БИОФИЗИКА, 2021, том 66, № 3, с. 572-576

БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ

УДК 577.35+612.17

ПРОДУКЦИЯ ОКСИДА АЗОТА В ТКАНЯХ КРЫС В ПОСТНАТАЛЬНОМ

ОНТОГЕНЕЗЕ: ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОМ СПЕКТРОСКОПИИ

ЭЛЕКТРОННОГО ПАРАМАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА

Х.Л. Гайнутдинов*^, **, Т.Л. Зефиров*

*Казанский федеральный университет, 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18

**Казанский физико-технический институт им. Е.К. Завойского - обособленное структурное подразделение ФИЦ

КазНЦ РАН, 420034, Казань, ул. Сибирский тракт, 10/7

E-mail: kh_gainutdinov@mail.ru

Поступила в редакцию 27.12.2019 г.

После доработки 23.03.2020 г.

Принята к публикации 04.03.2021 г.

Проведено ЭПР-исследование интенсивности продукции оксида азота у крыс путем анализа

количества NO-содержащих парамагнитных комплексов в тканях сердца и печени в постнатальном

онтогенезе. Количество оксида азота оценивали по интенсивности характерного сигнала ЭПР,

принадлежащего комплексу (ДЭTK)₂-Fe²⁺-NO. Полученные результаты показывают, что

содержание NO в тканях печени с 28- до 56-суточного возраста возрастает, в постпубертатный

период изменяется несущественно. В тканях сердца наблюдается повышение количества NO к

половозрелому периоду по сравнению с пубертатным периодом. Во всех исследованных возрастных

группах содержание NO в печени крыс было значительно больше, чем в тканях сердца.

Ключевые слова: оксид азота, крыса, онтогенез, сердце, печень, электронный парамагнитный резонанс.

DOI: 10.31857/S0006302921030170

ческое действие NO на кардиомиоциты при пато-

Оксид азота (NO) - газообразный химический

логических состояниях [15].

мессенджер, являющийся высоколабильным, ко-

роткоживущим, реактивным свободным радика-

NO широко представлен в центральной и пе-

лом, который вовлечен во множество физиологи-

риферической нервной системе [6, 16-17]. NO

выполняет роль сигнальной молекулы, модули-

ческих и патофизиологических процессов [1-6].

руя адренергические и холинергические влияния

В организме оксид азота синтезируется двумя ос-

на сердце [4, 10, 16-19]. Система NO играет важ-

новными путями: ферментативным и нефермен-

ную роль при адаптации организма к различным

тативным. Ферментативный синтез NO осу-

изменениям внешней среды и внешних условий

ществляется ферментом NO-синтазой в присут-

жизнедеятельности, в том числе и на изменение

ствии О₂ и НАДФ-Н в результате окисления

двигательной активности

[20-22]. Активация

аминокислоты L-аргинина с одновременным

NО-системы - один из тех механизмов, за счет

синтезом другой аминокислоты - L-цитруллина

которого организм предупреждает стрессорные

[7]. Коронарный и эндокардиальный эндотелий,

повреждения. Система оксида азота, играющая

кардиомиоциты в норме являются источником

роль в активации антиоксидантных ферментов,

базальной продукции NO и регулируют функции

ограничивает стресс-реакцию [23, 24]. NO ввиду

сердца через сосудистозависимые и сосудистоне-

свойственной ему реактивности способен взаи-

зависимые эффекты [1, 8-11]. NO контролирует

модействовать с разнообразными веществами,

сосудистый тонус, артериальное давление, про-

образуя структуры, служащие в качестве депо для

лиферацию эндотелиальных и гладкомышечных

NO, - тиолами, белками, сахарами, ионами ме-

клеток сосудистой стенки, участвует в возникно-

таллов, гемами протеинов и т.д., локализованны-

ми в самых различных тканях и органеллах, что

вении атеросклероза и гипертензий, регулирует

предполагает наличие NO и его комплексов в раз-

сократимость миокарда [9-14]. Доказано токси-

личных тканях. Депо NO может служить допол-

Сокращения: NO - оксид азота, ДЭТК - диэтилдитиокар-

нительным неферментативным источником NO в

бамат, ЭПР - электронный парамагнитный резонанс.

случае его дефицита. Под неферментативным пу-

572

ПРОДУКЦИЯ ОКСИДА АЗОТА В ТКАНЯХ КРЫС

573

Рис. 1. Спектр ЭПР тканей печени крысы. Пунктиром выделен сигнал от комплекса (ДЭТК)₂-Fe²⁺-NO, p < 0.05.

тем обычно понимают восстановление нитритов

нами ранее [30, 31]). Комплекс ДЭТК-Fe(II) вза-

или нитратов до NO [3]. Данная способность яв-

имодействует с NO, в результате чего образуется

ляется одним из способов предупреждения ток-

стабильный радикал (ДЭТК)₂-Fe²⁺-NO. Дан-

сических эффектов избытка NO [25, 26].

ный комплекс является парамагнитным

Значительная роль NO во многих физиологи-

(SFe = 1/2, и IN = 3/2) и может быть зарегистри-

ческих и патофизиологических процессах, а так-

рован методом электронного парамагнитного ре-

же недостаточность сведений об интенсивности

зонанса (ЭПР) [28]. Комплексы характеризуются

синтеза NO в растущем организме предопределя-

легко распознаваемым спектром ЭПР со значе-

ют значимость исследований в данном направле-

нием g-фактора g = 2.038 и триплетной сверхтон-

нии. Является актуальным определение количе-

кой структурой (рис. 1). Количество NO оценива-

ственного содержания NO как внутриклеточно-

ли по интенсивности характерного сигнала ЭПР,

го, межклеточного, тканевого и межорганного

принадлежащего комплексу (ДЭТК)₂-Fe²⁺-NO.

посредника в различных тканях.

Сигналы сравнивали по величине интегральной

интенсивности, так как интегральная интенсив-

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

ность сигнала ЭПР прямо пропорциональна кон-

центрации парамагнитных комплексов [29]. Че-

Содержание NO в тканях сердца и печени

рез 30 мин после введения препаратов наркотизи-

крыс определяли методом спинового захвата в че-

рованную уретаном крысу фиксировали на

тырех возрастных группах животных: 28-, 56-, 81-

операционном столе, вскрывали, извлеченные

и 110-суточного возрастов, в каждой возрастной

органы быстро просушивали и замораживали в

группе n = 10. Эксперименты проводили в соот-

жидком азоте в капиллярах для измерений. Реги-

ветствии с нормативными положениями о прави-

лах обращения с лабораторными животными.

страцию спектров ЭПР приготовленных образ-

цов проводили при 77 К на ЭПР-спектрометре

Метод спинового захвата основан на реакции ра-

Х-диапазона ER-200E-SRC EMX/plus (Bruker,

дикала NO со спиновой ловушкой [27, 28]. Был

США) с температурной приставкой ER-4112HV.

применен комплекс Fe²⁺ c диэтилдитиокарбама-

Во всех экспериментах сохраняли постоянными

том (ДЭТК) для захвата NO и формирования

следующие параметры: СВЧ мощность - 30 мВт,

устойчивого тройного комплекса (ДЭТК)₂-

модуляция - 5 Гс, усиление - 4 · 10⁴, постоянная

Fe²⁺-NO [27-29]. Для образования в организме

времени - 100 мс, время записи спектра - 50 с,

данного комплекса животным вводили водный

число накоплений - 8. При накоплениях и реги-

раствор ДЭТК-Na в дозе 500 мг/кг в 2.5 мл воды

страции спектров использовали компьютер спек-

внутрибрюшинно и раствор цитрата железа

трометра Aspect 3000 (Bruker, США).

(сульфат железа (II) (FeSO₄⋅ 7H₂O, Sigma, США)

в дозе 37.5 мг/кг + цитрат натрия, 187.5 мг/кг)

При статистической обработке получали сред-

внутримышечно (подробности метода описаны

нее значение измеряемой величины и стандарт-

БИОФИЗИКА том 66

№ 3

2021

574

ЗАРИПОВА и др.

Рис. 2. Интенсивность сигнала ЭПР спиновой ловушки

(ДЭТК)₂-Fe²⁺-NO в тканях предсердий сердца крыс.

Рис. 4. Интенсивность сигнала ЭПР спиновой ловушки

По оси ординат - интегральная интенсивность сигнала

(ДЭТК)₂-Fe²⁺-NO в тканях печени крыс. По оси

от комплекса, * - p < 0.05.

ординат - интегральная интенсивность сигнала от

комплекса,* - p < 0.05.

ную ошибку среднего M ± SEM. С применением

t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна-

зывающей активное влияние на регуляцию сер-

Уитни проверяли достоверность отличия средних

дечной деятельности, 81-суточные животные -

значений уровней NO в разных тканях крыс раз-

переходный период от пубертата к половозрело-

ного возраста. Различия считали значимыми при

сти, 110-суточные - половозрелые крысы [32-

р < 0.05.

34]. При таком подходе, на наш взгляд, удается

охватить основные периоды развития крыс и про-

следить формирование регуляции сердечной дея-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

тельности в разные этапы постнатального онтоге-

Согласно литературным данным, 28-суточные

неза. При сопоставлении спектров ЭПР тканей

крысы являются неполовозрелыми, пик станов-

предсердий сердца крыс разных возрастов было

ления симпатической иннервации в сердце; 56-

обнаружено, что количество NO с 56- по 81-су-

суточный возраст соответствует пубертатному пе-

точный возраст существенно не изменяется. К

риоду развития, сопровождающемуся выражен-

110-суточному возрасту количество (ДЭТК)2-

ными изменениями эндокринной системы, ока-

Fe²⁺-NO) повысилось в среднем на 19% по срав-

нению с 56-суточным возрастом (p < 0.05, рис. 2).

Количество NO в тканях желудочков сердца крыс

с 56- по 81-суточный возраст, в отличие от пред-

сердий, увеличивается в среднем на

30%

(p < 0.05), у 81- и 110-суточных крыс количество

NO не отличается (рис. 3). Выявлено, что в тканях

печени крыс интенсивность сигналов ЭПР у крыс

с 28- до 56-суточного возраста увеличивается в

среднем на 85% (p < 0.05), а к 110-суточному воз-

расту существенно не изменяется (рис. 4). Оксид

азота участвует в большинстве метаболических

процессов, протекающих в печени, поэтому

его динамика свидетельствует об изменениях ин-

тенсивности метаболизма в печени в ходе онтоге-

неза.

Наибольшее содержание NO у крыс обнаруже-

но в печени, далее по убывающей - в тканях

предсердий и желудочков сердца. Возможно, это

Рис. 3. Интенсивность сигнала ЭПР спиновой ловушки

объясняется тем, что печень является мощным

(ДЭТК)₂-Fe²⁺-NO в тканях желудочков сердца крыс.

фильтратом крови. Влияние NO на печень не

По оси ординат - интегральная интенсивность сигнала

от комплекса,* - p < 0.05.

ограничивается септическими состояниями.

БИОФИЗИКА том 66

№ 3

2021

ПРОДУКЦИЯ ОКСИДА АЗОТА В ТКАНЯХ КРЫС

575

Имеются сведения о важной роли NO в функцио-

деятельности сердечно-сосудистой системы в

нальных сдвигах, наблюдаемых в печени при

постнатальном онтогенезе.

ишемии и реперфузии, злокачественных новооб-

разованиях, циррозе и ряде других патологиче-

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

ских состояний [35].

Работа выполнена при финансовой поддержке

Исследованиями показано, что концентрация

субсидией, выделенной Казанскому федерально-

оксида азота в организме различается в зависимо-

му университету по Государственному заданию

сти от возраста людей. Так, максимальное содер-

№ 0671-2020-0059 в сфере научной деятельности.

жание этого соединения наблюдалось в возрасте

5-12 лет и составляло 152.0 ± 16.2 мкг/мл. Далее с

увеличением возраста продукция NО снижалась

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

и в 19-30 лет достигала минимальных значений

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

[36]. По мере старения организма нарушается

интересов.

функция эндотелия сосудов, и главной причиной

дисфункции эндотелия считается снижение про-

дукции эндотелиального NO [37].

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В возрасте 7-10 лет выявлены высокие темпы

Все применимые международные, националь-

нарастания показателей плотности холин- и адре-

ные и институциональные принципы ухода и ис-

нергических терминалей в миокарде, наибольшая

пользования животных при выполнении работы

их концентрация постоянно регистрируется в

были соблюдены.

стенке правого предсердия, затем по количествен-

ным показателям следуют левое предсердие, пра-

вый желудочек и, наконец, - стенка левого желу-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

дочка. В период половой зрелости насыщенность

А. Ф. Ванин, Соросовский образоват. журн. 7 (11),

стенок сердца нервными сплетениями становится

7 (2001).

максимальной. С 35-40-летнего возраста возника-

Е. Б. Меньшикова, Н. К. Зенков и В. П. Реутов,

ет снижение симпатической активности. В резуль-

Биохимия 65 (4), 485 (2000).

тате применения иммуногистохимических мето-

В. П. Реутов, В. Е. Охотин, А. В. Щуклин и др.,

дов обнаружена солокализация оксида азота в пе-

Успехи физиол. наук 38 (4), 39 (2007).

рицеллюлярных окончаниях, нейронах сердца и

E. M. Schuman and D. V. Madison, Annu. Rev. Neu-

холинергических синапсах человека и животных.

rosci. 17, 153 (1994).

Установлено, что эффекты оксида азота и его мета-

D. Boehning and S. H. Snyder, Annu. Rev. Neurosci.

болитов выражены в областях мозга, которые кон-

26, 105 (2003).

тролируют симпатическую активность и влияния

J. R. Steinert, T. Chernova, and I. D. Forsythe, Neuro-

блуждающего нерва, и, кроме того, оксид азота мо-

scientist 16, 435 (2010).

дулирует трансмиссию вегетативной деятельности

M. Mori and T. Gotoh, Biochem. Biophys. Res. Com-

на органы-мишени, воздействуя на уровне спин-

mun. 275, 715 (2000).

ного мозга, ганглиев и нейромышечных контактов

А. А. Сосунов, Соросовский образоват. журн. 6

[38].

(12), 31 (2000).

Полученные нами результаты показывают, что

D. L. Brutsaert, Physiol. Rev. 83, 59 (2003).

содержание NO в тканях печени с 28- до 56-су-

10.

В. В. Андрианов, Ф. Г. Ситдиков, Х. Л. Гайнутди-

точного возраста возрастает, а в постпубертатный

нов и др., Онтогенез 39 (6), 437 (2008).

период изменяется не существенно. В тканях

11.

B. Casadei and E. C. Sears, Prog. Biophys. Mol. Biol.

сердца наблюдается повышение количества NO к

82, 67 (2003).

половозрелому периоду по сравнению с пубер-

12.

А. Рiech, C. Dessy, X. Havaux, et al., Cardiovasc. Res.

татным периодом. Было обнаружено, что уста-

57, 456 (2003).

новление стабильного уровня NO в исследован-

13.

A. I. Ismailova, O. I. Gnezdilov, L. N. Muranova, et al.,

ных нами тканях происходит в разные возрастные

Appl. Magn. Res. 28, 421 (2005).

периоды: в тканях печени - в начале пубертатно-

14.

R. I. Zaripova, N. I. Ziyatdinova, and T. L. Zefirov,

го периода (56-суточный возраст), в тканях же-

Bul. Exp. Biol. Med. 161 (2), 215 (2016).

лудочков сердца - к 81-суточному, а в предсерди-

15.

В. А. Невзорова, М. В. Зуга и Б. И. Гельцер, Тера-

ях - к 110-суточному возрасту. NO модулирует

певт, № 3, 64 (1997).

или опосредует почти все сигнальные пути сер-

16.

V. V. Andrianov, S. G. Pashkevich, G. G. Yafarova,

дечно-сосудистой системы на каждом уровне, на-

et al., Appl. Magn. Res. 47 (9), 965 (2016).

чиная от центральной нервной системы и кончая

17.

А. Л. Зефиров и А. Х. Уразаев, Успехи физиол. наук

кардиомиоцитами [39, 40]. Видимо, оксид азота

30 (1), 547 (1999).

наряду с нейромедиаторами и гормонами являет-

18.

M. P. Gallo, D. Malan, I. Bedendi, et al., Pflugers

ся ключевой молекулой в становлении регуляции

Arch. 441 (5), 621 (2001).

БИОФИЗИКА том 66

№ 3

2021

576

ЗАРИПОВА и др.

19. S. Thomas and R. Robitaille, J. Neurosci. 21 (4), 1087

31. Р. И. Зарипова, В. В. Андрианов, Г. Г. Яфарова

(2001).

и др., Росс. физиол. журн. 100 (8), 926 (2014).

20. Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., Биохимия, 63 (7),

32. И. А. Аршавский, Физиологические механизмы и за-

992 (1998).

кономерности индивидуального развития (Наука,

21. Р. И. Зарипова, Х. Л. Гайнутдинов и Т. Л. Зефиров,

М., 1982).

Бюл. эксперим. биол. мед. 157 (5), 554 (2014).

33. Т. Л. Зефиров, Н. В. Святова и Н. И. Зиятдинова,

22. Х. Л. Гайнутдинов, В. В. Андрианов, В. С. Июдин

Бюл. эксперим. биол. мед. № 6, 611 (2000).

и др., Биофизика 58 (2), 276 (2013).

34. А. M. Kuptsova, N. I. Ziyatdinova, R. G. Biktemirova,

23. Ю. Г. Камскова, Теория и практика физ. культуры,

and T. L. Zefirov, Intern. J. Pharm. Technol. 8 (3),

№ 10, 20 (2002).

14999 (2016).

24. Л. Л. Гудков, К. Б. Шумаев, Е. И. Каленикова

35. З. А. Лупинская, А. Г. Зарифьян, Т. Ц. Гурович и С.

и др., Биофизика 52 (3), 503 2007.

Г. Шлейфер, Эндотелий. Функция и дисфункция

25. А. Н. Осипов, Г. Г. Борисенко и Ю. А. Владими-

(КРСУ, Бишкек, 2008).

ров, Успехи биол. химии 47, 259 (2007).

36. О. В. Клименко, Дис. … к-та мед. наук (Читинская

26. А. А. Тимошин, Ц. Р. Орлова, А. Ф. Ванин и др.,

гос. мед. академия, Чита, 2002).

Рос. хим. журн. 52 (1), 88 (2007).

37. О. Д. Остроумова и Р. Э. Дубинская, Кардиоваску-

27. V. V. Khramtsov and L. B. Volodarsky, Biol. Magn.

лярная терапия и профилактика 3 (4), 83 (2004).

Res. 14, 109 (1998).

38. В. Швалев, Тихоокеанский мед. журн., № 2, 94

28. A. F. Vanin, A. Huisman, and E. E. Van Faassen,

(2012).

Methods Enzymol. 359, 27 (2003).

29. В. Д. Микоян, Л. Н. Кубрина и А. Ф. Ванин, Био-

39. J. R. Docherty, Autonom. Neurosci., Basic and Clini-

физика 39, 915 (1994).

cal 96, 8 (2002).

30. Gainutdinov Kh.L., Gavrilova S.A., Iyudin V.S. et al,

40. M. D. Esler, A. G. Tumer, D. M. Kaye, et al., Am. J.

Appl. Magn. Res. 40, 267 (2011).

Physiol. 268, 278 (1995).

Nitric Oxide Production in Rat Tissues in Postnatal Ontogenesis:

Studies by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy

R.I. Zaripova*, G.G. Jafarova*, V.V. Andrianov*^, **, Kh.L. Gainutdinov*^, **, and T.L. Zefirov*

*Kazan Federal University, Kremlevskaya ul.18, Kazan, 420008 Russia

**Kazan E.K. Zavoisky Physical-Technical Institute of the Kazan Scientific Center of the Russian Academy of Sciences,

ul. Sibirskij tract 10/7, Kazan, 420034 Russia

The EPR spectroscopy was used to study the intensity of nitric oxide production in rats by evaluating the level

of nitric oxide-containing paramagnetic complexes in heart and liver tissues in postnatal ontogenesis.

The amount of nitric oxide was estimated by the intensity of a characteristic EPR signal belonging to the

(DETC)₂-Fe²⁺-NO complex. The results show that the content of NO in liver tissues increases after the age

of 28 days till 56-days without significant changes in the post-puberty period. In heart tissues, the nitric oxide

level increases in the mature period as compared to puberty. The nitric oxide level in the rat liver was signifi-

cantly higher than that in heart tissues in all studied age groups.

Keywords: nitric oxide, rat, ontogenesis, heart, liver, electron paramagnetic resonance

БИОФИЗИКА том 66

№ 3

2021