭДТА.

суммарной ядерной и митохондриальной вкДНК

Обработку изображений выполняли с помощью

в целом выше у мужчин по сравнению с женщи-

специализированного программного обеспече-

нами, что согласуется с литературными данными

ния, где реализованы алгоритмы расчета стан-

[12, 13]. Обнаружено, что у доноров одного и того

дартных параметров комет [27]. Для оценки уров-

же пола концентрации вкДНК достоверно разли-

ня повреждений ДНК использовали параметр -

чались по U-критерию Манна-Уитни (p ≤ 0.05) в

долю ДНК в хвосте кометы в процентах (per cent

зависимости от возраста: у молодых женщин она

of DNA in a comet tail - %TDNA). Для каждой экс-

ниже, чем у пожилых; у молодых мужчин она вы-

периментальной единицы анализировали по три

ше, чем у пожилых. Обнаружены достоверные

слайда, не менее чем по 50 клеток на слайд, со-

гендерные отличия в концентрации вкДНК для

гласно работе [28]. Статистический анализ про-

групп молодых доноров и отсутствие таковых в

водили с использованием t-критерия Стьюдента

группах пожилых доноров. Отсутствие гендерных

(р < 0.05).

различий у пожилых доноров, возможно, связано

В работе использовали фенол, хлороформ,

с изменением клеточного метаболизма в пожи-

ацетат натрия, агарозу, акриламид, азотнокислое

лом возрасте. Так, показано, что с увеличением

серебро (ООО «Компания Хеликон», Россия).

возраста доноров наблюдается тенденция к

Флуоресцентный краситель SybrGreen10000Х и

уменьшению величины %TDNA у лейкоцитов

реакционная смесь 2Х SYBR® Green PCR Master

капиллярной и венозной крови [16]. Из изложен-

Mix были приобретены у ООО «Биотех-Инду-

ного видно, что в случае использования уровня

стрия» (Россия) и Applied Biosystem (Великобри-

вкДНК в качестве дополнительного средства в

тания) соответственно.

диагностике различных патологий, необходимо

учитывать пол пациентов, особенно у доноров

молодого возраста.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Уровни мтДНК сыворотки по результатам

Уровни повреждений ДНК лейкоцитов и содер-

ПЦР-РВ. В образцах вкДНК сыворотки опреде-

жание вкДНК сыворотки. Известно, что у здоро-

ляли уровни яДНК и мтДНК по Ct, полученные в

вых доноров источником основного количества

ходе ПЦР-РВ для митохондриального гена ND1 и

вкДНК являются ядросодержащие клетки крови

ядерного гена β-actin. В табл. 3 представлены зна-

[5]. Уровни повреждений ДНК лейкоцитов крови

чения Ct, условно соответствующие количествам

различаются у разных доноров [16]. В наших

копий ядерной и митохондриальной ДНК в ис-

условиях эксперимента средние значения %TD-

следуемом образце. По разнице между Ct для гена

NA у здоровых доноров в основном не превыша-

β-actin и Ct для гена ND1, иначе -delta Ct (ΔCt),

ли 10% [16], что позволяет считать этот уровень

можно судить об уровне мтДНК. Поскольку зна-

базальным (контрольным). Поскольку в пожи-

чения Ct находятся в обратной зависимости от

БИОФИЗИКА том 66

№ 2

2021

368

МИТРОШИНА и др.

Таблица 1. Уровень повреждений ДНК лейкоцитов венозной крови мужчин и женщин 60-70 лет, имеющих

хронические заболевания

№

Пол

Воз-

Наличие

Профессиональ

Лимфоциты,

Моноциты,

Гранулоциты,

%ТДНК

раст,

хронических

ная вредность

10⁹/л

годы

заболеваний

Распространенный

2.5

0.4

3.8

3.2 ± 0.6

ОХ

ГБ

1.7

0.2

3.2

2.8 ± 0.6

Малярия в детстве

2.1

0.4

3.7

7.5 ± 1.0

ГБ

Химические

1.9

0.3

2.2

3.8 ± 1.7

реактивы

Ишемическая

Кислоты,

2.1

0.2

4.9

3.9 ± 0.6

болезнь сердца, ГБ

щелочи

ГБ

Вибрация, шум

1.8

0.3

1.5

8.9 ± 0.7

Хронический .

Вибрация, шум

2.9

0.3

2.9

5.3 ± 0.7

геморрой

Хронический

1.6

0.3

3.3

9.5 ± 0.9

холецистит

Хронический

Химические

0.3

5.8

4.3 ± 0.6

холецистит

реактивы

ГБ

Кислоты,

0.5

4.5

9.4 ± 0.8

щелочи

ГБ

1.9

0.3

1.9

6.1 ± 1.1

Мочекаменная

2.5

0.4

4.6

6.8 ± 0.7

болезнь

Варикоз

1.8

0.4

3.9

3.9 ± 0.6

ГБ

1.4

0.2

2.2

3.3 ± 0.7

Ревматоидный

0.3

2.6

2.4 ± 0.4

артрит

ГБ, ОХ

0.2

1.2

4.8 ± 0.8

ГБ, ОХ

2.5

0.4

4.2

4.5 ± 1.0

Хронический

Органические

3.4

0.5

1.6

10.9 ± 1.0

холистопанкреатит

растворители

Ревматизм

0.2

2.2

6.3 ± 0.8

0.2

3.5

6.5 ± 1.2

1.9

0.2

2.3

9.7 ± 1.5

1.9

0.2

2.7

8.7 ± 1.0

2.3

0.4

4.2

11 ± 1.3

Тетраэтилсвинец

2.9

0.6

6.5

8.3 ± 1.5

Тетраэтилсвинец

2.7

0.3

4.9

16.5 ± 1.8

2.4

0.4

2.5

3.0 ± 0.6

2.6

0.4

4.1

5.1 ± 1.0

Тетраэтилсвинец

2.4

0.6

3.6

5.3 ± 0.7

3.4

0.5

3.8

2.6 ± 0.6

3.2

0.4

4.0

13.4 ± 2.2

Примечание. ОХ - остеохондроз, ГБ - гипертоническая болезнь. Данные по %ТДНК приведены в виде M ± m.

БИОФИЗИКА том 66

№ 2

2021

УРОВНИ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ДНК

369

Таблица 2. Концентрация суммарной вкДНК в сыворотке крови доноров разного пола и возраста

Концентрация вкДНК,

Доноры

Возраст, годы

Количество доноров

мкг/мл

1.3 ± 0.3

20-32

(0.7 - 1.8)

Мужчины

0.6 ± 0.4

60-74

(0.25 - 1.5)

0.1 ± 0.1

20-30

(0.05 - 0.4)

Женщины

0.4 ± 0.3

71-78

(0.1 - 1.0)

Примечание. Данные по концентрации вкДНК приведены в виде M ± SD.

Таблица 3. Уровни яДНК и мтДНК сыворотки крови доноров

Группы доноров

Подгруппы

Ct ND1

Ct β-actin

ΔCt

Количество

доноров

Молодые мужчины

17.3 ± 1.1

23.8 ± 0.9

6.5 ± 1.6

(20-30 лет)

Молодые женщины

–

15.3 ± 1.5*

25.4 ± 1.6*

10.1 ± 2.0*

(20-30 лет)

Пожилые мужчины

18.0 ± 1.8

23.0 ± 1.3

5.0 ± 0.7*

(48-74 лет)

17.3 ± 2.1

27.1 ± 2.7*

9.8 ± 1.8*

Пожилые женщины

18.6 ± 1.6

23.4 ± 1.3

4.8 ± 1.0*

(53-78 лет)

15.0 ± 2.0*

25.0 ± 2.3

10.0 ± 2.2*

Примечание. Данные приведены в виде M ± SD. * - Достоверные отличия от группы молодых мужчин по U-критерию

Манна-Уитни (p ≤ 0.05).

количества копий изучаемых фрагментов ДНК,

так и женщин, на две подгруппы по значению ΔCt

то видно, что количество копий мтДНК в группе

со средними значениями примерно 5 и 10 (под-

молодых женщин превышает таковое в мужской

группы А и Б соответственно). При расчете отно-

группе, и эти различия достоверны. По литера-

сительного количества мтДНК по методу ΔΔCt

турным данным, в экспериментах на цельной

эти различия сохранялись (рисунок). Видно, что

крови пожилых доноров было показано, что со-

уровень мтДНК в подгруппах Б у мужчин и жен-

держание мтДНК значительно выше у женщин

щин существенно выше, чем в подгруппах А. Воз-

по сравнению с мужчинами, и эти различия были

можно, что это разделение связано с физиологи-

связаны не только с полом, но и с возрастом; со-

ческими изменениями у доноров, ассоциирован-

держание мтДНК незначительно увеличилось до

ными с возрастом. Из литературы известно, что

пятого десятилетия жизни и уменьшилось у более

содержание мтДНК падало с ростом количества

пожилых индивидов и у женщин в постменопаузе

лейкоцитов и возрастало при увеличении уровня

[29, 30]. Следует отметить, что в этих эксперимен-

тромбоцитов, что было связано и с гендерными

тах значительный вклад в определяемый уровень

различиями. У женщин по сравнению с мужчина-

вкДНК вносили клетки крови. Тем не менее мож-

ми наблюдали большее количество тромбоцитов

но предположить, что тенденция более высокого

и лейкоцитов, что, по мнению авторов, отража-

уровня мтДНК крови у женщин по сравнению с

лось на уровне мтДНК [29]. Возможно, что обна-

мужчинами сохраняется и в уровнях мтДНК из

руженное нами разделение пожилых доноров по

сыворотки крови, что видно из данных, получен-

уровням мтДНК ассоциировано с изменениями

ных на молодых донорах (табл. 3).

соотношений лейкоцитов и тромбоцитов в кро-

Достоверных гендерных отличий в группах по-

ви, а также и с различным уровнем повреждений

жилых доноров выявлено не было. Однако было

ДНК лейкоцитов (табл. 1 и 2). Кроме того, как из-

обнаружено очевидное разделение, как мужчин,

вестно из литературных данных, на уровень вне-

БИОФИЗИКА том 66

№ 2

2021

370

МИТРОШИНА и др.

фундаментальных аспектов молекулярной диа-

гностики и митохондриальной фармакологии».

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

интересов.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все процедуры, выполненные в исследовании

с участием людей, соответствовали этическим

стандартам Хельсинской декларации 1964 г. и ее

последующим изменениям. От участников иссле-

дования было получено информированное доб-

ровольное согласие.

Относительное количество мтДНК в сыворотке

пожилых доноров подгруппы А (ΔCt = 4.8-5.0) и

подгруппы Б (ΔCt = 9.8-10). Горизонтальная линия -

относительное количество мтДНК в группе молодых

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

мужчин..

C. Kohler, Z. Barekati, R. Radpour, and X. Y. Zhong,

Anticancer Res. 31, 2623 (2011)

клеточных ДНК оказывала влияние и гормональ-

Y. I. Elshimali, H. Khaddour, M. Sarkissyan, et al., Int.

ная регуляция: было показано, что содержание

J. Mol. Sci.

(9),

18925

(2013). DOI:

мтДНК в крови женщин снижалось при потреб-

10.3390/ijms140918925

лении эстропрогестагена [29]. Поскольку с увели-

D. Chandrananda, N. P. Thorne, M. Bahlo, BMC

чением возраста доноров в целом наблюдали

Med. Genomics. 8, 29 (2015). DOI: 10.1186/s12920-

уменьшение уровня мтДНК [29, 30], то возможно

015-0107-z

также, что тенденция к понижению уровня

R. R. Zachariah, S. Schmid, N. Buerki, et al., Obstet.

вкДНК в крови связана и с уменьшением базово-

Gynecol.

112

(4),

843

(2008).

DOI:

го уровня повреждений ДНК лейкоцитов крови с

10.1097/AOG.0b013e3181867bc0

возрастом, что было показано нами ранее [16].

С. Н. Тамкович, В. В. Власов и П. П. Лактионов

Следует отметить, что в этой работе представлены

Молекуляр. биология

(1),

(2008). DOI:

средние значения уровня мтДНК по группам, мы

10.1007/s11008-008-1002-x

не соотносили уровни вкДНК с %TDNA для от-

M. Yu, Mitochondrial DNA 23 (5), 329 (2012). DOI:

дельных доноров, что было бы интересно для вы-

10.3109/19401736.2012.696625

явления индивидуальных особенностей.

S. Rapisuwon, E. E. Vietsch, and A. Wellstein, Com-

put. Struct. Biotechnol. J. 14,

211

(2016). DOI:

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

10.1016/j.csbj.2016.05.004

K.-A. Yoon, S. Park, S. H. Lee, et al., J. Mol. Diagn. 11

Показано, что базовый уровень повреждений

(3), 182 (2009). DOI: 10.2353/jmoldx.2009.080098

ДНК лейкоцитов крови, как и уровни вкДНК сы-

W. Chen, F. Cai, B. Zhang, and X. Y. Zhong, Clin.

воротки, сильно варьируют у разных доноров.

Chem. Lab. Med.

(2),

261

(2011). DOI:

Концентрации вкДНК в целом выше у мужчин по

10.1515/cclm.2011.773

сравнению с женщинами. Относительное коли-

чество копий мтДНК сыворотки, определяемые

10.

A. Szpechcinski, J. Chorostowska-Wynimko, and R.

по ΔCt, в целом больше у женщин, чем у мужчин.

Struniawski, et al., Br. J. Cancer 113 (3), 476 (2015).

Уровни мтДНК у пожилых индивидов могут

DOI: 10.1038/bjc.2015.225

сильно различаться, и эти различия наблюдаются

11.

G. Sozzi, D. Conte, L. Mariani, et al., Cancer Res. 61

у обоих полов. Необходимо учитывать пол и воз-

(12), 4675 (2001).

раст пациентов при использовании такого пока-

12.

S. N. Tamkovich, O. E. Bryzgunova, E. Yu. Rykova,

зателя, как уровень внеклеточных ДНК сыворот-

et al., Clin. Chem.

(7),

1317

(2005). DOI:

ки крови для диагностики и мониторинга.

10.1373/clinchem.2004.045062

13.

X. Y. Zhong, S. Hahn, V. Kiefer, and W. Holzgreve,

Ann. Hematol.

(2),

139

(2007).

DOI:

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

10.1007/s00277-006-0182-5

Исследования выполнены в рамках базовой

14.

D. Czeiger, G. Shaked, H. Eini, et al., Amer. Soc Сlin.

части государственного задания Министерства

Pathol.

135

(2),

264

(2011).

DOI:

образования и науки НИР №1878 «Разработка

10.1309/AJCP4RK2IHVKTTZV

БИОФИЗИКА том 66

№ 2

2021

УРОВНИ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ДНК

371

15. J. Jylhava, T. Kotipelto, A. Raitala, et al., Mech Ageing

23. A. J. Sigurdson, M. Hauptmann, B. H. Alexander,

Develop.

132

(1-2),

(2011).

DOI:

et al., Mutat. Res.

586

(2),

173

(2005). DOI:

10.1016/j.mad.2010.11.001

10.1016/j.mrgentox.2005.07.001

16. Н. П. Сирота и Е. А. Кузнецова, Бюл. эксперим.

24. A. Collins, M. Milic, S. Bonassi, and M. Dusinska,

биологии и медицины 145 (2), 154 (2008).

Mutat. Res.

843,

(2019). DOI:

10.1016/j.mr-

17. E. I. Azzam, J. P. Jay-Gerin, and D. Pain, Cancer Lett.

gentox.2019.06.002

327, 48 (2012) DOI: 10.1016/j.canlet.2011.12.012

25. W. Copeland and M. J. Longley, DNA Repair (Amst).

18. M. P. A. Hannon-Fletcher, M. J. O’Kane, K. W. Mo-

19, 190 (2014). DOI: 10.1016/j.dnarep.2014.03.010

les, et al., Mutat. Res. 460 (1), 53 (2000). DOI:

26. P. Møller, L. Knudsen, S. Loft, and H. Wallin, Cancer

10.1016/s0921-8777(00)00013-6

Epidemiology, Biomarkers & Prevention 9 (10), 1005

19. M. Harangi, E. Remenyik, I. Seres, et al., Mutat. Res.

(2000).

513

(1-2),

(2002).

DOI:

10.1016/s1383-

27. N. K. Chemeris, A. B. Gapeyev, N. P. Sirota, et al.,

5718(01)00285-6

Mutat. Res. 558, 27 (2004). DOI: 10.1007/1-4020-

20. P. Sanchez, R. Penarroja, F. Gallegos, et al., Arch.

4278-7_7

Med. Res. 35 (6), 480 (2004). DOI: 10.1016/j.arc-

28. D. P. Lovell and T. Omori, Mutagenesis. 23 (3), 171

med.2004.11.008

(2008). DOI: 10.1093/mutage/gen015

21. J. Blasiak, M. Arabski, and R. Krupa, Mutat. Res. 554

(1-2),

297

(2004).

DOI:

10.1016/j.mrfm-

29. J. Knez, E. Winckelmans, and M. Plusquin, Am. J. Ep-

mm.2004.05.011

idemiol. 183 (2), 138 (2016). DOI: 10.1093/aje/kwv175

22. R. Demirbag, R. Yilmaz, A. Kocyigit, Mutat. Res. 570

30. C.-Y. Xia, Y. Liu, H.-R. Yang, et al., Chin. Med. J. 130

(2), 197 (2005). DOI: 10.1016/j.mrfmmm.2004.11.003

(20), 2435 (2017). DOI: 10.4103/0366-6999.216395

Levels of Circulating DNA in Blood Serum and DNA Damage in Leukocytes of Healthy

Donors of Different Gender and Age

I.Yu. Mitroshina*, N.P. Sirota*, V.N. Prokofiev**, and E.A. Kuznetsova*

* Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences,

ul. Institutskaya 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

**Academy of Biology and Biotechnology named after DI. Ivanovsky, Southern Federal University,

prosp. Stachki 194/1, Rostov-on-Don, 344090 Russia

We studied the levels of extracellular nuclear and mitochondrial DNA of blood serum and DNA damage in

leukocytes of healthy donors of different sex and age groups. The baseline level of DNA damage in leukocytes

and serum DNA levels have been shown to vary greatly among different donors. The baseline level of DNA

damage in leukocytes was not associated with the presence of chronic diseases or an occupational health risk

for elderly donors. It was found that extracellular DNA concentrations are generally higher in men than in

women. There is a tendency towards an increase in the relative mitochondrial DNA copy number determined

by ΔCt in women but not in men; the relative mtDNA copy number in elderly individuals varies significantly

in both sexes, possibly due to age-related physiological changes. It is necessary to take into account the gender

and age of patients when using an indicator such as the level of extracellular DNA of blood serum for diagno-

sis and monitoring.

Keywords: donors of different gender and age, extracellular DNA of blood serum, %TDNA, Comet assay, mito-

chondrial DNA

БИОФИЗИКА том 66

№ 2

2021