БИОФИЗИКА, 2021, том 66, № 4, с. 720-723

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 616. 127:599.325

ИЗМЕНЕНИЕ ОСНАЩЕННОСТИ МИТОХОНДРИЙ МИОКАРДА

КРОЛИКА ЭНДОГЕННЫМИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИМИ СУБСТРАТАМИ

В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ЧАСТОТЫ И ДЛИТЕЛЬНОСТИ ВИБРАЦИИ

Институт экспериментальной медицины, 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

E-mail: v.v.vorobeva@mail.ru

Поступила в редакцию 29.02.2020 г.

После доработки 29.02.2020 г.

Принята к публикации 14.04.2021 г.

Изучено изменение оснащенности митохондрий миокарда энергетическими субстратами в зависи-

мости от частоты и длительности общей вертикальной вибрации полярографическим методом с по-

мощью закрытого кислородного датчика гальванического типа (электрода Кларка) путем сопостав-

ления скорости эндогенного дыхания на протяжении времени хранения гомогената в аэробных

условиях. Наиболее длительное (56 сеансов) вибрационное воздействие с амплитудой 0.5 мм и ча-

стотой 44 Гц вызвало падение скорости эндогенного дыхания через 40 мин инкубации гомогената

ткани миокарда в 1.4 раза (р < 0.05) по сравнению с контролем, свидетельствуя о развитии угнетения

в системе окисления и утилизации янтарной кислоты, снижении доступности эндогенных субстра-

тов к дыхательной цепи митохондрий кардиомиоцитов и, косвенно, о нарушении структуры и

функции митохондриально-ретикулярной сети.

Ключевые слова: вибрация, митохондрии, энергетический обмен миокарда, янтарная кислота, мито-

хондриально-ретикулярная сеть

DOI: 10.31857/S0006302921040116

Согласно результатам экспериментальных [1,

зуются наиболее высокой плотностью митохон-

2] и клинических [3] исследований сердце являет-

дриальной сети, что и определяет их наибольшую

ся одним из наиболее чувствительных к воздей-

чувствительность к нарушениям энергетического

ствию вибрации органов. Формирующийся на

обмена различной этиологии. Процесс укрупне-

фоне вибрации гипоксический тип клеточного

ния митохондрий, их слияние в комплексы про-

метаболизма [4, 5] и уменьшение синтеза макро-

исходит благодаря белкам цитоскелета и имеет

эргов влечет за собой развитие миокардиодистро-

адаптационное значение при умеренных по силе

фии. Учитывая высокую медико-социальную

стрессовых воздействиях. Если неблагоприятное

значимость вибрационной болезни особое при-

воздействие выходит за границы физиологиче-

кладное значение приобретает детальное изуче-

ской нормы, наблюдается необратимый распад

ние вибрационной уязвимости системы энерго-

митохондриально-ретикулярной сети [10].

продукции миокарда [6].

Целью нашего исследования стало изучение

Изучение окислительного метаболизма воз-

динамики скорости эндогенного дыхания в пере-

можно в переживающих препаратах свежеприго-

живающем гомогенате ткани миокарда после

товленных срезов, изолированных митохондрий

вибрационного воздействия различной частоты и

и гомогенатов тканей [7]. Как известно, митохон-

продолжительности.

дрии в клетке объединены в единую митохондри-

ально-ретикулярную сеть, которая благодаря

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

специфическим механизмам подвижности вызы-

вает распад или слияние митохондрий [8]. Про-

Эксперименты проведены на 75 кроликах-

странственная структура, площадь и плотность

самцах породы Шиншилла (Oristolagus cuniculus,

разветвленной митохондриальной сети определя-

Linnaeus) массой 2.5-3.0 кг, в возрасте трех-четы-

ются типом ткани и ее потребностью в энергии

рех месяцев. Действие общей вертикальной виб-

[9] и, в свою очередь, обеспечивают регуляцию

рации с амплитудой 0.5 мм осуществляли с помо-

физиологического состояния клеток. Клетки сер-

щью промышленной установки УВ 70/200. Еже-

дечной, скелетной мышцы и нейроны характери-

дневно в течение 7, 21 и 56 суток проводили

720

ИЗМЕНЕНИЕ ОСНАЩЕННОСТИ МИТОХОНДРИЙ МИОКАРДА

721

сеансы вибрации с частотой 8 Гц (низкочастотная

ли полярографическим методом с помощью за-

вибрация) и 44 Гц (высокочастотная вибрация)

крытого кислородного датчика гальванического

по 60 мин в утренние часы с 9.00 до 11.00 в осенне-

типа [11] в термостатируемой кювете объемом

зимний период.

1 мл при постоянном перемешивании в солевой

среде инкубации, уравновешенной по газовому

Некропсию животных осуществляли на фоне

составу с воздухом при температуре 37°C. Поля-

легкого эфирного наркоза методом воздушной

рографическая измерительная установка, в соот-

эмболии путем введения в ушную артерию 5 мл

ветствии с требованиями метода, состояла из

воздуха. После вскрытия грудной клетки быстро

электрода, ячейки с перемешивающим стержнем,

извлекали сердце и помещали в среду выделения

термостатируемого кожуха, водяного термостата

фиксированного состава, охлажденную до 0°С.

I ТЖ-0 03 (Россия), магнитной мешалки ММ-3М

Для имитации состава внутриклеточной среды

(Россия), cамописца LKB-2210

2-Channel

использовали апробированные в других исследо-

Reсorder (Швеция). Скорость дыхания митохон-

ваниях [9] сложные солевые растворы. Концен-

трация компонентов среды выделения составляла

дрий (V) выражали в (нг-атом О) мин^-1мг^-1 белка.

250 мМ сахарозы, 10 мМ трис-HCl (рН 7.2); кон-

Для оценки динамики истощения эндогенных

центрация компонентов среды инкубации

энергетических субстратов в ткани использовали

10 мМ трис-HCl (рН 7.2), 20 мМ КН₂РО₄, 10 мМ

тест «временной деградации митохондрий» [7], в

МgSO₄, 150 мМ КСl. Все растворы готовили

котором сопоставляли изменчивость скорости

eх tempore на бидистиллированной воде.

эндогенного дыхания (V_э) на протяжении 60 мин

хранения гомогената в аэробных условиях при

После промывания от крови кусочки верхуш-

комнатной температуре 18-20°C. Каждые 20 мин

ки сердца массой примерно 250-300 мг помеща-

отбирали пробы для измерения V_э и относили

ли в охлажденный стальной пресс с отверстиями

1 мм и продавливали в калиброванный гомогени-

значения к исходной скорости эндогенного дыха-

затор Даунса из кварцевого стекла с тефлоновым

ния, измеренной тотчас же после получения све-

пестиком при соотношении «среда выделения»:

жего гомогената.

«ткань» = 1 : 2. Ткань разрушали мягкими про-

Статистическую обработку данных проводили

дольными движениями пестика (15 тракций), за-

с помощью пакета программ STATISTICA for

тем гомогенат процеживали через капроновую

Windows 6.0. Значимость межгрупповых разли-

сетку в охлажденную пробирку. Через 7-10 мин

чий оценивали по параметрическому (t-критерий

от момента извлечения тканей из организма жи-

Стьюдента) или непараметрическому (U-тест

вотного получали 30%-й гомогенат [10].

Вилкоксона-Манна-Уитни) критериям в зави-

Временной режим забора ткани миокарда, го-

симости от типа распределения.

могенизации и инкубации был стандартизован. С

момента забоя животного до окончания поляро-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

графического измерения показателей активности

митохондрий тканей проходило не более 40 мин,

После семи сеансов вибрации с частотой 8 Гц

что соответствовало методическим требованиям

на 60-й минуте наблюдали снижение скорости

обеспечения адекватности статуса митохондрий

эндогенного дыхания относительно исходного

in vitro их «нативному» состоянию, максимально

уровня в 1.4 раза (р < 0.01), но после 56 сеансов

приближенному к in vivo [10].

вибрации был отмечен рост скорости дыхания го-

могената на 40-й и 60-й минутах в 1.2 раза относи-

Для получения нативных митохондрий ис-

тельно исходного уровня (р < 0.01), достоверно

ключали этап промывки, использовали высоко-

превосходящий изменения в ткани интактного

концентрированный гомогенат, а из среды выде-

контроля. Вероятно, слабый раздражитель в виде

ления и среды инкубации исключали этиленди-

низкочастотной непродолжительной (семь сеан-

аминтетрауксусную кислоту

[8], тем самым

сов) вибрации, возбуждая ткань, одновременно

сохраняя пул эндогенных метаболитов и уровни

включает компенсаторные механизмы, направ-

ионов Са²⁺ и Мg⁺, характерные для исходного

ленные на сохранение гомеостаза. Основным ме-

состояния ткани на момент изъятия из организма

ханизмом адаптивной компенсации на уровне

животного-биомодели. Работа с митохондриями

системы энергопродукции клетки является акти-

в составе тканевого гомогената обеспечивает их

визация и регуляция (сдерживание) сукцинатза-

структурно-функциональную сохранность и поз-

висимых реакций, в том числе и в переживающей

воляет дифференцировать экспериментальных

ткани [12], вызывающие эффект «энергетическо-

животных по биоэнергетическому статусу ткани в

го затормаживания» или «превентивное тормо-

зависимости от различных внешних воздействий,

жение» [11]. Подобное активное сдерживание

направленных на целостный организм [10].

сукцинатзависимой системы окисления соответ-

Изучение функционального состояния натив-

ствует отрегулированному состоянию энергети-

ных митохондрий в составе гомогената проводи-

ческого обмена. Как предполагают, именно это

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

722

ВОРОБЬЕВА, ШАБАНОВ

рости дыхания достигают максимальных величин,

нарастая с 16.5 ± 4.2 у контрольных животных до

25.9 ± 6.6 (нг-атом О) мин^-1мг^-1 белка у живот-

ных, подвергнутых 21 сеансу вибрации с частотой

44 Гц, и происходит смена метаболических путей

субстратного обеспечения миокарда с доминиро-

ванием метаболизма янтарной кислоты [15].

После пролонгации вибрационного воздей-

ствия с частотой 44 Гц до 56 сеансов наблюдали

падение скорости V_э через 40 мин инкубации в

1.4 раза (р < 0.05) и дальнейшее плавное снижение

до уровня 17.7 ± 5.7 (нг-атом О) мин^-1мг^-1 белка,

что, вероятно, свидетельствует о развитии угнете-

ния в системе окисления и утилизации янтарной

кислоты, снижении доступности эндогенных

субстратов к дыхательной цепи митохондрий

кардиомиоцитов, формированию низкоэнерге-

тического сдвига и нарастании дистрофических

изменений в ткани миокарда вплоть до развития

Влияние вибрации 44 Гц на изменчивость эндоген-

некротических изменений [16].

ного дыхания (V_э) нативных митохондрий сердца

кролика в тесте временной деградации. Ось абсцисс -

время инкубации гомогената в минутах; ось

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ординат - диапазон и направленность изменений эн-

догенного дыхания в % от исходного уровня (V_э1

Настоящее экспериментальное исследование

Цифры возле кривых - количество сеансов вибра-

посвящено изучению влияния общей вертикаль-

ции; * - статистически значимые различия с исход-

ной вибрации с амплитудой 0.5 мм, частотой 8 и

ным показателем (V_э1); * - р ≤ 0.05, ** - р ≤ 0.01.

44 Гц на протяжении 7, 21 и 56 сеансов по 60 мин

на функциональную активность системы энерго-

продукции миокарда кролика посредством анали-

явление обеспечивает усиление процессов сано-

за скорости эндогенного дыхания в переживаю-

генеза и лечебный эффект вибрации с определен-

щих гомогенатах ткани сердца (миокарда) кро-

ными физическими характеристиками, широко

лика.

используемый в клинике целого ряда заболева-

ний [13, 14]. Значительный рост V_э после 56 сеан-

Измерение дыхания митохондрий в составе

тканевых гомогенатов проводилось полярогра-

сов низкочастотной вибрации свидетельствует о

фическим методом согласно методическим реко-

«возбужденном» состоянии системы энергопро-

мендациям М.Н. Кондрашовой (ПНЦБИ РАН,

дукции. Для подобного состояния ткани харак-

Пущино).

терно преобладание активности сукцинатзависи-

мой системы окисления, что соответствует

Было обнаружено, что в процессе формирова-

стадии

«резистентности» при формировании

ния ответной реакции миокарда на вибрационное

адаптивной реакции в системе энергопродукции

воздействие с различной частотой и длительно-

митохондрий кардиомиоцитов или стадии I био-

стью его энергетические потребности возрастают

энергетической гипоксии [12].

и начинают восполняться за счет эндогенных

энергетических ресурсов, уровень и доступность

Динамика изменения скорости эндогенного

которых отражается в скорости эндогенного дыха-

дыхания после семи сеансов вибрации с частотой

ния (V_э) митохондрий в гомогенате ткани и зави-

44 Гц на 20-й и 40-й минутах переживания гомоге-

сит от физических параметров стрессирующего

ната идентична интактному контролю (рис. 1). На

вибрационного фактора. Тест «временной дегра-

60-й минуте отмечается снижение показателя эн-

дации митохондрий», отражая оснащенность ми-

догенного дыхания относительно V_э1 в 1.1 раза и в

тохондрий миокарда эндогенными энергетиче-

1.4 раза относительно V_э1интактной контрольной

скими субстратами, может выступать в качестве

группы (р < 0,01). Двадцать один сеанс высокоча-

метаболического критерия функционального со-

стотной вибрации вызвал резкий подъем эндоген-

стояния ткани и свидетельствовать о силе клеточ-

ного дыхания относительно нулевого показателя в

ного ответа на воздействие вибрации.

1.4 раза (р < 0.01) через 20 мин инкубации гомоге-

В эксперименте in vitro подтвердили важность

ната и в 1.1 раза - через 40 мин, оставаясь на дан-

сохранения биофизической организации натив-

ном уровне и через 60 мин переживания ткани в

ных митохондрий в тканевом гомогенате. Работа

проводимом тесте. Это может свидетельствовать о

с концентрированными по белку гомогенатами

крайне возбужденном состоянии ткани, когда ско-

тканей позволяет информативно выявить силу и

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

ИЗМЕНЕНИЕ ОСНАЩЕННОСТИ МИТОХОНДРИЙ МИОКАРДА

723

направленность возбуждающих и повреждающих

22 сентября 2010 г. по охране животных, исполь-

воздействий в организме экспериментальных жи-

зуемых в научных целях.

вотных.

Динамика показателя скорости эндогенного

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

дыхания митохондрий в тесте временной деграда-

1. Р. М. Janssen, А. Schiereck, and Н. Honda, Pflugers

ции на фоне вибрационного воздействия также

Arch. 434 (6), 795 (1997).

косвенно свидетельствует о нарушении функции

2. T. A. Shishido, М. Sugimachi, and О. Kawaguchi, Am-

митохондриально-ретикулярной сети, ее распаде

er. J. Physiol. 274, 1404 (1998).

и утрате регулирующей функции в адаптации.

3. Е. Л. Потеряева, Е. Л. Амирнова и Н. Г. Никифо-

Можно предположить, что эти процессы проте-

рова, Медицина труда и промышленная экология,

кают параллельно смене «метаболических путей»

№ 6, 19 (2015).

при стрессирующем воздействии и находят выра-

4. V. V. Vorobieva and P. D. Shabanov, Bull. Experim.

жение в формировании митохондриальной дис-

Biol. Med. 147 (6), 768 (2009).

функции или биоэнергетической гипоксии.

5. J. M. Saxton, Occup. Med. 50 (2), 121 (2000).

6. В. А. Панков и М. П. Дьякович, Медицина труда и

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

промышленная экология, № 3, 1 (2003).

Работа выполнена при финансовой поддержке

7. Л. Д. Лукьянова, Дис. … д-ра биол. наук (Москва,

1971).

Российского фонда фундаментальных исследова-

ний (№№10-04-00473, №13-04-00186).

8. М. В. Захарченко, Н. В. Хундерякова и М. Н. Кон-

драшова, Биофизика 56 (5), 840 (2011).

9. В. В. Воробьева и П. Д. Шабанов, Обзоры по кли-

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

нич. фармакологии и лекарственной терапии 14

Автор заявляет об отсутствии конфликта инте-

(1), 46 (2015).

ресов.

10. М. Н. Кондрашова, Т. В. Сирота, А. В. Темнов

и др., Биохимия 62 (2), 154 (1997).

11. Руководство по изучению биологического окисления

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

полярографическим методом, под ред. Г. М. Франка

и М. Н. Кондрашовой (Наука, М., 1973).

Все применимые международные, националь-

12. Л. Д. Лукьянова, Патологическая физиология и

ные и институциональные принципы ухода и ис-

экспериментальная терапия, № 1, 3 (2011).

пользования животных при выполнении работы

13. С. А. Лытаев и А. Б. Шангин, Вестн. новых мед.

были соблюдены. Исследования были выполне-

технологий 6 (2), 11 (1999).

ны согласно методическим руководствам и нор-

14. Д. И. Рощупкин, Е. Е. Фесенко и В. И. Новоселов,

мативным документам, правилам лабораторной

Биофизика органов (Наука, М., 2000).

практики проведения доклинических исследова-

15. В. В. Воробьева и П. Д. Шабанов, Биофизика 64

ний в Российской Федерации (ГОСТ Р 53434-

(2), 337 (2019).

2009) и Директиве 2010/63/EU Европейского

16. В. В. Воробьева и П. Д. Шабанов, Рос. физиол.

парламента и Совета Европейского Союза от

журн. им. И. М. Сеченова 95 (8), 857 (2009).

A Change in the Content of Endogenous Energy Substrates in Rabbit Myocardium

Mitochondria Depending upon Frequency and Duration of Vibration

V.V. Vorobieva and P.D. Shabanov

Institute of Experimental Medicine, ul. Akademika Pavlova 12, St. Petersburg, 197376 Russia

A change in the content of energy substrates in myocardial mitochondria depending upon the vibration fre-

quency and the duration of the total vertical vibration exposure was studied polarographically using a closed

galvanic oxygen sensor (the Clark electrode) by comparing the endogenous respiration rates over a period

when the homogenate was stored under aerobic conditions. After exposure to the longest vibration (56 ses-

sions) with amplitude of 0.5 mm and frequency of 44 Hz, the rate of endogenous respiration after 40-min in-

cubation of myocardial tissue homogenate was 1.4 times slower (p < 0.05) than the control. It indicated the

development of bottlenecking in the oxidation and utilization pathways of succinic acid, a decrease in the

availability of endogenous substrates to the respiratory chain of cardiomyocytes mitochondria and, indirectly

mitochondrial-reticular network disruption and dysfunction.

Keywords: vibration, mitochondria, myocardial energy metabolism, succinic acid, mitochondrial-reticular net-

work

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021