БИОФИЗИКА, 2021, том 66, № 4, с. 657-667

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 578/579.6

БИОСЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ

Л.Г. Ловцова**, И.А. Бородина***

*Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, 410049, Саратов, пр. Энтузиастов, 13

**Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова, 410012, Саратов, Театральная пл., 1

***Саратовский филиал Института радиотехники и электроники им. В.А. Котельникова РАН,

410019, Саратов, ул. Зеленая, 38

****Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского,

410012, Саратов, ул. Астраханская, 83

E-mail: guliy_olga@mail.ru

Поступила в редакцию 15.01.2021 г.

После доработки 02.06.2021 г.

Принята к публикации 03.06.2021 г.

Антибиотики широко применяются в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности. Одна-

ко активное использование антибактериальных препаратов приводит к загрязнению окружающей

среды. В связи с этим существует большая потребность в мониторинге и определении антибиотиков

в различных средах, таких как питьевая вода, продукты питания, напитки, сточные воды фармацев-

тических предприятий и др. Для определения антибиотиков разработано достаточное количество

методов, в том числе и на основе биосенсоров. Биосенсорые методы анализа имеют довольно ши-

рокое применение и являются неотъемлемой частью при экологическом мониторинге. Наиболее

востребованными для анализа антибиотиков являюся электрохимические, оптические, акустиче-

ские, микробные биосенсоры, иммуно- и аптасенсоры, а также сенсоры на основе молекулярно-

импринтированных полимеров. В статье приводится краткий обзор биосенсорных методов и под-

ходов для определения антибиотиков. Проведен анализ наиболее перспективных биосенсорных си-

стем при определении антибактериальных препаратов.

Ключевые слова: антибиотики, методы определения, биосенсоры, аптамеры, антитела, микробные

клетки.

DOI: 10.31857/S0006302921040050

других объектах. Для обнаружения антибиотиков

Антибактериальные препараты являются од-

используют микробиологические, спектрофото-

ной из наиболее широко используемых групп ле-

метрические, флуориметрические, хемилюми-

карственных средств на фармацевтическом

несцентные, различные варианты хроматографи-

рынке. Антибиотики широко применяются не

ческих методов, в том числе высокоэффективную

только в медицине и ветеринарии, но и в пище-

жидкостную хроматографию и хромато-масс-

вой промышленности при консервировании и

спектрометрию, инверсионную вольтамперомет-

обработке пищевых продуктов, а также их транс-

рию, электроаналитическое определение с моди-

портировке [1].

фицированными электродами [3], а также био-

Антибиотики в субтерапевтических дозах до-

сенсорные методы [4, 5]. Биосенсорные методы

бавляют в корм животным для усиления их роста

анализа активно развиваются в последнее время и

[2]. Анализ питьевой воды на наличие антибиоти-

являются неотъемлемой частью экологического

ков представляет особый интерес из-за возмож-

мониторинга окружающей среды. В работе пред-

ности попадания потенциальных загрязнителей в

ставлен краткий обзор биосенсорных систем для

круговорот воды. В связи с этим актуальным яв-

определения антибиотиков.

ляется проблема контроля содержания антибио-

тиков в лекарственных формах, а также их опре-

деление в жидкостях, в продуктах питания, сточ-

БИОСЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ

ных водах фармацевтических предприятий и

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ

Сокращениe: ППР - поверхностный плазмонный резо-

Несмотря на значительное количество разра-

нанс.

ботанных методов определения антибиотиков,

657

658

ГУЛИЙ и др.

Рис. 1. Общая схема биосенсоров с иммобилизацией (а) и без иммобилизации (б) компонентов анализа.

одной из наиболее перспективных технологий

селективный, воспроизводимый, чувствитель-

для экспресс-анализа антибактериальных препа-

ный, стабильный биосенсор [6, 7]. Поэтому суще-

ратов являются биосенсорные системы. Биосен-

ствуют два варианта датчиков - датчики с иммо-

соры позволяют проводить качественный и коли-

билизацией компонентов анализа на их поверх-

чественный анализ антибиотиков, что делает их

ности и датчики, с помощью которых возможно

очень востребованными при необходимости

проведение исследований непосредственно в

крупномасштабного анализа антибактериальных

жидкости, без иммобилизации компонентов ана-

препаратов. Однако биосенсоры имеют ряд огра-

лиза. Общая схема биосенсоров представлена на

ничений, связанных как со стабильностью рабо-

рис. 1.

ты, так и с их стерилизацией после удаления отра-

ботанных образцов.

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ

Биосенсоры представляют собой био-химико-

физические системы, состоящие из двух компо-

Электрохимические биосенсоры создавались с

нентов: чувствительного биологического элемен-

целью объединения чувствительности электрохи-

та и системы детекции, которые позволяют реги-

мического детектора и специфичности активного

стрировать концентрацию или активность раз-

слоя. Среди электрохимических биосенсоров

личных аналитов, присутствующих в образце.

можно выделить следующие:

Биологический элемент может быть каталитиче-

- потенциометрические сенсоры, в которых

ским и некаталитическим. К каталитическим

измеряется потенциал ячейки при нулевом токе

элементам можно отнести бактерии, ферменты и

[8];

ткани. К некаталитическим элементам относятся

- вольтамперометрические (или амперомет-

рецепторы и нуклеиновые кислоты. Система де-

рические) сенсоры, в которых измеряется ток

текции может быть оптической, калориметриче-

окисления или восстановления электроактивных

ской, акустической, электрической и др. Для

частиц, возникающий при приложении заданной

определения антибиотиков применяются био-

разности потенциалов между электродами [9];

сенсоры, обладающие различной конструкцией и

- кондуктометрические сенсоры, в которых из-

механизмом действия. Ключевой и решающей за-

меряется электропроводность содержимого кон-

дачей при разработке биосенсора является про-

тейнера с помощью моста проводимостей [8, 9].

цесс введения и закрепления биорецептора на

поверхности носителя (трансдьюсера), т.е. про-

В биосенсорах электрохимического типа в со-

цесс иммобилизации, позволяющий разработать четании с потенциометрическими или амперо-

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

БИОСЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ

659

Рис. 2. Общая схема работы иммуносенсора.

метрическими электродами применяют фермен-

Для создания рецепторных покрытий иммуно-

ты, рецепторы, клетки микроорганизмов, ткани

сенсоров используют различные по природе био-

растений и животных, антитела, меченные фер-

логически активные вещества: гаптен-белковые

ментами.

конъюгаты (с белковыми молекулами связаны

низкомолекулярные вещества, такие как салици-

Например, в работе [10] описаны возможности

ловая кислота, сульфаниламиды, атразин, кокаин

сенсоров на основе стеклоуглеродного электрода

и др.), белки (антитела и рекомбинантные фраг-

и пленок хитозана для определения норфлокса-

менты антител); синтетические пептиды (напри-

цина в присутствии дофамина, кофеина и моче-

мер, HIV-пептид), липополисахариды, вирусы,

вой кислоты. Морфологические, структурные и

клетки и т.д.

электрохимические характеристики нанострук-

турированного материала оценивали с помощью

К наиболее часто применяемым иммуносен-

спектрофотометрии, рентгеновской дифракции,

сорам относятся электрохимический и оптиче-

просвечивающей электронной микроскопии и

ский. Последним чаще всего является биосенсор

вольтамперометрии.

с использованием поверхностного плазмонного

резонанса (ППР). Хотя иммуносенсоры очень се-

Другими авторами был разработан [11] элек-

лективны, скорость анализа зависит от времени

трохимический биосенсор на основе принципа

инкубации, необходимого для образования ком-

аффинности для обнаружения остатков цефтио-

плекса антиген/антитело. Кроме того, полная ре-

фура в образцах мяса с помощью спектроскопии

генерация датчика также может занять довольно

электрохимического импеданса при времени

много времени [12, 13].

анализа 15 мин.

Иммуносенсоры используют для оценки каче-

ства иммунобиологических лекарственных пре-

ИММУНОСЕНСОРЫ

паратов, т.е. для качественного и количественно-

го определения веществ в анализируемой пробе

Самая большая группа биосенсоров, исполь-

после реакции связывания антигена со специ-

зуемых для обнаружения антибиотиков, основана

фичными антителами. Детекция может быть как

на использовании иммунохимических реакций

прямой (когда исследуемое вещество само обла-

биораспознавания - иммуносенсоры. Иммуно-

дает ферментативной активностью либо помече-

сенсоры - это устройства, состоящие из специ-

но ферментативной меткой), так и косвенной

фичного антигена/антитела, связанного с преоб-

(когда исследуемое вещество, связавшееся с им-

разователем и передатчиком сигнала о связыва-

мобилизованными на твердой фазе антителами,

нии соответствующего лиганда. Общая схема

инкубируется с антителами, меченными фермен-

иммуносенсора представлена на рис. 2. В работе

тативной меткой).

иммуносенсора в качестве определяемых соеди-

нений или распознающих молекул обязательно

Среди иммуносенсоров выделяют четыре ос-

принимают участие антитела, которые иммоби-

новных типа датчиков: измерители электрохими-

лизуются на сенсоре или вводятся в пробу при

ческих процессов (потенциометрия, амперомет-

выполнении конкурентного формата анализа.

рия); измерители массы (пьезоэффект); измерите-

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

660

ГУЛИЙ и др.

ли тепла (калориметрия); измерители оптических

ружения хлорамфеникола в меде показаны в ра-

свойств. Количественный результат может быть

боте [17]. Полимеразная реакция смещения цепи

получен в режиме реального времени.

позволила определить наличие охратоксина в об-

разцах виноградного сока [18]. Возможности при-

Например, в работе [14] представлен одноразо-

менения аптамеров и теоретическое исследова-

вый амперометрический магнитоиммуносенсор,

ние с целью их дизайна и моделирования приве-

включающий использование антител, иммобили-

дены в работе [19].

зованных на поверхности магнитных шариков с

белком G (ProtG-MB), и угольных электродов с

Методы комбинирования аптасенсора и флуо-

трафаретной печатью, для количественного и спе-

ресценции являются наиболее распространенны-

цифичного определения остатков тетрациклинов

ми благодаря их превосходной чувствительности

в молоке.

и селективности, удовлетворительному про-

странственному и временному разрешению и

Для решения проблемы определения остатков

экономической эффективности. Например, в ра-

антибиотиков в молоке авторы другого исследова-

боте [20] описан флуоресцентный аптасенсор для

ния [15] предложили объединить иммунофлуорес-

обнаружения хлорамфеникола с использованием

центный анализ на основе многоцветных кванто-

конъюгированных с аптамером магнитных нано-

вых точек (QD) и метод матричного анализа для

частиц как для индикации, так и для анализа кон-

одновременного, чувствительного и визуального

центрации препарата. Система биоанализа была

обнаружения стрептомицина, тетрациклина и пе-

изготовлена путем иммобилизации аптамера на

нициллина G в молоке. Антитела, специфичные к

поверхности магнитных наночастиц, которые ис-

данным антибиотикам, конъюгировали с QD на

пользовались для захвата и концентрации хло-

разных длинах волн излучения (QD520 нм,

рамфеникола и приводили к изменению флуо-

QD565 нм и QD610 нм) и использовались в каче-

ресцентного сигнала на поверхности магнитных

стве зондов обнаружения. Детекцию проводили

наночастиц.

методом прямого конкурентного флуоресцентного

иммуноанализа в лунках микротитровального

планшета, покрытого антигеном, для одновремен-

СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-

ного качественного и количественного определе-

ИМПРИНТИРОВАННЫХ ПОЛИМЕРОВ

ния остатков указанных антибиотиков. Метод мо-

Элементы распознавания, такие как антитела,

жет обеспечить одновременный анализ несколь-

антигены, иммуноглобулины, ферменты и апта-

ких антибиотиков в нескольких образцах за один

меры, наиболее часто применяемые при форми-

прогон (высокопроизводительный анализ).

ровании рецепторного слоя сенсоров, характери-

зуются высокой специфичностью и позволяют

АПТАСЕНСОРЫ

получать информацию о протекании биохимиче-

ской реакции в растворах практически в режиме

Применение для аффинного взаимодействия

реального времени. При использовании биологи-

аптамеров - молекул некоторых пептидов, ко-

ческих объектов в качестве рецепторов актуаль-

ротких полимеров нуклеиновых кислот ДНК или

ной является проблема повышения времени

РНК, а также их фрагментов (линейных олиго-

функционирование сенсоров на их основе. Слож-

нуклеотидов) - явилось началом разработки ап-

ность получения природных рецепторов, их не-

тасенсоров. По специфичности взаимодействий

устойчивость при хранении, воздействии органи-

аптамеры подобны антителам, но отличаются

ческих растворителей и высоких концентраций

большей устойчивостью и способностью к обра-

электролитов стимулирует поиски синтетических

тимой денатурации, осуществляемой в течение

антител, в качестве которых могут выступать по-

нескольких минут. Развитие аптасенсоров может

лимеры с молекулярными отпечатками, имею-

стать реальной альтернативой высокочувстви-

щие ряд несомненных достоинств по сравнению

тельным и селективным иммуносенсорам для

с биомолекулами.

проведения экологического мониторинга лекар-

Внимание исследователей к полимерам с моле-

ственных препаратов.

кулярными отпечатками связано с их уникальны-

Применение иммобилизованных аптамеров в

ми свойствами обеспечивать высокую селектив-

качестве элементов распознавания (аптасенсоры)

ность молекулярного распознавания одного вида

является весьма перспективным при анализе ан-

целевых молекул в присутствии множества других

тибиотиков, поскольку их чувствительность со-

соединений близкого строения. К их несомнен-

поставима с чувствительностью антител. Кроме

ным достоинствам относятся методическая про-

того, они могут быть химически синтезированы,

стота получения в отличие, например, от выработ-

обладают высокой термической стабильностью,

ки антител к низкомолекулярным соединениям,

легко модифицируются и иммобилизуются [16].

являющейся многостадийным и длительным про-

Возможности применения электрохимическо-

цессом, и высокая воспроизводимость синтезов.

го аптасенсора для высокочувствительного обна-

Кроме того, такие полимеры стабильны в агрес-

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

БИОСЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ

661

сивных средах при резком изменении условий экс-

звукопровода, по которому распространяется

плуатации и могут быть синтезированы к фактиче-

пьезоактивная акустическая волна.

ски любому веществу - неорганическим ионам,

В последнее время для создания акустических

наркотикам, нуклеиновым кислотам, белкам,

клеткам и даже супертоксичным соединениям, для

сенсоров широко используются пьезоэлектриче-

ские резонаторы или линии задержки с распро-

которых, например, поликлональные антитела по-

лучены быть не могут.

страняющейся поверхностной или пластинчатой

акустической волной. Такие биосенсоры чув-

Одним из важных достижений в области био-

ствительны к изменению механических или элек-

сенсорного анализа остатков антибактериальных

трических свойств биологического объекта, кон-

препаратов в пищевых продуктах является при-

тактирующего с поверхностью звукопровода.

менение полимерных сенсоров с молекулярной

Акустические волны, возбуждаемые в пьезоэлек-

печатью (англ. molecularly imprinted polymer sen-

трической среде, позволяют создать целое семей-

sors) [21, 22]. Молекулярный импринтинг - это

ство датчиков, характеризующихся высокой чув-

метод создания синтетических материалов, со-

ствительностью, быстротой проведения анализа,

держащих специфические рецепторные сайты,

дешевизной и небольшими размерами [26].

обладающие высоким сродством к молекуле-ми-

шени. На сегодняшний день наработан значи-

Наиболее часто акустические биологические

тельный материал по теории функционирования

датчики содержат активный слой с иммобилизо-

молекулярно импринтированных полимеров и

ванными антителами, которые анализируются на

методики их синтеза для широкого круга анали-

устойчивость к различным антибиотикам. В этом

тов, в том числе для лекарственных препаратов.

случае причиной изменения выходного аналити-

Для получения пленок молекулярно импринти-

ческого сигнала акустического иммуносенсора яв-

рованных полимеров на поверхности электрода

ляется увеличение массы распознающего слоя при

сенсора наибольшее распространение получили

взаимодействии с определяемым соединением

способ фотополимеризации покрытия при вра-

(прямой формат иммуноанализа) или с антитела-

щении (spin-coating), сэндвич-метод (sandwich-

ми к нему (конкурентный формат иммуноанали-

casting), а также способы термоиндуцированного

за). Например, на этом принципе разработан им-

разделения фаз, послойного депонирования

муносенсор, включающий пьезоэлектрический

(layer-de-layer deposition), электрополимеризации

резонатор и слой электрогенерированного поли-

и смешанные подходы, основанные на нанотех-

мера для определения следовых количеств хлорам-

нологиях [23, 24].

феникола в мясе, молоке, яйцах, меде [27]. Этим

Формирование распознающего слоя на по-

же коллективом авторов проведен подбор условий

верхности полимерного или золь-гель-материала

синтеза наночастиц полимеров с молекулярно-им-

способом поверхностного импринтинга позволя-

принтированными полимерами для применения в

ет осуществлять специфическое распознавание

качестве распознающего слоя пьезоэлектрическо-

макромолекулекул или биоаналитов. Поверх-

го сенсора для высокочувствительного определе-

ность полимера геометрически и химически под-

ния рактопамина в водных средах [28]. В работе

гоняется под структуру аналита, что способствует

[29] описана возможность применения пьезоэлек-

обратимому и быстрому связыванию и удалению

трического сенсора на базе магнитных наночастиц

с поверхности «отпечатка» целевой молекулы.

для выявления и определения тетрациклина в жид-

В работе [5] представлен краткий обзор по из-

ких средах.

готовлению и свойствам электродов на основе

Известны также биосенсоры на основе по-

трафаретной печати, описаны возможности их

верхностных акустических волн, которые ис-

применения для обнаружения антибиотиков,

пользовались для быстрого обнаружения пени-

бактерий и оценена их чувствительность к анти-

циллина G в молоке [30]. Это первый случай

биотикам. На основе магнитных многостенных

использования подобного биосенсора для обна-

углеродных нанотрубок разработан магнитно-

импринтированный электрохимический сенсор

ружения антибиотиков.

для чувствительного определения канамицина в

Весьма перспективным для анализа антибио-

реальных образцах [25].

тиков является акустический биологический дат-

чик на основе двух пьезоэлектрических пластин,

разделенных воздушным зазором. В работе [31]

АКУСТИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ

показано, что изменение выходного сигнала дат-

Принцип действия электроакустических ме-

чика при добавлении ампициллина к суспензии

тодов анализа основан на регистрации биоспеци-

микробных клеток зависит от концентрации пре-

фических реакций в жидкой суспензии, контак-

парата, что открывает возможность не только ка-

тирующей с поверхностью пьезоэлектрического

чественного, но и количественного анализа.

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

662

ГУЛИЙ и др.

Рис. 3. Общая схема работы датчика на основе сверхвысокочастотного резонатора.

МИКРОБНЫЕ СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ

пример, в работе [37] описан микроволновый

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ

микрожидкий биосенсор для быстрого и бескон-

тактного тестирования концентрации и роста

В последнее время наблюдается повышенный

Escherichia coli в среде с различным pH, а также в

интерес к разработке биосенсоров, биорецепто-

присутствии антибиотиков.

ром которых являются живые ткани, бактерии и

Авторы работы [38] представили бактериаль-

микроорганизмы. Данный тип биосенсоров име-

ный штамм E. coli, содержащий оперон люцифе-

ет множество преимуществ перед ферментными

разы, с помощью которого можно определять тет-

биосенсорами. Прежде всего это связано с тем,

рациклин биолюминесцентным датчиком. Эти

что в клетках существует множество ферментов,

бактерии могут храниться в лиофилизированной

коферментов и кофакторов, что открывает широ-

форме и производят самобиолюминесценцию

кие возможности для определения огромного ко-

при распознавании тетрациклина.

личества химических веществ. Другим несомнен-

ным преимуществом такого вида сенсоров явля-

Наномеханические биосенсоры относятся к

ется то, что клетки легче адаптировать к

подсемейству микроэлектромеханических си-

потреблению и разложению нового субстарта.

стем, состоящему из подвижных подвешенных

Кроме того, прогресс в молекулярной биологии

микроструктур, способных преобразовывать био-

открыл неограниченные возможности для произ-

логические процессы в измеримое механическое

водства микроорганизмов с заданными свойства-

движение. Благодаря своей высокой чувствитель-

ми, улучшающими деятельность либо уже суще-

ности, быстрому отклику и высокой пропускной

ствующего в них фермента, либо экспрессии чу-

способности наномеханическая технология обла-

жеродного фермента в клетку-хозяина.

дает большим потенциалом для преодоления не-

которых ограничений традиционных методов.

Микроорганизмы, проявляющие чувствитель-

Например, в работе [39] представлены возможно-

ность к определяемому антибиотику, в комплексе

сти наномеханических сенсоров не только для об-

с электрофизическим датчиком, могут представ-

наружения бактерий, но и анализа воздействия на

лять простые, чувствительные и быстродейству-

них антибиотиков.

ющие сенсоры. Описано несколько биосенсоров

для обнаружения остатков антибиотиков, осно-

Описаны микробные сенсоры, где бактерии

ванных на применении ферментативной актив-

используются в качестве чувствительного эле-

ности микроорганизмов [32, 33]. Например, си-

мента и иммобилизованы на поверхности датчи-

стемы мониторинга бета-лактамных антибиоти-

ка. Так, в работе [40] продемонстрирована воз-

ков основаны на тех же принципах, что и тесты

можность определения ампициллина с помощью

микробиологического ингибирования [34], с той

микробной сенсорной системы и датчика на ос-

разницей, что сигнал реакции биораспознавания

нове свехвысокочастотного резонатора. Общая

определяется или количественно, или полуколи-

схема такого датчика представлена на рис. 3. По-

чественно. Микробные биосенсоры основаны на

казано, что воздействие ампициллина приводит к

измерении ингибирования роста бактерий из-за

существенному изменению минимального значе-

присутствия антибиотиков и представлены в ра-

ния коэффициента отражения S₁₁ вблизи резо-

ботах [35, 36].

нансной частоты и зависит от концентрации ан-

тибиотика.

Особый интерес представляют микробные

датчики, позволяющие проводить исследование

В работе [41] представлен интегрированный

без иммобилизации компонентов анализа. На-

биосенсор на базе смартфона LumiCellSense, ко-

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

БИОСЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ

663

торый включает в себя 16-луночный биочип с

формацию о кинетике взаимодействий, возника-

кислородопроницаемым покрытием с иммоби-

ющих на поверхности металлической пленки [42,

лизованными биолюминесцентными клетками

43].

E. coli для определения ципрофлоксацина в цель-

В дальнейшем, используя явление плазмонно-

ном молоке.

го резонанса, рядом исследователей была показа-

на возможность его применения для анализа ан-

тибиотиков. Согласно данным, представленным

ОПТИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ

в работе [4], оптические биосенсоры на основе

В оптических биосенсорах аналитический сиг-

ППР довольно часто используются для обнару-

нал обусловлен не химическим взаимодействием

жения или количественного определения остат-

определяемого компонента с чувствительным

ков антибактериальных или противомикробных

элементом, а измеряемыми физическими пара-

препаратов в пищевой промышленности. Ис-

метрами - интенсивностью поглощения и отра-

пользование ППР примерно в два с половиной

жения света, интенсивностью люминесценции

раза больше, чем у любого другого метода оптиче-

объекта и т.д. Принцип действия оптических био-

ского биодатчика, из-за его надежности и высо-

сенсоров основан на регистрации изменений оп-

кой экономической эффективности. Возможно-

тических свойств среды: оптической плотности

сти применения ППР биосенсоров для определе-

(денситометрические биосенсоры), цвета (коло-

ния антибиотиков показаны в работе [44].

риметрические биосенсоры), мутности (турбиди-

Другой важной, но менее изученной областью

метрические биосенсоры), показателя преломле-

ния среды (рефрактометрические биосенсоры) в

применения является использование гибридных

результате присутствия биологического агента. В

методов, которые сочетают электрохимию с оп-

настоящее время наибольшее развитие получили

тическими методами для определения ампицил-

оптические биосенсоры, основанные на измене-

лина в речной воде [45]. Авторы другого исследо-

вания представили экспериментальную гибрид-

нии направления распространения светового по-

тока, проходящего через оптическое волокно или

ную платформу, объединяющую пластиковое

треугольную призму, покрытую тонкой пленкой

оптическое волокно с поверхностным плазмон-

металла. Они основаны на эффекте поверхност-

ным резонансом и электрохимический (био)сен-

ного плазмонного резонанса. Оптические био-

сор для анализа ампициллина в воде [46].

сенсоры, включая планарные волноводные сен-

Интересный подход к распознаванию амино-

соры, были разработаны одновременно с первы-

гликозидов (неомицина, канамицина, стрепто-

ми электрохимическими устройствами, но в

мицина) в образцах молока с использованием

течение длительного времени они не получили

функционализированных наночастиц золота для

должного внимания [9].

усиления сигнала ППР и повышения чувстви-

В конце 60-х годов ХХ века Е. Кретчманном

тельности сенсора описан в работе [47].

была показана возможность возбуждения поверх-

Одним из новейших методов оценки измене-

ностных плазмонов поляризованным светом, что

ния электрофизических и морфометрических па-

послужило толчком к развитию метода поверх-

раметров микробных клеток без их иммобилиза-

ностного плазмонного резонанса. ППР представ-

ции под влиянием электрического поля в режиме

ляет собой явление, возникающее на границе

реального времени без специальной пробоподго-

раздела фаз, например, стеклянная призма - ме-

товки является электрооптический мониторинг

таллическая пленка. Часть луча света, проходя-

[48]. Общая схема электрооптического датчика

щего через призму и падающего под определен-

представлена на рис. 4. Воздействие антибакте-

ным углом на поверхность металла, распростра-

риальных препаратов на микробные клетки мо-

няется в металлической пленке в виде

жет быть зафиксировано в жидкой фазе с помо-

затухающей электромагнитной волны, которая

щью оптической сенсорной системы, что и пока-

вызывает коллективные колебательные движе-

зано в работе [49] при определении ампициллина.

ния свободных электронов. Эти колебательные

движения электронов (поверхностные плазмо-

Фотонный подход для анализа антибиотиков и

ны) в металлической пленке сопровождаются

мониторинга устойчивости бактерий к ним про-

электрическим полем, которое экспоненциально

демонстрирован в работе [50]. Добавление в среду

убывает с увеличением расстояния от поверхно-

измерения антибиотиков приводит к изменению

сти диэлектрика (призмы). Связь изучаемого

оптических свойств и подвижности бактерий, что

объекта с поверхностью металлической пленки

контролируется с помощью измерения резонанс-

приводит к изменению скорости распростране-

ной длины волны. Анализ позволяет параллельно

ния плазмонов и, следовательно, к изменению уг-

изучать как оптический, так и электрический от-

ла пространственного резонанса. Изменение угла

вет отдельных бактерий и контролировать ско-

пространственного резонанса можно отслежи-

рость их метаболизма после воздейстия антибио-

вать в режиме реального времени, получая ин-

тиков.

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

664

ГУЛИЙ и др.

Рис. 4. Общая схема электрооптического датчика.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биосенсорные системы для определения антибио-

тиков можно условно разделить на две большие

С момента открытия пенициллина в 1929 г.

группы - сенсоры без иммобилизации и с иммо-

человечество активно использует этот и другие ан-

билизацией компонентов анализа.

тибиотики для борьбы с бактериальными заболе-

В таблице представлены краткие данные о

ваниями. Доступность антибиотиков, низкая

биосенсорных системах для анализа антибио-

стоимость их производства, неправильное и чрез-

тиков.

мерное использование приводит к широкому рас-

пространению антибиотиков в окружающей среде,

С нашей точки зрения наиболее перспектив-

в частности, к высокому загрязнению водных ре-

ными для анализа антибиотиков являются сенсо-

сурсов. Поэтому существует большая потребность

ры, позволяющие проводить анализ непосред-

в мониторинге и определении антимикробных

ственно в жидкости без предварительной подго-

препаратов в различных средах; продуктах пита-

товки образца. Немаловажным фактором

ния, напитках и образцах промышленной и питье-

является возможность многократного использо-

вой воды и т. д. Для определения антибиотиков

вания сенсоров, но в этом случае сразу возникает

разработано достаточно большое количество мето-

вопрос о методах очистки датчика от отработан-

ного образца. К сожалению, не во всех работах,

дов. Фармакокинетические исследования, прово-

димые на биологических средах, требуют опреде-

описывающих многократное применение датчи-

ления низких концентраций антибиотиков

ков, приводятся данные о способах их очистки. В

(C_min < 10 мкг/мл), следовательно, для данных це-

зависимости от условий, в которых проводится

анализ препаратов, иногда проще применять од-

лей необходимы более чувствительные и быстрые

норазовые системы, но в таком случае возникает

методы. На практике также часто возникает про-

другой вопрос, связанный с условиями утилиза-

блема детекции антибиотиков на большом массиве

ции отработанных систем. Основываясь только

образцов. Перспективными методами анализа

на литературных данных, нельзя сделать объек-

противомикробных препаратов являются биосен-

тивный вывод о перспективности тех или иных

сорные технологии. Биосенсорные методы имеют

датчиков, относящихся к разным типам.

довольно широкое применение и постепенно ста-

новятся неотъемлемой частью при клинической

Тем не менее постоянно возникает необходи-

диагностике и экологическом мониторинге. Био-

мость для развития надежных и чувствительных

сенсоры позволяют значительно уменьшить время

биосенсоров, позволяющих проводить анализ

проведения анализа благодаря относительной про-

широкого спектра антибиотиков. В идеале хоро-

стоте проведения процедур, обходятся минималь-

шо иметь сеть биосенсоров «скоростного типа»,

ной предварительной обработкой исследуемого

которые будут использоваться в качестве перво-

материала и, как показывают литературные дан-

начального заключения о наличии/отсутствии

ные, являются довольно чувствительными.

антибактериального препарата в диагностируе-

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

БИОСЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ

665

Краткие сведения о биосенсорах, разработанных для анализа антибактериальных препаратов

№

Определяемый

Источ-

Принцип действия, чувствительный элемент

Пределы детекции

п/п

антибиотик

ник

Электрохимическое определение проводится с

использованием прямоугольной адсорбционной

Норфлоксацин

6.6 нмоль/мл

[10]

анодной вольтамперометрии с помощью

стеклоуглеродного электрода и пленки хитозана

Датчик использует самосборный иммуноанализ для

0.01 нг/мл при анализе в

определения биомаркера цефтиофура с помощью

фосфатно-солевом

спектроскопии электрохимического импеданса путем

Цефтиофур

растворе и 10 нг/мл при

[11]

исследования межфазных емкостных изменений при

анализе в образцах фарша

связывании цефтиофура с поверхностью датчика

из мяса индейки

Иммуносенсоры

Амперометрический магнитоиммуносенсор,

включающий использование антител, иммобилизован-

Тетрациклин

44 нг/мл в образцах молока

[14]

ных на поверхности магнитных шариков

Метод прямого конкурентного флуоресцентного

Стрептомицин,

иммуноанализа в лунках микротитровального

5 нг/мл для всех указанных

тетрациклин и

[15]

планшета, покрытого антигеном, для одновременного

антибиотиках

пенициллин G в молоке

определения антибиотиков

Аптасенсоры

Хлорамфеникол в меде.

0.29 нМ

[17]

Электрохимический аптасенсор с применением

Охратоксин в

аптамера, иммобилизованного на электроде

виноградном соке

5 нМ

[18]

Флуоресцентный аптасенсор с применением аптамера,

иммобилизованного на поверхности магнитных

Хлорамфеникол

0.01 нг/мл

[20]

наночастиц

Сенсоры на основе молекулярно-импринтированных полимеров

Магнитно-импринтированный электрохимический

Канамицин в реальных

2.3 ⋅ 10^-11 моль/мл (отно-

[25].

сенсор для определения антибиотиков

образцах

шение сигнал/шум 3 дБ)

Акустические биосенсоры

Иммуносенсор, включающий пьезоэлектрический

Хлорамфеникол в мясе,

0.2 нг /мл

[27]

резонатор и слой электрогенерированного полимера

молоке, яйцах, мед.

Рактопамин в водных

[28]

Пьезоэлектрический сенсор с молекулярно-

средах.

12 мкг/мл

импринтированными полимерами в качестве

Тетрациклин в водных

распознающего слоя

растворах

4.5 мкг/см³

[29]

2 нг/мл при анализе в

буфере и 2.2 нг/мл при

Сенсор на основе поверхностных акустических волн

Пенициллин G в молоке

[30]

анализе в нежирном

молоке

Акустический биологический датчик на основе двух

Ампициллин в водных

пьезоэлектрических пластин, разделенных воздушным

2 мкг/мл

[31]

средах

зазором

Микробные сенсорные системы

5 нг/г для доксициклина;

7.5 нг/г для хлор-

Биолюминисцентный датчик на основе штамма E. coli

тетрациклина и 25 нг/г для

K-12, который содержит оперон бактериальной

Тетрациклины

[38]

тетрациклина и окси-

люциферазы Photorhabdus luminescens

тетрациклина в тканях

рыбы

Сенсорная система на основе сверхвысокочастотного

Ампициллин

4 мкг/мл

[40]

резонатора и микробных клеток

Сенсор на базе смартфона LumiCellSense, состоящий

Ципрофлоксацин в

из 16-луночного биочипа с биолюминесцентными

7.2 нг/мл

[41]

цельном молоке

клетками

Оптические биосенсоры

Аминогликозиды

Датчик на основе ППР с использованием

2.00 ± 0.21 pM, 1.00 ± 0.10

(неомицин, канамицин,

функционализированных наночастиц золота для

pM,

[47]

стрептомицин) в образцах

усиления сигнала

200 ± 30 fM

молока

Электрооптический сенсор на основе микробных

Ампициллин

0.5 мкг/мл

[49]

клеток, чувствительных к определяемому антибиотику

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

666

ГУЛИЙ и др.

мом образце. Для достижения этой цели жела-

9. G. Evtugyn, Biosensors. Essentials (Springer, 2013).

тельно использовать портативный биосенсор с

10. A. M. Santos, A. Wong, F. H. Cincotto, et al., Mikro-

высокой чувствительностью и точностью, кото-

chim. Acta 186 (3), 148 (2019).

рый может обнаруживать антибиотик в режиме

11. H. S. Stevenson, S. S. Shetty, N. J. Thomas, et al., ACS

реального времени.

Omega 4, 6324 (2019).

В целом, как представлено в данном материа-

12. F. Fernandez, K. Hegnerova, M. Piliarik, et al.,

ле, область биосенсоров включает широкий

Biosens. Bioelectron. 26, 1231 (2010).

спектр с большим потенциалом роста в ближай-

шем будущем. Дальнейшая стандартизация и ав-

13. F. Fernandez, D. G. Pinacho, F. Sanchez-Baeza, and

томатизация биосенсорных методов позволит

M. P. Marco, J. Agricult. Food Chem. 59, 5036 (2011).

расширить круг их применения и использования

14. F. Conzuelo, M. Gamella, S. Campuzano, et al., Anal.

в микробиологии, биотехнологии, ветеринарии,

Chim. Acta 737, 29 (2012).

медицине и для защиты окружающей среды.

15. E. Song, M. Yu, Y. Wang, et al., Biosens. Bioelectron.

72, 320 (2015).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

16. K. Reder-Christ and G. Bendas, Sensors 11, 9450

(2011).

Работа выполнена при частичной финансовой

поддержке Министерства образования и науки

17. L. Yan, C. Luo, W. Mao, et al., J. Electroanal. Chem.

Российской Федерации в рамках Государствен-

687, 89 (2012).

ного задания и Российского фонда фундамен-

18. S. M. Taghdisi, N. M. Danesh, M. Ramezani, et al.,

тальных исследований (проект № 19-07-00304).

Talanta 223 (Pt. 1), 121705 (2021).

19. A. A. Buglak, A. V. Samokhvalov, A. V. Zherdev, and

B. B. Dzantiev, Int. J. Mol. Sci. 21, 8420 (2020).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

20. S. Wu, H. Zhang, Z. Shi, et al. Food Control. 50, 597

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

(2015).

интересов.

21. W. Lian, S. Liu, J. Yu, et al., Biosens. Bioelectron. 38,

163 (2012).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

22. M. L. Yola, L. Uzun, N. Özaltin, and A. Denizli, Ta-

Настоящая работа не содержит описания ка-

lanta 120, 318 (2014).

ких-либо исследований с использованием людей

23. Т. Н. Ермолаева, В. Н. Чернышова, Е. В. Чесноко-

и животных в качестве объектов.

ва и О. И. Бессонов, Сорбционные и хроматогра-

фические процессы 15 (2), 151 (2015).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

24. G. Vasapollo, R. D. Sole, L. Mergola, et al., Int. J. Mol.

Sci. 12 (9), 5908 (2011).

1. M. Ierapetritou, F. Muzzio, and G. Reklaitis. AIChE J.

62, 1846 (2016).

25. F. Long, Z. Zhang, Z. Yang, et al., J. Electroanal.

Chem. 755, 7 (2015).

2. World Health Organization. Tackling Antibiotic Resis-

tance from a Food Safety Perspective in Europe; World

26. G. N. Durmuşa, R. L. Linb, M. Kozbergc, et al., Acous-

tic-Based Biosensors. Encyclopedia of Microfluidics and

Health Organization Regional Office for Europe (Copen-

hagen, Denmark, 2011), pp. 1-88.

Nanofluidics (Springer Science+Business Media,

N. Y., 2014).

3. Methods for the determination of susceptibility of bacteria

to antimicrobial agents Terminology, EUCAST Defini-

27. N. A. Karaseva and T. N. Ermolaeva, Talanta 93, 44

tive Document 4, 291 (1998).

(2012).

4. N. A. Mungroo and S. Neethirajan, Biosensors 4, 472

28. T. N. Ermolaeva, O. V. Farafonova, V. N. Chernysho-

(2014).

va, et al., J. Anal. Chem. 75 (10), 1270 (2020)

29. Е. В.Бизина, О. В. Фарафонова, Н. В. Тарасова и

5. F.-D. Munteanu, A. M. Titoiu, J.-L. Marty, and A. Va-

Т. Н. Ермолаева, Сорбционные и хроматографи-

silescu, Sensors 18, 901 (2018).

ческие процессы 21 (2), 177 (2021).

6. B. Leca-Bouvier and L. Blum, in Recognition receptors

30. F. J. Gruhl and K. Länge. Food Anal. Methods 7, 430

in biosensors, Ed. by M. Zourob (Springer. New York,

(2014).

2010), pp. 177-220.

31. O. I. Guliy, B. D. Zaitsev and I. A. Borodina, Appl. Mi-

7. F. Moreira, R. Dutra and J. Noronha, and M. G. F. Sa-

crobiol. Biotechnol. 104 (3), 1283 (2020).

les, Biosens. Bioelectron. 56, 217 (2014).

32. A.M. Ferrini, V. Mannoni, G. Carpico et al. J. Agric.

8. Г. К. Будников, Г. А. Евтюгин и В. Н. Майстренко,

Food Chem. 56, 784 (2008).

Модифицированные электроды для вольтамперо-

метрии в химии, биологии и медицине (Лаборатория

33. S. Das, N. Kumar, R. H. Vishweswaraiah, et al., J.

знаний, Москва, 2020).

Food Sci. Technol. 51, 1161 (2014).

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

БИОСЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ

667

34. C. Cháfer-Pericás, Á. Maquieira, and R. Puchades,

43. C. Garcia-Aljaro, X. Munoz-Berbel, A. T. A. Jenkins,

Trends Anal. Chem. 29, 1038 (2010).

et al., Appl. Environ. Microbiol. 74 (13), 4054 (2008).

35. R. Babington, S. Matas, M. P. Marco, and R. Galve,

44. H.-F. Chen, C.-H. Lin, C.-Y. Su, et al., in Biosensors

Anal. Bioanal. Chem. 403, 1549 (2012).

for Health, Environment and Biosecurity (2011), Chapt.

21, pp. 453-468.

36. M. C. Beltran, M. I. Berruga, A. Molina, et al., Int.

Dairy J. 41, 13 (2015).

45. A. Blidar, B. Feier, M. Tertis, et al. Anal. Bioanal.

37. R. Narang, S. Mohammadi, A. M. Mohammadi, et al.,

Chem. 411, 1053 (2019).

Sci. Rep. 8, 15807 (2018).

46. R. Galatus, B. Feier, C. Cristea, N. Cennamo, and

38. N. E. Virolainen, M. G. Pikkemaat, J. W. A. Elferink,

L. Zeni, Proc. SPIE 10405, id. 104050C (2017).

et al., J. Agric. Food Chem. 56, 11065 (2008).

47. M. Frasconi, R. Tel-Vered, M. Riskin, and I. Willner.

39. F. Pujol-Vila, R. Villa, and M. Alvarez, Front. Mech.

Anal. Chem. 82, 2512 (2010).

Eng. 6 (2020). DOI: 10.3389/fmech.2020.00044

48. O. I. Guliy and V. D. Bunin, in Biointerface Engineer-

40. О. I. Guliy, B. D. Zaitsev, A. V. Smirnov, et al., Bio-

ing: Prospects in Medical Diagnostics and Drug Delivery,

sens. Bioelectron. 130, 95 (2019).

Ed. by P. Chandra and L. M. Pandey (Springer, 2020),

chapter 11, pp. 233-254.

41. M.-Y. Lu, W.-C. Kao, S. Belkin, and J.-Y. Cheng, Sen-

sors. 19, 3882 (2019).

49. O. I. Guliy, S. S. Evstigneeva, and V. D. Bunin, Talanta

225, 122007 (2021).

42. N. J. De Mol and M. J. Е. Fischer, Surface Plasmon

Resonance. Methods and Protocols (Humana Press, New

50. D. Conteduca, G. Brunetti, F. Dell’Olio, et al.,

Jersey, 2010).

Biomed. Optics Express 10 (7), 463 (2019).

Biosensor Systems for Antibiotics Detection

O.I. Guliy*^, **, B.D. Zaitsev***, A.К.М Alsowaidi****, O.A. Karavaeva*,

L.G. Lovtsova**, and I.A. Borodina***

*Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences,

prosp. Entuziastov 13, Saratov, 410049 Russia

** Saratov State Vavilov Agrarian University, Teatralnaya pl. 1, Saratov, 410012 Russia

***Saratov Branch of Kotelnikov Institute of Radioengineering and Electronics, Russian Academy of Sciences,

ul. Zelenaya 38, Saratov, 410019 Russia

Antibiotics are widely used in medicine, veterinary and the food industry. However, the active use of antibac-

terial drugs leads to environmental pollution. In this regard, there is a great need for monitoring and deter-

mining antibiotics in various environments such as drinking water, food, beverages, pharmaceutical waste wa-

ter from pharmaceutical enterprises, etc. A sufficient number of methods have been developed to determine

antibiotics, including those which based on biosensors. Biosensor methods of analysis are widely used and are

an integral part of environmental monitoring. Electrochemical, optical, acoustic, microbial biosensors, im-

muno- and aptasensors, as well as sensors based on molecular imprinted polymers are the most popular for

the analysis of antibiotics. The article provides a brief overview of biosensor methods and approaches for the

antibiotics determination. The analysis of the most promising biosensor systems for antibacterial drugs detec-

tion has been carried out.

Keywords: antibiotics, detection methods, biosensors, aptamers, antibodies, microbial cells

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021