БИОФИЗИКА, 2021, том 66, № 3, с. 511-515

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 577.3

КИНЕТИКА ПРОДУКЦИИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА

НЕЙТРОФИЛАМИ ПОСЛЕ ИНКУБАЦИИ В ГИПОМАГНИТНОМ ПОЛЕ

Институт биофизики клетки РАН - обособленное подразделение ФИЦ «Пущинский научный центр биологических

исследований РАН», 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3

E-mail: docmag@mail.ru

Поступила в редакцию 15.02.2021 г.

После доработки 26.02.2021 г.

Принята к публикации 27.02.2021 г.

Показано, что 30-минутная инкубация суспензии нейтрофилов в «нулевом» магнитном поле,

создаваемом системой магнитных экранов из пермаллоя (остаточное постоянное магнитное поле

не превышает 20 нТл), приводит к существенному снижению (на 48%) интенсивности ее

люцигенин-зависимой хемилюминесценции, определенной сразу после окончания воздействия

гипомагнитных условий. Через 20 мин после пребывания в гипомагнитных условиях (при

последующей 20-минутной инкубации нейтрофилов в геомагнитном поле) степень проявления

различий между контрольными и опытными образцами полностью сохраняется. При увеличении

длительности последующей после пребывания в

«нулевом» магнитном поле инкубации

экспериментальных образцов в геомагнитном поле (постоянное поле 44 мкТл) до 40 и 60 мин

различия между ними и соответствующими контрольными группами образцов уменьшаются до 32

и 22%.

Ключевые слова: гипомагнитное поле, геомагнитное поле, нейтрофилы, активные формы кислорода,

люцигенин, хемилюминесценция.

DOI: 10.31857/S0006302921030121

ценции с использованием люцигенина, селектив-

Свободные радикалы и другие активные фор-

ного зонда на супероксид-анион [9, 10], с помо-

мы кислорода (АФК) могут представлять собой

щью которого было показано существенное сни-

потенциальные молекулы для модуляции биоло-

жение интенсивности их люцигенин-зависимой

гических функций в ответ на действие «нулевого»

хемилюминесценции в этих условиях [11].

магнитного поля [1]. В литературе сообщается о

снижении продукции АФК в гипомагнитных

При анализе эффектов гипомагнитных усло-

условиях в различных типах клеток [2-5]. Ранее

вий на продукцию АФК биологическими объек-

нами было показано, что экспонирование пери-

тами одним из важных и практически неизучен-

тонеальных нейтрофилов мышей при магнитном

ных вопросов остается экспериментальная оцен-

экранировании в гипомагнитных условиях вызы-

ка продолжительности последействия этих

вает снижение внутриклеточной продукции

условий, т. е. определение временного периода, в

АФК, регистрируемое по изменению интенсив-

котором проявляются остаточные эффекты «ну-

ности флуоресценции продуктов окисления 2,7-

левого» магнитного поля (МП) после прекраще-

дихлордигидрофлуоресцеина и дигидрородамина

ния его прямого действия. Для изучения времен-

ной динамики продукции АФК в данной работе

123 [6-8]. Этот эффект гипомагнитного поля про-

мы применили уже хорошо зарекомендовавший

являлся в опытах на нейтрофилах без дополни-

тельной их стимуляции химическими активато-

себя в предыдущих исследованиях по этой теме

метод люцигенин-зависимой хемилюминесцен-

рами респираторного взрыва и, следовательно, не

ции [11], позволяющий в течение относительно

обусловлен нарушением ответа нейтрофилов на

короткого времени (несколько минут) оценить

эти стимулы [6, 7]. Для оценки радикалпродуци-

изменение скорости продукции АФК [9-11].

рующей способности нейтрофилов после дей-

ствия «нулевого» поля мы применили и другой

метод - метод активированной хемилюминес-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сокращения: АФК - активные формы кислорода, МП -

Получение суспензии нейтрофилов. Работа вы-

магнитное поле, ГМП - геомагнитное поле.

полнена на перитонеальных нейтрофилах мы-

511

512

НОВИКОВ и др.

шей. Для получения нейтрофилов использовали

(сразу после окончания инкубации в «нулевом»

лабораторных мышей-самцов линии CD-1 мас-

МП - опыты с временем последействия «0» мин).

сой 24-26 г, полученных из питомника лабора-

Другие опытные группы образцов сразу после

торных животных ФИБХ РАН (Пущино, Мос-

окончания действия «нулевого» поля переносили

ковская область). В перитонеальную полость мы-

в условия инкубации в геомагнитном поле на 20,

ши инъецировали

150

мкл суспензии

40 и 60 мин с последующей регистрацией хеми-

опсонизированного зимозана с концентрацией

люминесценции после окончания инкубации.

5 мг/ мл (Zymozan A из Saccharomyces carevisiae,

Каждой экспериментальной группе образцов со-

Sigma, США). После этого через 12 ч животных

ответствовала своя контрольная группа, инкуби-

умерщвляли методом цервикальной дислокации,

руемая одновременно с опытной, но только в

их брюшную полость промывали четырьмя мил-

условиях ГМП.

лилитрами охлажденного раствора Хенкса без

В опытах была использована специальная ис-

кальция. Экссудат собирали пипеткой и центри-

следовательская аппаратура - установка для фор-

фугировали в течение 5 мин при 600 g. Суперна-

мирования гипомагнитных условий, которая поз-

тант декантировали, а осадок разводили в 4 мл

воляла получить высокую степень ослабления

бескальциевого раствора Хенкса и оставляли не

ГМП - до 10000 раз (остаточное постоянное поле

менее чем на 1 ч при 4°C (но не более чем на 3 ч,

не превышало 20 нТл) и существенно ослабляла

так как более длительное хранение в этом случае

переменные техногенные помехи (до единиц

снижало хемилюминесцентный ответ нейтрофи-

нТл). Эта установка детально описана нами ранее

лов на последующую добавку люцигенина). Эта

[8, 12]. Установка состояла из трех вставленных

процедура позволяла снизить спонтанную хеми-

соосно один в другой цилиндрических магнит-

люминесценцию нейтрофилов и перевести эти

ных экранов из пермаллоя (толщиной 1 мм).

клетки в «одинаковое» состояние, характеризую-

Определение остаточных полей внутри установки

щееся их равномерным хемилюминесцентным

проводили прямым измерением с помощью фер-

ответом, что обеспечивало возможность работы с

розондового магнитометра Mag-03 MS 100 (Bar-

ними в течение экспериментального дня. Коли-

tington, Великобритания). Размеры эксперимен-

чество выделенных клеток подсчитывали в каме-

тального участка внутри системы экранов (диа-

ре Горяева. Жизнеспособность клеток определя-

метр - 20 см, длина - 40 см) позволяли поместить

ли, используя витальный краситель трипановый

одновременно в зону однородного слабого маг-

синий. Содержание живых клеток при этом со-

нитного поля достаточное для опытов число экс-

ставляло не менее 98%. Для опытов образцы по-

периментальных образцов (не менее шести).

лучали, разводя суспензию нейтрофилов средой

Опыты повторяли не менее трех раз.

Хенкса (окончательный состав среды: 138 мM

Регистрация хемилюминесценции. После инку-

NaCl, 6 мM KCl, 1 мМ MgSO₄, 1 мM Na₂HPO₄,

бации суспензии нейтрофилов измеряли интен-

5 мM NaHCO₃, 5.5 мM глюкозы, 1 мM CaCl₂,

сивность хемилюминесценции образцов в кон-

10 мМ HEPES, pH 7.4; Sigma, США) до концен-

трольных и опытных случаях после добавки в них

трации 1 млн кл/мл.

раствора люцигенина (Enzo Life Sciences, США) в

Экспонирование суспензии нейтрофилов в «ну-

конечной концентрации 0.35 мМ. В работе был

левом» и геомагнитном поле. Нейтрофилы инкуби-

использован

12-канальный хемилюминометр

ровали при 37.0 ± 0.1°С в концентрации 1 млн

Lum-1200 (ООО «ДИСофт», Россия). Для анализа

кл/мл по 0.25 мл в круглодонных кюветах из по-

данных хемилюминесценции применяли про-

листирола (диаметр - 1.2 см, длина - 5.5 см), в

грамму «PowerGraph». Часть результатов пред-

которых затем измеряли хемилюминесценцию.

ставлена в процентах по отношению к амплиту-

Заданную температуру поддерживали с помощью

дам хемилюминесцентного ответа в контроле,

циркуляционного водного термостата.

принятым за 100%.

Результаты статистически обработаны с при-

Образцы контрольных групп находились в ло-

менением t-критерия Стьюдента.

кальном геомагнитном поле (ГМП) с постоянной

составляющей ∼ 44 мкТл и уровнем магнитного

фона на 50 Гц в 15-50 нТл при таком же темпера-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

турном режиме, как и опытные образцы, и одно-

временно с ними (также одновременно проводи-

30-минутная инкубация суспензии нейтрофи-

ли последующую регистрацию хемилюминесцен-

лов в «нулевом» магнитном поле приводит к су-

ции контрольных и экспериментальных образцов

щественному снижению интенсивности ее люци-

в опытах с одинаковой продолжительностью их

генин-зависимой хемилюминесценции, опреде-

инкубации). Опытные образцы помещали в уста-

ленной сразу после окончания воздействия

новку для формирования гипомагнитных усло-

гипомагнитных условий (приблизительно на

вий на 30 мин, затем в образцах регистрировали

48%) (рис. 1-3). Через 20 мин после пребывания

люцигенин-зависимую хемилюминесценцию

в гипомагнитных условиях (при последующей

БИОФИЗИКА том 66

№ 3

2021

КИНЕТИКА ПРОДУКЦИИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА

513

ними и соответствующими контрольными груп-

пами образцов уменьшаются соответственно до

32 и 22% (рис. 1-3). Следует отметить, что увели-

чение времени инкубации и в контроле, и в опыте

само по себе сопровождается снижением интен-

сивности люцигенин-зависимой хемилюминес-

ценции суспензии нейтрофилов, что может быть

связано с активацией антиоксидантных систем в

этих клетках [13, 14] или расходом эндогенных

восстановительных

эквивалентов

(НАДН,

НАДФН) [10]. Последующие эксперименты по-

могут установить, имеют ли отношение эти есте-

ственные процессы к механизмам действия «ну-

левого» поля. Против этого, однако, свидетель-

ствует динамика эффекта

«нулевого» поля с

максимумами ответа именно на ранние сроки на-

Рис. 1. Влияние «нулевого» магнитного поля на интен-

блюдений.

сивность люцигенин-зависимой хемилюминесценции

суспензии нейтрофилов в зависимости от продолжи-

тельности последующей инкубации в геомагнитном

Полученные нами данные о наличии по край-

поле. По оси ординат - максимальная интенсивность

ней мере 20-минутного временного периода по-

хемилюминесценции в условных единицах (средние

следействия гипомагнитных условий на скорость

значения и стандартные отклонения, n = 6), по оси

продукции АФК нейтрофилами, в котором сте-

абсцисс - время инкубации в геомагнитном поле по-

сле пребывания в «нулевом» МП. Светлые столбики -

пень выраженности эффект действия «нулевого»

контроль, темные столбики - опыт. Звездочкой отме-

поля (снижение продукции АФК) полностью со-

чены достоверные отличия от контроля (P < 0.05).

храняется, имеет помимо фундаментального зна-

чения выраженный прикладной (методический)

аспект. Действительно, в ряде случаев крайне за-

20-минутной инкубации в ГМП) степень прояв-

труднительно проводить прямое изучение дей-

ления различий между контрольными и опытны-

ствия «нулевого» поля с помощью стандартной

ми образцами полностью сохраняется (различия

исследовательской аппаратуры, так как сама эта

составляют 49%) (рис. 1-3). При увеличении дли-

аппаратура является источником магнитных по-

тельности последующей после пребывания в «ну-

мех. Да и извлечение образцов при исследовании

левом» МП инкубации экспериментальных об-

из гипомагнитных условий в условия окружаю-

разцов в ГМП до 40 и 60 мин различия между

щего ГМП приводит к существенному измене-

нию их магнитного окружения. Наличие обнару-

женного нами относительно продолжительного

периода последействия у этого физического фак-

тора в принципе позволяет планировать и прово-

дить эксперименты с разобщением (в течение

определенного времени) пребывания объектов

исследования в гипомагнитных условий и реги-

страции эффекта их действия с помощью измери-

тельной аппаратурой, что может способствовать

прогрессу в этой области исследований.

В заключение следует отметить особую важ-

ность и перспективность изучения эффектов

«нулевого» магнитного поля в целом для биоэлек-

тромагнитных исследований. Наряду с приклад-

ными аспектами уже обнаруженного неблагопри-

ятного действия гипомагнитных условий на про-

Рис. 2. Временная динамика последействия «нулево-

цессы эмбрионального развития

[15-17],

го» магнитного поля в отн. ед., нормализованных от-

носительно контрольных значений (средние значения

морфогенез [18-20] и поведенческие реакции [21,

и стандартные отклонения, n = 6). По оси абсцисс -

22] изучение этих эффектов может способство-

время инкубации в геомагнитном поле после пребыва-

вать определению первичных «работающих» ми-

ния в «нулевом» МП. Светлые столбики - контроль,

шеней действия слабого магнитного поля в био-

темные столбики - опыт. Звездочкой отмечены досто-

верные отличия от контроля (P < 0.05).

логических объектах [1, 5, 23, 24].

БИОФИЗИКА том 66

№ 3

2021

514

НОВИКОВ и др.

Рис. 3. Кинетические кривые хемилюминесцентного ответа суспензии нейтрофилов на люцигенин после действия

«нулевого» МП при различных временах последующей инкубации в геомагнитном поле: (а) - 0 мин (без инкубации в

ГМП), (б) - 20 мин, (в) - 40 мин, (г) - 60 мин; 1 - контроль, 2 - опыт.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

4. P. Politanski, E. Rajkowska, M. Brodecki, et al., Bio-

electromagnetics 34, 333 (2013).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

5. V. N. Binhi and F. S. Prato, PLoS One 12 (6), e0179340

интересов.

(2017).

6. В. В. Новиков, Е. В. Яблокова и Е. Е. Фесенко,

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Биофизика 63 (3), 484 (2018).

Все применимые международные, националь-

7. В. В. Новиков, Е. В. Яблокова, Э. Р. Валеева и

ные и институциональные принципы ухода и ис-

Е. Е. Фесенко, Биофизика 64 (4), 720 (2019).

пользования животных при выполнении работы

8. В. В. Новиков, Е. В. Яблокова, И. А. Шаев и

были соблюдены.

Е. Е. Фесенко, Биофизика 65 (2), 524 (2020).

9. T. B. Aasen, B. Bolann, J. Glette, et al., Scand. J. Clin.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Lab. Invest. 47, 673 (1987).

1. B. Zhang and L. Tian, Bioelectromagnetics 41 (8), 573

10. А. А. Джатдоева, Е. В. Проскурнина, А. М. Несте-

(2020).

рова и др., Биологич. мембраны 34 (6), 116 (2017).

2. H. Zhang, Z. Zhang, W. Mo, et al., Prot. Cell 8 (7), 527

11. В. В. Новиков, Е. В. Яблокова, И. А. Шаев и

(2017).

Е. Е. Фесенко, Биофизика 65 (4), 735 (2020).

3. C. F. Martino and P. R. Castello, PLoS One 6 (8),

12. В. В. Новиков, Е. В. Яблокова и Е. Е. Фесенко,

e22753 (2011).

Биофизика 65 (1), 97 (2020).

БИОФИЗИКА том 66

№ 3

2021

КИНЕТИКА ПРОДУКЦИИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА

515

13. F. Barnes and S. Kandala, Bioelectromagnetics 39, 249

19. V. V. Novikov, I. M. Sheiman, and E. E. Fesenko, Bio-

(2018).

electromagnetics 29, 387 (2008).

14. F. Barnes and B. Greenebaum, Bioelectromagnetics

20. A. V. Van Huizen, J. M. Morton, L. J. Kinsey, et al.,

41, 392 (2020).

Sci. Adv. 5, eaau7201 (2019).

15. M. Osipenko, L. Mezhevikina, I. Krasts, et al., Bio-

21. B. Zhang, H. Lu, W. Xi, et al., Neurosci. Lett. 371, 190

physics 53, 317 (2008).

(2004).

16. K. Trukhanov, T. Gur'eva, O. Dadasheva, et al., Radi-

22. V. N. Binhi and R. M. Sarimov, Electromagn. Biol.

ats. Biol. Radioecol. 54, 179 (2014).

Med. 28, 310 (2009).

17. В. В. Крылов, Е. А. Осипова, Н. А. Панкова и др.,

23. F. Barnes and B. Greenebaum, Bioelectromagnetics

Биофизика 62 (4), 825 (2017).

36, 45 (2015).

18. В. В. Новиков, И. М. Шейман и Е. Е. Фесенко,

24. V. O. Ponomarev and V. V. Novikov, Biophysics 54, 163

Биофизика 52 (5), 912 (2007).

(2009).

Kinetics of the Production of Reactive Oxygen Species by Neutrophils after Incubation

in a Hypomagnetic Field

V.V. Novikov, E.V. Yablokova, I.A. Shaev, and E.E. Fesenko

Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

It was shown that 30-min incubation of neutrophils in the presence of a near null magnetic field produced

with the use of permalloy for magnetic shielding (the residual static magnetic field not greater than 20 nT)

leads to a significant decrease (by 48%) in the intensity of lucigenin-dependent chemiluminescence measured

directly after removal of the hypomagnetic field. In 20 min after being in hypomagnetic conditions (followed

by 20 min of incubation of neutrophils in the geomagnetic field), the degree of severity of differences between

the control and experimental samples is completely preserved. When time periods of incubation of experi-

mental samples in the geomagnetic field (static magnetic field 44 μT) were extended (40 min and 60 min)

after exposure to a near null magnetic field, the differences between experimental and appropriate control

groups of samples were smaller, up to 32 and 22%.

Keywords: hypomagnetic field, geomagnetic field, neutrophils, reactive oxygen species, lucigenin, chemilumines-

cence

БИОФИЗИКА том 66

№ 3

2021