БИОФИЗИКА, 2021, том 66, № 4, с. 774-783

БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ

УДК 577.35 57.043 579

ФЕТАЛЬНАЯ СЫВОРОТКА В СОЧЕТАНИИ

С 5% ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДА ЭФФЕКТИВНО ЗАЩИЩАЕТ

МИКРОБИОТУ КИШЕЧНИКА ЧЕЛОВЕКА В ПРОЦЕССЕ

КРИОКОНСЕРВАЦИИ В ЖИДКОМ АЗОТЕ

А.В. Загайнова**, В.В. Макаров**, С.М. Юдин**, Е.Е Фесенко (мл)*

*Институт биофизики клетки РАН - обособленное подразделение ФИЦ «Пущинский научный центр биологических

исследований РАН», 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3

**Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью МЗ РФ,

119435, Москва, Погодинская ул., 10/1

E-mail: zalomova.91@mail.ru

Поступила в редакцию 10.03.2021 г.

После доработки 10.03.2021 г.

Принята к публикации 18.03.2021 г.

В связи с развитием медицинских технологий все большую актуальность приобретает разработка

методов длительной консервации цельной микробиоты кишечника человека, которые бы обеспе-

чивали высокую сохранность, как в отношении видового состава, так и в отношении количествен-

ного паритета составляющих микробиоценоз бактерий. Исследовано влияние 5- и 10%-х растворов

диметилсульфоксида, глицерина, этиленгликоля, желатина, полиэтиленгликоля, поливинилового

спирта, фетальной сыворотки коров, а также фетальной сыворотки в комбинации с 5% диметил-

сульфоксида на выживаемость кишечной микробиоты человека в процессе криоконсервации в

жидком азоте (минус 196°С, хранение до 7 суток). Наиболее высокие показатели выживаемости

бактерий при криоконсервации достигнуты при использовании криозащитной смеси на основе фе-

тальной сыворотки коров и 5%-го диметилсульфоксида: от 81 до 87% жизнеспособных клеток по

данным флуоресцентного теста LIVE/DEAD при показателе интактной микробиоты, равном 88-

90%. Эффективность выбранного криозащитного состава подтверждена также методом микробио-

логического культивирования в экспериментах по криоконсервации отдельных штаммов - харак-

терных представителей микробиоты кишечника человека.

Ключевые слова: криоконсервация, флуоресцентный анализ, фетальная сыворотка коров, культивиро-

вание бактерий.

DOI: 10.31857/S0006302921040177

шечной микрофлоры, не всегда дает быстрые и

Микрофлора, населяющая желудочно-кишеч-

позитивные результаты. Одним из направлений

ный тракт человека, является ценным биологиче-

ским ресурсом, так как играет важную роль в

современной медицины является интродукция

жизнеобеспечении и поддержании здоровья че-

кишечных микроорганизмов от здорового донора

ловека. Нарушение баланса видового состава ки-

к реципиенту для восстановления основных

шечной микрофлоры, наблюдаемое в последние

функций микробиоты

[4-6]. Рассматривается

годы в результате неконтролируемого приема ан-

также возможность аутологичной интродукции

тибиотиков, искусственного пищевого рациона и

собственных микроорганизмов, сохраненных в

общего ухудшения экологической обстановки,

период жизни человека до развития заболевания

приводит к возникновению таких заболеваний,

(например, в молодом возрасте) [7, 8]. В этой свя-

как диабет, ожирение, гипертония, психические

зи все большую актуальность приобретает разви-

расстройства [1-3]. Лечение традиционными ме-

тие технологий длительной консервации микро-

тодами патологий, связанных с дисбалансом ки-

биоты кишечника человека, которые бы обеспе-

чивали высокую сохранность микробиоты как в

Сокращения: ДМСО - диметилсульфоксид, ФСК - фе- отношении видового состава, так и в отношении

тальная сыворотка коров, ПЭГ - полиэтиленгликоль,

количественного паритета составляющих микро-

ПВС - поливиниловый спирт, КОЕ - колониеобразую-

щие единицы.

биоценоз бактерий [9, 10].

774

ФЕТАЛЬНАЯ СЫВОРОТКА В СОЧЕТАНИИ С 5% ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДА

775

По данным современных молекулярно-гене-

точной культуры гепатоцитов в зависимости от

тических исследований в состав микробиоты

увеличения ее содержания в среде вплоть до 90%.

кишечника человека входят от 500 до 1000 различ-

Ряд других экспериментов показывает, что фе-

ных видов бактерий [11]. Основными ее пред-

тальная сыворотка коров не всегда эффективно

ставителями являются анаэробные грамполо-

защищает клетки эукариот после криоконсерва-

жительные бифидобактерии, лактобактерии и

ции независимо от ее концентрации [31, 32]. Оче-

энтерококки, а также грамотрицательные фа-

видно, что это связано с особенностями проница-

культативные анаэробные бактероиды и кишеч-

емости мембран различных типов клеток. Мы не

ная палочка. Основным методом длительной

нашли работ, в которых были бы исследованы

консервации микробиоты является криоконсер-

криозащитные эффекты ФСК в отношении кон-

вация - низкотемпературное хранение при тем-

сервации отдельных культур бактерий или мик-

пературе от -80°С и ниже, до температуры жид-

робных сообществ.

кого азота (-196°С). Для криоконсервации суще-

Целью нашего исследования была оценка эф-

ственное значение имеют внутривидовые

фективности сохранения микробиоты кишечни-

характеристики, присущие разным бактериям,

ка человека и отдельных ее представителей, фа-

прежде всего, структурные и функциональные

культативных анаэробов: Escherichia coli (грамот-

особенности клеточных мембран [12, 13]. Так,

рицательные бактерии), Enterococcus faecalis и

считается, что энтерококки и представители ки-

Enterococcus faecium (грамположительные бакте-

шечной палочки, являясь факультативными

рии) в процессе криоконсервации в жидком азоте

анаэробами, имеют повышенную устойчивость к

под защитой ФСК, широкого спектра известных

низкотемпературным воздействиям [14]. Методы

криопротекторов, а также сочетания данных

низкотемпературной консервации бактерий раз-

агентов.

работаны и успешно используются для сохране-

ния отдельных монокультур. Проблема долго-

срочной низкотемпературной консервации це-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

лых микробиоценозов пока не решена. Анализ

Объект исследования. Микробиота кишечника

относительно немногочисленных исследований

человека в виде бактериальной суспензии, полу-

по криоконсервации микробиоты представлен в

ченной от взрослых доноров, а также готовые

нашей обзорной статье [15]. Для сохранения мик-

коллекционные культуры кишечных микроорга-

робиоты в основном пытаются использовать те

низмов: семейства Enterobacteriaceae - Escherichia

же протоколы консервации, которые использу-

coli (лактозопозитивный и лактозонегативный

ются для отдельных монокультур. В качестве

штаммы), бактерии семейства Enterococcaceae

криопротекторов чаще всего фигурируют диме-

(E. faecium, E. faecalis). Культуры кишечных мик-

тилсульфоксид (ДМСО) и глицерин в концентра-

роорганизмов были взяты из индивидуальных

циях от 10 до 15% [14, 16-19], реже используются

коллекций Центра стратегического планирова-

дисахариды [20]. Однако в наших экспериментах

ния и управления медико-биологическими рис-

было показано, что глицерин в концентрации 10-

ками здоровью Минздрава России.

15% и ДМСО оказывают токсическое действие на

клетки бактерий и что такие концентрации явля-

Выделение бактериальных клеток. Бактериаль-

ются избыточными для целей криоконсервации

ные суспензии готовили из расчета 0.1 г фекаль-

[21]. Достаточно использовать их в 5%-й концен-

ной массы в 0.9 мл стерильного изотонического

трации. При этом можно прогнозировать, что ис-

раствора 0.9% NaCl, тщательно перемешивали до

пользование сред на основе единственного крио-

образования гомогенной консистенции. Для от-

протектора, будь то ДСМО или глицерин, не бу-

деления бактерий от посторонних примесей ис-

дет обеспечивать равно эффективную защиту для

пользовали центрифугирование: сначала в 0.9%

всех бактерий, составляющих сообщество. В этой

NaCl при 1200 об/мин в течение 5 мин, затем дву-

связи актуален поиск многокомпонентных сред,

кратное центрифугирование в 0.9% NaCl при

обеспечивающих синергические защитные эф-

10000 об/мин 10 мин. Далее работали с образовав-

фекты в процессе криоконсервации.

шимся осадком, который ресуспендировали в

1 мл изотонического раствора. После этого под-

Потенциальным компонентом для такой сре-

считывали общее количество бактериальных кле-

ды является фетальная сыворотка коров (ФСК).

ток в суспензии по методу Виноградского-Брида

Согласно литературным данным, фетальная сы-

[21, 33]. В результате определения числа клеток в

воротка часто используется в составе сред замо-

1 мл суспензии вычисляли объем суспензии бак-

раживания эукариотических клеток [22-27]. Как

терий, который будет давать конечную концен-

правило, ее концентрация в криозащитной смеси

трацию микробов до величины (1-2) · 10⁸ кле-

составляет 10-30%. В отдельных исследованиях

ток/мл криозащитной среды во всех образцах.

успешно применяли ФСК в концентрации 90-

100% [28, 29]. В работе [30] описано усиление

Монокультуры кишечных бактерий разных

криозащитных свойств ФСК в отношении кле-

видов/штаммов доводили до рабочей концентра-

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

776

ЗАЛОМОВА и др.

ции 10⁷клеток/мл криозащитной среды с помо-

Опытные бактериальные суспензии после

размораживания

центрифугировали

при

щью готовых образцов стандарта мутности.

10000 об/мин в течение 10 мин для удаления

Криоконсервация бактериальных суспензий. Замо-

криопротектора. После центрифугирования су-

раживание суспензий кишечных бактерий (чистые

пернатант сливали, а осадок ресуспендировали

культуры и микробиота) проводили в стандартных

в 1 мл 0.9% NaCl. Далее образцы переносили на

криопробирках объемом 1 мл (CRYO S, Greiner,

96-луночные планшеты (Медполимер, Россия) с

Германия). Бактериальные суспензии в объеме

добавлением в каждую лунку по 100 мкл готовой

0.5 мл переносили в криопробирки, содержащие

смеси флуоресцентных красителей LIVE/DEAD

0.5 мл криозащитной среды, 0.9% NaCl (контроль)

BacLight. Спустя 15 мин измеряли интенсивность

или ФСК. Концентрация микроорганизмов в каж-

флуоресценции на планшетном фотометре

дой криопробирке составляла (1-2)·10⁸ клеток/мл.

(FilterMax F5, США).

Затем образцы замораживали путем прямого погру-

Метод микробиологического культивирования.

жения криопробирок в жидкий азот со средней ско-

Чистые коллекционные культуры кишечных бак-

ростью 90 ± 1.5°С/мин. Время между добавлением

терий E. coli (лактозопозитивный и лактозонега-

бактериальных суспензий в пробирки с протектора-

тивный штаммы) и видов семейства Enterococca-

ми и их погружением в жидкий азот не превышало

ceae (E. faecium, E. faecalis) культивировали на

5 мин. Длительность хранения образцов в жидком

плотных

дифференциально-диагностических

азоте составляла от двух до семи суток. По истече-

средах. Для E. coli использовали среду Эндо агар

нии этого времени образцы размораживали на водя-

(ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия) и/или хромоген-

ной бане при 37°С. После размораживания клетки

ную среду HiChrom (ГНЦ ПМБ, Оболенск, Рос-

бактерий осаждали путем центрифугирования при

сия). Энтерококки культивировали на хромоген-

10000 об/мин в течение 10 мин, затем их ресуспен-

ном энтерококковом агаре (ГНЦ ПМБ, Обо-

дировали в 0.9% NaCl для определения жизнеспо-

ленск, Россия).

собности.

Культивирование кишечных бактерий прово-

Криопротекторы. В экспериментах использо-

дили на чашках Петри диаметром 10 см (Thermo

вали 5%-е и 10%-е растворы ДМСО (Sigma, Al-

Scientific, США) при постоянной температуре

drich, США), глицерина (Sigma Aldrich, США),

(37°С) в сухо-жаровом шкафу Heratherm IMC 18

этиленгликоля (PanReac AppliСhem, Германия),

(Thermo Scientific, США) в течение 24 ч до обра-

желатина (PanReac AppliChem, Германия), поли-

зования колоний на поверхности сред. Жизне-

этиленгликоля ПЭГ-600 Да (Sigma Aldrich,

способность бактерий оценивали путем подсчета

США), поливинилового спирта (ПВС) с молеку-

колониеобразующих единиц (КОЕ) в серии по-

лярной массой 72 кДа (Sigma Aldrich, США); бы-

следовательных разведениях исходной суспензии

чий сывороточный альбумин (Biosera, Франция)

и фетальную сыворотку коров (ПанЭКО, Рос-

(10⁷клеток/мл). Указанная концентрация явля-

ется оптимальной для высева бактерий. На чашки

сия). Криозащитные среды готовили на 0.9% Na-

Cl или ФСК в весовых долях.

Петри сеяли по 0.1 мл суспензии в разведениях

Оценка жизнеспособности кишечных бактерий

10^-2, 10^-4, 10^-6. Для каждого разведения исполь-

после криоконсервации. Метод флуоресцентного

зовали по три чашки Петри (n = 3). Каждый экс-

анализа. Сравнительный анализ жизнеспособно-

перимент повторяли трижды.

сти цельной микробиоты кишечника человека до

Статистическая обработка результатов. Пока-

и после криоконсервации проводили флуорес-

затели жизнеспособности бактериальных клеток

центным методом с помощью тест-набора

выражали как среднее значение ± стандартное

LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit 7012

отклонение независимых n повторов в каждом

(Molecular Probe, США). Жизнеспособность оце-

эксперименте. Статистическую значимость раз-

нивали по соотношению интенсивности флуо-

личий между группами проверяли с помощью не-

ресцентных красителей SITO9 и пропидиум йо-

параметрического критерия Манна-Уитни. Раз-

дида (PI), дающих зеленый (живые клетки) и

личия считались достоверными при P ≤ 0.05. Для

красный (мертвые клетки) спектры при длине

построения диаграмм использовали программ-

волны 480-500 и 500-635 нм соответственно.

ное обеспечение Sigma Plot 14.0 (Systat Software,

Перед проведением флуоресцентного анализа

Inc, Канада).

снимали контрольные показатели интенсивно-

сти флуоресценции при разных разведениях бак-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

териальных суспензий по соотношению живых и

мертвых бактерий (0:100, 10:90, 50:50, 90:10, 100:0)

В таблице приведены результаты флуорес-

для построения калибровочной кривой. Суспен-

центного анализа жизнеспособности микробио-

зию мертвых клеток получали с помощью 96%-го

ты человека после криоконсервации под защитой

этилового спирта (1 ч экспозиции при комнатной

различных протекторов при их сравнении с

температуре).

ДМСО, акцент на исследовании которого был

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

ФЕТАЛЬНАЯ СЫВОРОТКА В СОЧЕТАНИИ С 5% ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДА

777

сделан в нашей предыдущей публикации [21]. В

Жизнеспособность микробиоты кишечника человека

число исследуемых криопротекторов вошли так-

после криоконсервации в жидком азоте с проникаю-

щими и непроникающими протекторами

же полимеры ПВС и ПЭГ, положительный эф-

фект которых в процессе консервации микробио-

Процент

ты описан в работе [19].

Криозащитная среда

жизнеспособных

Как видно из таблицы, максимальную жизне-

клеток

способность бактерий на уровне 86.0 ± 4.0 обес-

Интактная микробиота

89.0 ±1.0

печивал 5%-й раствор ДМСО. Близкие результа-

ты по выживаемости кишечных микроорганиз-

0.9% NaCl (отрицательный

мов достигались при использовании

5%-х

50.0 ± 1.0 [21]

контроль)

растворов глицерина, этиленгликоля и ПВС - в

среднем 79-82% живых клеток. Желатин при та-

ДМСО, 5%

86.0 ± 4.0 [21]

кой же концентрации оказывал менее выражен-

ный криозащитный эффект - 62.0 ± 2.0% жизне-

Глицерин, 5%

81.0 ± 2.0

способных клеток. ПЭГ обеспечивал низкий уро-

Этиленгликоль, 5%

82.0 ± 5.0

вень сохранности клеток - менее 40%. В работе

[19] для 10%-го ПЭГ и 10%-го ПЭГ с 1%-м ПВС

Полиэтиленгликоль, 5%

37.0 ± 4.0

был показан сильный криозащитный эффект в

отношении отдельных видов кишечных бакте-

рий, однако в наших экспериментах в отношении

Поливиниловый спирт, 5%

79.0 ± 2.0

целого микробиоценоза он не подтвердился.

Важно отметить, что при переходе от 5%-й кон-

Желатин, 5%

62.0 ± 2.0

центрации к 10%-й снижение сохранности ки-

шечных бактерий показано для всех криопротек-

ДМСО, 10%

76.0 ± 5.0 [21]

торов кроме желатина. Снижение показателей

жизнеспособности, как мы полагаем, объясняют-

Глицерин, 10%

61.0 ± 3.0

ся токсичностью этих протекторов.

Из приведенных выше результатов следует,

Этиленгликоль, 10%

78.0 ± 3.0

что для низкотемпературной консервации мик-

робиоты кишечника лучше всего подходит

Полиэтиленгликоль, 10%

35.0 ± 2.0

ДМСО в низкой концентрации - 5%. Данная

концентрация является оптимальный по крите-

Поливиниловый спирт, 10%

74.0 ± 4.0

рию соотношения криозащита/токсическое дей-

ствие в однокомпонентной криозащитной среде,

Желатин, 10%

77.0 ± 4.0

однако использование нескольких компонентов

потенциально способно улучшить данный крите-

Примечание. Тест LIVE/DEAD BacLight. Условия криокон-

рий, а также повысить надежность консервации в

сервации: температура -196°С, срок хранения - 72 ч. Раство-

ры протекторов приготовлены на основе 0.9% NaCl (n = 20).

отношении бактериального микробиоценоза. В

этой связи в следующем эксперименте был при-

менен подход, основанный на совместном

использовании ДМСО с фетальной сывороткой

ДМСО. В чистой ФСК без добавления ДМСО

коров. Такой прием часто применяется при низ-

уровень жизнеспособных бактериальных клеток

котемпературном замораживании криочувстви-

также был высок и составил 82.0 ± 4.0%.

тельных эукариотических клеток.

Фетальная сыворотка может выполнять роль

Результаты анализа жизнеспособности микро-

криопротектора для кишечных микроорганизмов

биоты (LIVE/DEAD тест) в криозащитных сре-

за счет биологических активных веществ, различ-

дах, содержавших 5% ДМСО, 10% ДМСО, 100%

ных ростовых факторов и цитокинов, влияющих

ФСК, 95% ФСК + 5% ДМСО и 90% ФСК + 10%

на свойства и сохранность клеточных мембран, а

ДМСО, представлены на рис. 1. Было показано,

также на процессы восстановления после крио-

что микробиота кишечника человека хорошо со-

консервации. В частности, альбумин - основной

хранялась под защитой 5%-го ДМСО, приготов-

компонент сыворотки - способствует восстанов-

ленного как на основе 0.9% NaCl, так и на основе

лению барьерных свойств плазматической мем-

ФСК, после низкотемпературной консервации в

браны и усиливает сигнальные пути бактериаль-

жидком азоте - 86.0 ± 2.0% и 84.0 ± 3.0% живых

ных клеток во время роста. Для того чтобы оце-

клеток соответственно. 10%-е модификации сред

нить его вклад в криозащиту в составе ФСК

показали более низкие результаты, что наводит

(содержание альбумина в ФСК составляет 40-

на предположение о том, что сыворотка не спо-

50 мг/мл), был проведен эксперимент по крио-

собна нивелировать токсическое действие

консервации микробиоты в средах с различным

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

778

ЗАЛОМОВА и др.

использованием альбумина. Другие компоненты

ФСК также необходимы для того, чтобы в пол-

ном объеме обеспечивать сохранность и восста-

новление клеток микроорганизмов желудочно-

кишечного тракта.

Полученные нами результаты сохранности

микробиоты показали, что добавление 5% ДМСО

в ФСК дает незначительное увеличение за-

щитных свойств среды замораживания, по срав-

нению с чистой сывороткой (рис. 1). Однако учи-

тывая большое разнообразие микроорганизмов

кишечной микрофлоры, обоснованно предполо-

жить, что одни фракции бактерий будут лучше

сохраняться под защитой ФСК, а другие - под за-

щитой ДМСО, что повысит надежность криокон-

сервации микробного сообщества.

Для подтверждения этого предположения бы-

ли проведены эксперименты по криоконсерва-

Рис. 1. Жизнеспособность (метод LIVE/DEAD Ba-

ции нескольких наиболее распространенных ви-

cLight) смеси кишечных микроорганизмов после

дов/штаммов микрофлоры кишечника человека

криоконсервации в жидком азоте (температура

-196°С, срок хранения 72 ч) в 5- и 10%-х растворах

(кишечная палочка, энтерококки), различаю-

ДМСО, приготовленных на основе 0.9% NaCl и ФСК

щихся между собой по строению и свойствам

(n = 25). * - Достоверность различий жизнеспособно-

плазматических мембран (грамотрицательные и

сти микробиоты кишечника при использовании сме-

грамположительные бактерии). В этих экспери-

сей ДМСО/0.9% NaCl и ДМСО/ФСК с различной

ментах жизнеспособность клеток до и после

концентрацией ДМСО (Р < 0.05), согласно критерию

оценки достоверности результатов Манна-Уитни.

криоконсервации оценивали по их способности

образовывать колонии на плотных питательных

дифференциально-диагностических средах мето-

содержанием альбумина. В результате экспери-

дом посева. В роли криозащитных агентов ис-

мента показано, что чистый альбумин, взятый в

пользовали чистую ФСК, а также ФСК в сочета-

концентрациях 10, 30 и 50 мг/мл, менее эффек-

нии с 5% ДМСО и как отрицательный контроль -

тивно по сравнению с ФСК защищает микробио-

0.9% NaCl.

ту кишечника, снижая общее количество живых

В ходе культивирования в течение 24 ч при

клеток в процессе криоконсервации до 61-73%

температуре 37°C на питательных средах Эндо

выживших бактерий (рис. 2).

агар и HiChrom лактозопозитивный штамм E. coli

Таким образом, показано, что криозащитное

продемонстрировал высокий рост колоний (на

действие ФСК нельзя в полной мере заместить

уровне (12-14)·10⁵ КОЕ/мл) после криоконсерва-

Рис. 2. Жизнеспособность (метод LIVE/DEAD BacLight) микробиоты кишечника человека после криоконсервации

(температура -196°С, срок хранения 72 ч) в 0.9% NaCl, ФСК и в средах с различным содержанием альбумина, приго-

товленного на основе 0.9% NaCl (n = 6).

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

ФЕТАЛЬНАЯ СЫВОРОТКА В СОЧЕТАНИИ С 5% ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДА

779

Рис. 3. Выживаемость лактозопозитивного штамма Escherihia coli в результате культивирования на средах Эндо агар (а)

и HiChrom (б) после криоконсервации (температура -196°С, срок хранения 96 ч) в ФСК и в ее сочетании с 5% ДМСО.

По стандарту мутности титр E. coli Lac⁺ до криоконсервации составил 107 кл/мл.

ции в жидком азоте под защитой ФСК и ФСК с

штамма E. coli является наличие β-галактозидаз-

добавлением 5% ДМСО по отношению к контро-

ной и β-глюкоронидазной ферментативной ак-

тивности, обусловливающей красно-малиновый

лю ((2-5) · 10⁵ КОЕ/мл) (рис. 3).

цвет колоний с металлическим блеском в среде

В данном эксперименте результаты бактери-

Эндо агар и синий цвет колоний в среде HiChrom

ального роста оказались близкими в средах ФСК

соответственно. Результаты культивирования по-

и ФСК с 5% ДМСО для E. coli Lac⁺. Из рис. 3 сле-

сле криоконсервации демонстрировали наличие

дует, что использование двухкомпонентной за-

данных цветовых показателей для позитивного

щитной среды для данного штамма не предоста-

штамма, что свидетельствовало о сохранности

вило преимуществ по сравнению с чистой ФСК.

этих систем.

Помимо способности к росту колоний после

На рис. 4 продемонстрированы результаты

криоконсервации важной оценкой также счита-

культивирования лактозонегативного штамма

ется сохранение штаммами ферментативной ак-

E. coli после криоконсервации. Этот штамм также

тивности. Особенностью лактозопозитивного

культивировали на чашках Петри в течение 24 ч при

Рис. 4. Выживаемость лактозонегативного штамма Escherihia coli в результате культивирования на средах Эндо агар (а)

и HiChrom (б) после криоконсервации (температура -196°С, срок хранения 96 ч) в ФСК и в ее сочетании с 5% ДМСО.

По стандарту мутности титр E. coli Lac^- до криоконсервации составил 107 кл/мл.

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

780

ЗАЛОМОВА и др.

Рис.

5. Выживаемость кишечных бактерий Enterococcus faecium (а) и Enterococcus faecalis (б) в результате

культивирования на энтерококковом агаре после криоконсервации (температура -196°С, срок хранения 96 ч) в ФСК

и в ее сочетании с 5% ДМСО. По стандарту мутности титр E. faecium и E. faecalis до криоконсервации составил

107 кл/мл.

температуре 37°C на средах Эндо агар и HiChrom.

На гистограмме видно, что ФСК и ФСК в соче-

На гистограмме видно, что интенсивный рост кле-

тании с 5% ДМСО демонстрировали высокий рост

ток штамма обнаруживался под защитой ФСК с до-

колоний E. faecium и E. faecalis до 700 · 10⁵ КОЕ/мл

бавлением 5% ДМСО - 240 · 10⁵ КОЕ/мл на Эндо

по отношению к контролю ((92-100) · 10⁵ КОЕ/мл).

агаре и 218 · 10⁵ КОЕ/мл на HiChrom. В 100%-й сы-

Для обеих культур энтерококков не было выявлено

воротке после криоконсервации в среднем наблю-

статистически достоверных различий в результатах

далось в четыре раза меньше восстановленных

культивирования при сравнении сред ФСК и ФСК

в комбинации с ДМСО (рис. 5). В целом представи-

колоний E. coli Lac^-. В контрольных образцах

тели семейства Enterococcaceae сохранялись при-

значение КОЕ не превышало 3 · 10⁵ КОЕ/мл. В

мерно на том же уровне, что и Enterobacteriaceae при

этом эксперименте двухкомпонентная криоза-

криоконсервации в жидком азоте.

щитная смесь продемонстрировала явное пре-

Основной целью наших экспериментов было

имущество по сравнению с чистой ФСК, что под-

исследование сохранности микробиоты кишеч-

тверждает правильность выбранного подхода к

ника человека как целой общности. На сего-

криоконсервации микробиоты. Ввиду того, что в

дняшний день относительно мало исследований

эксперименте не рассматривали чистый 5%-й

посвящено этой проблеме, несмотря на ее все

ДМСО, нельзя оценить, присутствует ли синер-

возрастающую актуальность. Литературные дан-

гический эффект при использовании ФСК и

ные показывают, что для консервации бактерий

ДМСО. Однако подтвердилось предположение,

используется широкий спектр различных крио-

что некоторые штаммы бактерий, в частности

протекторов, исчерпывающий список которых

E. coli Lac^-, лучше сохраняются под защитой

можно найти в обзоре [14]. При этом самыми рас-

ДМСО, нежели ФСК. Можно предположить, что

пространенными протоколами криоконсервации

для ряда других бактерий сообщества будет на-

бактерий являются протоколы, основанные на

блюдаться обратная картина.

использовании глицерина и ДМСО. Для консер-

вации цельной микробиоты кишечника (бакте-

На рис. 5 приведены результаты выживаемо-

риальные суспензии, фекальные инокуляты,

сти двух культур кишечных энтерококков после

цельные фекалии) преимущественно пытаются

криоконсервации в жидком азоте. Штаммы вы-

адаптировать те же самые протоколы, что и для

ращивали на селективной среде - энтерококко-

монокультур микроорганизмов с использовани-

вом агаре. Данная среда позволяет идентифици-

ем композиций 10-20%-х растворов глицерина

ровать E. faecium (в норме клетки имеют розовый

(не менее половины всех исследований), реже

цвет) и E. faecalis (в норме клетки имеют лиловый

ДМСО (около 20% исследований), еще реже тре-

цвет) за счет различий на биохимическом уровне.

галозы, инулина, ПЭГ, сахарозы, желирующих

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

ФЕТАЛЬНАЯ СЫВОРОТКА В СОЧЕТАНИИ С 5% ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДА

781

агентов [15, 17, 35]. Для криоконсервации фекаль-

с погружением образца в жидкий азот (-196°С) с

ных трансплантатов почти исключительно ис-

последующим переносом в низкотемпературный

пользовался 10%-й глицерин (10 из 11 работ,

морозильник (-80°С) (порядка 50% всех исследо-

опубликованных с 2012 г.), а замораживание осу-

ваний) и медленный способ замораживания с по-

ществляли при -80°С [15].

мещением образца сразу на -80°С [15]. Мы ис-

пользовали первый способ (со скоростью охла-

Глицерин можно рассматривать в качестве «зо-

ждения 90°С/мин), поскольку с нашей точки

лотого стандарта» консервации цельной микро-

зрения он обеспечивает большую гибкость при

биоты, однако его преимущества с нашей точки

выборе температуры дальнейшего хранения:

зрения не являются неоспоримыми. Так, в недав-

-196°С при необходимости длительного хране-

нем исследовании [19] показано, что 15-25%-е

ния, например в криобанке, или перенос на

растворы глицерина значительно снижали выжи-

-80°С. Хранение в низкотемпературном моро-

ваемость микроорганизмов. По нашим экспери-

зильнике обычно более удобно для последующего

ментальным данным по показателю выживаемо-

медицинского применения.

сти микробиоты после консервации глицерин

продемонстрировал высокую эффективность на

Какие недостатки можно выделить в предлага-

уровне 80%, однако уступил в этом отношении

емом методе консервации микробиоты? Феталь-

ДМСО. Кроме того, отмечалось значительное

ная сыворотка коров является достаточно дорого-

снижение выживаемости микробиоты при повы-

стоящим биоматериалом. В этой связи использо-

шении концентрации с 5% до 10%.

вание

100%-й сыворотки может снизить

экономическую эффективность предлагаемого

В работе [19], основываясь на идее о необходи-

технического решения. Поэтому актуально рас-

мости подавления в первую очередь роста кри-

смотреть использование криозащитных сред с

сталлов льда, вместо глицерина авторы предло-

уменьшенным содержанием сыворотки в целях

жили использовать полимерные непроникающие

экономии для криоконсервации микробиоты ки-

молекулы ПЭГ и ПВС по отдельности или в ком-

шечника человека. В дальнейшем мы планируем

бинации. При этом полимерные молекулы были

оценить, насколько эффективность криоконсер-

призваны оказывать эффекты, аналогичные дей-

вации зависит от содержания сыворотки в среде

ствию антифризных белков, вырабатываемых не-

замораживания.

которыми экстремофильными бактериями [36].

Мы изучили сохранность кишечной микробиоты

Сроки хранения материала в жидком азоте в

под защитой непроникающих протекторов ПВС

проведенных нами экспериментах находились в

и ПЭГ, которые упоминаются в работе [19]. Если

интервале от двух до семи суток. Поскольку ко-

в отношении ПВС был показан заметный, хотя и

нечной целью исследования является решение

уступающий показателям глицерина и ДМСО,

проблемы долговременной консервации микро-

криозащитный эффект, то ПЭГ, наоборот, про-

биоты, то для окончательного подтверждения по-

демонстрировал высокую токсичность по отно-

лученных данных необходим анализ выживаемо-

шению к клеткам бактерий.

сти бактериальных сообществ после длительных

сроков хранения. В связи с этим в рамках работы

Лидерами по эффективности криозащиты в

были сделаны закладки кишечной микробиоты

нашем исследовании выступили ДМСО и ФСК.

на долговременное хранение. Результаты данных

При этом их совместное использование не ухуд-

экспериментов будут отражены в последующих

шало показатели выживаемости микробиоты, со-

публикациях.

ставившие 80-90%, что сопоставимо с данными

анализа незамороженной микробиоты (≈90%).

Очевидно, что криозащитный состав, основан-

ВЫВОДЫ

ный на монокриопротекторе, не будет равноэф-

фективно защищать всех представителей

Представлена концепция криоконсервации

микробного сообщества. С этой точки зрения

микробиоты кишечника человека, используемой

многокомпонентные составы будут иметь пре-

для биомедицинских приложений, основанная

имущество в надежности криоконсервации. На-

на применении многокомпонентной криозащит-

ши экспериментальные данные по консервации

ной среды, призванной повысить надежность

консервации различных представителей микроб-

ряда выбранных представителей микробиоты

ного сообщества. Показана высокая эффектив-

подтверждают правильность такого подхода.

ность криозащиты двухкомпонентного состава,

Основными режимами криоконсервации, ис-

включающего фетальную сыворотку коров и 5%

пользуемыми для хранения микробных сооб-

ДМСО, при криоконсервации бактериальных

ществ, являются быстрый способ замораживания

суспензий донорской микробиоты по протоколу

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

782

ЗАЛОМОВА и др.

быстрого замораживания в жидком азоте при

18. A. Criste, M. Giuburuncă, O. Negrea, et al., Animal

-196°С.

Sci. and Biotechnol. 47 (2), 73 (2014).

19. M. Hasan, A. E. R. Fayter, and M. I. Gibson, Biomac-

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

romolecules 19 (8), 3371 (2018). DOI: 10.1021/acs.bio-

mac.8b00660.

Исследование выполнено при финансовой

поддержке Российского фонда фундаментальных

20. M. Abadias, N. Teixido, J. Usall, et al., J. Food Protec-

исследований в рамках научного проекта № 19-

tion 64 (6), 856 (2001).

34-90187, а также договора №0373100122118000037.

21. Л. В. Заломова, Д. А. Решетников, С. В. Уграицкая

и др., Биофизика 65 (5), 1 (2020).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

22. 22. E. Müller-Schweinitzer and P. Ellis, Naunyn

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

Schmiedebergs Arch Pharmacol. 345 (5), 594 (1992).

интересов.

DOI: 10.1007/BF00168954

23. S.-J. Ha, B.-G. Kim, Y.-A. Lee, et al., PLoS One 11

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

(8),

e0161372

(2016).

DOI:

10.1371/journal.

pone.0161372

Настоящая работа не содержит описания ис-

следований с использованием людей и животных

24. X. Fu, B. Xu,J. Jiang, et al., J. Clin. Proteomics 17, 15

в качестве объектов.

(2020). DOI: 10.1186/s12014-020-09279-6

25. D. Pogozhykh, V. Prokopyuk, O. Pogozhykh, et al.,

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

PLoS One

(10), e0139834

(2015). DOI:

10.1371/journal.pone.0139834

1. A. L. Kau, P. P. Ahern, W. N Griffin, et al., Nature 474,

327 (2011).

26. Y. Yuan, Y. Yang, Y. Tian, et al., Sci. Rep. 6, 34476

2. A. T. Vieira, M. M. Teixeira, and F. S. Martins, Front.

(2016). DOI: 10.1038/srep34476

Immunol. 4, 445 (2013).

27. M. Verdanova, R. Pytlik, and M. Hubalek Kalbacova,

3. L. E. Botero, L. Delgado-Serrano, M. L. Hernadez,

Biopreservation and Biobanking 12, 2 (2014). DOI:

et al., Acta Biol. Colomb. 21 (1), 5 (2016). DOI:

10.1089/bio.2013.0078

10.15446/abc.v21n1.49761

4. E. B. M. Daliri, C. N. Tango, B. H. Lee, and D. H. Oh,

28. R. Fujisawa, M. Mizuno, H. Katano, et al., BMC Mus-

Int. J. Med. Microbiol. 308, 487 (2018).

culoskelet.

Disord.

20,

316

(2019).

DOI:

10.1186/s12891-019-2700-3

5. D. P. Bojanova and S. R. Bordenstein, PLoS Biol. 14,

e1002503 (2016).

29. K. M. Preininger, M. Singh, and C. Xu, Adv. Exp. Med.

6. E. M. Terveer, Y. H. van Beurden, A. Goorhuis, et al.,

Biol. 951, 123 (2016). DOI: 10.1007/978-3-319-45457-

Microbiology and Infection 23, 924 (2017).

3_10

7. J. Suez, N. Zmora, G. Zilberman-Schapira, U. Mor,

30. D. J. Stevenson, C. Morgan, E. Goldie, et al., Cryobi-

et al., Cell 174, 1406 (2018).

ology

(2),

(2004). DOI:

10.1016/j.cryobi-

8. E. I. Ermolenko, A. N. Suvorov, V. I. Simanenkov,

ol.2004.05.006

et al., Patent No RUS 2460778 (2010).

31. A. Mitchell, K. A. Rivas, R. Smith, and A. E. Watts,

9. A. Barzegari, N. Saeedi, and A. A. Saei, Future Micro-

Stem Cell Res. Therapy 6 (1), 231 (2015). DOI:

biol. 9 (5), 639 (2014).

10.1186/s13287-015-0230-y

10. O. Plakash, Y. Nimonkar, and Y. S. Shouche, FEMS

Microbiol. Lett. 339, 1 (2013).

32. C. H. Escobar and O. Chaparro, STEM Cells Translat.

11. A. V. Chaplin, A. G. Brzhozovsky, T. V. Parfenova,

Med. 5 (358), (2016). DOI: 10.5966/sctm.2015-0094

et al., Actual. Microbiol. 70, 56 (2015).

33. A. И. Нетрусов, М. А. Егорова, Л. М. Захарчук

12. H. T. Meryman, Transfusion 47, 935 (2007).

и др., Практикум по микробиологии (Академия, М.,

13. D. Smith and M. Ryan, Sci. World J. ID 805659, 9

2005), cc. 103-104.

(2012). DOI: 10.1100/2012/805659

34. T. Nei, T. Araki, and T. Matsusaka, in Freezing and

14. Z. Hubalek, Cryobiology 46, 205 (2003).

Drying of Microorganisms, Ed. by T. Nei (Tokyo: Uni-

15. D. V. Smirnova, L. V. Zalomova, A. V. Zagainova,

versity of Tokyo Press, 1969).

et al., Int. J. Med. Microbiol. 309, 259 (2019).

35. N. Gaci, P. P. Chaudhary, W. Tottey, et al., Microb.

16. A. L. Bryukhanov and A. I. Netrusov, J. Appl. Bio-

Ecol. Health and Disease 28, 1308070 (2017). DOI:

chem. Microbiol. 42, 177 (2006).

10.1080/16512235.2017.1308070

17. L. Bircher, A. Geirnaert, F. Hammes, et al., Microb.

Biotechnol. 11 (1), 163 (2018). DOI: 10.1111/1751-

36. B. Graham, A. E. R. Fayter, J. E. Houston, et al., J.

7915.13265

Am. Chem. Soc. 140, 17 (2018).

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021

ФЕТАЛЬНАЯ СЫВОРОТКА В СОЧЕТАНИИ С 5% ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДА

783

Fetal Serum in Combination with 5% Dimethyl Sulfoxide Effectively Protects the Human

Gut Microbiota during Cryopreservation in Liquid Nitrogen

L.V. Zalomova*, D.A. Reshetnikov*, S.V. Ugraitskaya*, L.M. Mezhevikina*, A.V. Zagainova**,

V.V. Makarov**, S.M. Yudin**, and E.E. Fesenko (Jr)*

*Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

**Center for Strategic Planning and Management of Medical and Biological Health Risks, Ministry of Health of the Russian

Federation, Pogodinskaya ul. 10/1, Moscow, 119435 Russia

Due to advances in medical technologies, the need for the development of methods for long-term human gut

microbiota safe and efficient preservation that would retain species richness in microbial community and en-

sure quantitative parameters of the bacterial content of the microbiocenosis is paramount. In this study, we

evaluated the effects of 5% and 10% solutions of dimethyl sulfoxide, glycerol, ethylene glycol, gelatin, poly-

ethylene glycol, polyvinyl alcohol, fetal bovine serum, as well as fetal bovine serum in combination with

5% dimethyl sulfoxide on survival rates of human gut microbiota during cryopreservation in liquid nitrogen

(-196°С, storage up to 7 days). The highest survival rates of bacteria during cryopreservation were obtained

with a cryoprotective agent mixture based on fetal bovine serum and 5% dimethyl sulfoxide: the

LIVE/DEAD bacterial viability kit was applied, and the detection efficiency of viable cells was 81 to 87%,

along with an intact microbiota index of 88-90%. The effectiveness of the selected cryoprotectant composi-

tion was also confirmed by the method of microbiological cultivation in experiments on the cryopreservation

of individual strains that were common to the human gut microbiota.

Keywords: cryopreservation, fluorescence analysis, fetal bovine serum, bacterial cultivation

БИОФИЗИКА том 66

№ 4

2021