БИОФИЗИКА, 2021, том 66, № 5, с. 845-855

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.3

ВЛИЯНИЕ ГАЗОВ НА ЦЕЛОСТНОСТЬ СТРУКТУРЫ ЛЬДА,

ФОРМИРУЮЩЕГОСЯ ПРИ ЗАМОРАЖИВАНИИ ВОДЫ

И КРИОЗАЩИТНЫХ РАСТВОРОВ:

ОПТИКО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Н.В. Пеньков, Е.Е. Фесенко (мл.)

Институт биофизики клетки РАН - обособленное подразделение ФИЦ «Пущинский научный центр биологических

исследований РАН», 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3

E-mail: eugeny.ef@gmail.com

Поступила в редакцию 22.07.2021 г.

После доработки 27.07.2021 г.

Принята к публикации 29.07.2021 г.

C помощью оптической микроскопии исследовано влияние воздуха, гелия, аргона, ксенона и гек-

сафторида серы на целостность структуры льда, формирующегося при замораживании воды и ряда

криозащитных растворов в температурном диапазоне от 0 до -50°С. Показано, что кристаллизация

капли воды объемом ≈ 200 мкл в атмосфере воздуха происходит с нарушением целостности струк-

туры льда. В замороженных образцах наблюдается образование газовых микропузырьков диамет-

ром до 250 мкм. Продувка над поверхностью капли воды аргона, ксенона или гексафторида серы пе-

ред замораживанием позволяет снизить максимальный размер микропузырьков до 100 мкм. Про-

дувка гелия над поверхностью воды, растворов DMEM и «ЕвроКоллинз» позволяет полностью

устранить или значительно уменьшить образование газовых микропузырьков в процессе кристал-

лизации. Для формируемого при этом массива льда характерна тенденция к снижению вероятности

растрескивания при охлаждении до -50°С, что может способствовать выживаемости биологическо-

го материала при консервации. Добавление криопротектора этиленгликоля в концентрации 1-

10 об. % в раствор позволяет снизить или полностью предотвратить выделение микропузырьков га-

за при замораживании. Механизм, с помощью которого реализуется данный феномен, остается не-

ясным. Добавление этиленгликоля в концентрации 10 об. % и более также предотвращает растрес-

кивание льда при охлаждении до -50°С.

Ключевые слова: криоконсервация, кристаллы льда, этиленгликоль, инертные газы, гелий, микропузырь-

ки, растрескивание.

DOI: 10.31857/S0006302921050021

Методы криоконсервации (глубокого замора-

гексафторид серы, способны повысить жизне-

живания биообъектов) возникли в середине про-

способность биологического материала при

шлого века [1], активно развивались и в настоя-

криоконсервации [2-7]. В нашей лаборатории на

щее время широко применяются в различных

модели клеточных культур были показаны крио-

сферах - науке, медицине, сельском хозяйстве,

защитные свойства гелия [8].

биотехнологическом производстве. Выживае-

Газы растворяются в воде по «пустотному ме-

мость биологических объектов при глубоком за-

ханизму», внедряясь в полости, образованные

мораживании зависит от физических процессов,

молекулами воды [9]. Во время кристаллизации

происходящих в водных растворах в процессе за-

водных растворов газы вытесняются из образую-

мораживания и оттаивания. Состав растворов и

щихся кристаллов льда в окружающий водный

применяемые криопротекторы оказывают влия-

раствор, что вызывает нарастание концентрации

ние на зарождение и рост кристаллов льда, их

газов в остаточном незамерзшем растворе. В ито-

форму, размер, на возможность стеклования рас-

ге достигается пересыщение раствора газами, и

творов, температурное сжатие и расширение. Су-

они начинают выделяться из раствора, образуя

щественную роль в перечисленных процессах иг-

микропузырьки [10, 11]. Если имеется однона-

рают растворенные в жидкой среде газы. Счита-

правленный фронт кристаллизации, то газы

ется, что некоторые газы, например ксенон или

могут быть выдавлены из жидкости. Если же

845

846

КОБЕЛЕВ и др.

фронт неравномерный (например, в случае поме-

Целью настоящей работы являлось исследова-

щенной в жидкий азот криопробирки с жидко-

ние влияния газовой атмосферы на заморажива-

стью), то газы окажутся в ловушке, образованной

ние воды и консервирующих растворов, в том

кристаллами льда на периферии объема жидко-

числе содержащих классические криопротекторы

сти. При затвердевании раствора микропузырьки

(на примере этиленгликоля). Мы сравнивали

газа создают неоднородности. Именно эти неод-

процесс кристаллизации и структуру отвердев-

нородности служат местами наиболее вероятного

шей капли, замороженной в атмосфере гелия, ар-

образования трещин при дальнейшем охлажде-

гона, ксенона, гексафторида серы и воздуха.

нии отвердевших растворов вследствие процес-

сов температурного сжатия и расширения, т.е.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

температурных деформаций. Кроме того, нали-

чие микропузырьков способствует увеличению

Наиболее информативным методом наблюде-

температурных градиентов при охлаждении/

ния за различными процессами в реальном вре-

разогреве материала [11]. В процессе заморажива-

мени является оптическая микроскопия. В ряде

ния суспензии животных клеток нуклеация кри-

работ оптическую микроскопию применяли для

сталлов льда происходит вне клеток, и при даль-

наблюдения за образованием и ростом кристал-

нейшем замораживании клетки, как правило,

лов газовых гидратов [14-16]. В работе [17] нами

оттесняются растущими кристаллами и сосредо-

отработана методика наблюдения за образовани-

тачиваются в остаточном незамерзшем растворе

ем и ростом кристаллов газовых гидратов в герме-

[12]. Следовательно, очаги возникновения мик-

тичной ячейке под давлением газа. Для изучения

ропузырьков будут находиться вблизи клеток и

влияния инертных газов (гелий, аргон, ксенон) и

перечисленные негативные явления с большой

гексафторида серы на структуру образующегося

вероятностью могут служить повреждающими

льда была использована аналогичная методика

факторами.

наблюдения за каплей жидкости в герметичной

Ранее нами была высказана гипотеза, что сни-

ячейке. Этот метод позволяет заменить газовый

жение концентрации растворенных газов в био-

состав, окружающий каплю, на время, достаточ-

ное для газообмена в жидкости, и наблюдать за

логическом материале может снизить количество

неоднородностей в растворе при замораживании

процессами в охлаждаемой капле в реальном вре-

и повысить выживаемость криоконсервирован-

мени с разрешением ~(1-10) мкм.

ных клеток [8]. Наиболее распространенный фи-

Процесс образования льда исследовали в тита-

зический способ дегазации жидкостей - вакуу-

новой кювете-барокамере (рис. 1) (далее по тек-

мирование, но к живым клеткам и тканям млеко-

сту - барокамера), установленной в поле зрения

питающих подобный метод неприменим. Однако

стереомикроскопа MZ16A (Leica, Германия).

значительно снизить количество растворенных

При исследовании капли применяли метод про-

газов в системе с живыми объектами можно мето-

ходящего, нижнего и бокового освещения.

дом инкубации в атмосфере газа с низкой раство-

Внутрь основного отсека барокамеры помеща-

римостью. При инкубации суспензии клеток в ат-

ли каплю исследуемой жидкости объемом

мосфере определенного состава газы, находящи-

250 мкл (диаметр капли ≈12 мм, высота (толщи-

еся в растворе, будут выходить из него по

на) ≈1.7 мм). При комнатной температуре к баро-

градиенту концентрации, а газ из газообразной

камере подсоединяли пластиковый баллон, за-

фазы будет переходить в раствор в количестве,

правленный 2 л исследуемого газа при атмосфер-

определяющемся коэффициентом растворимо-

ном давлении. Предварительно для вытеснения

сти. Чем меньше коэффициент растворимости

атмосферных газов из внутреннего объема баро-

такого газа в жидкости, тем меньше окажется об-

камеры ее продували 200 мл газа. Исследуемую

щее количество газов, растворенных в жидкой

жидкость выдерживали при комнатной темпера-

фазе, в результате инкубации в его атмосфере.

туре 1 ч, в течение которого каждые 2 мин подава-

Особенно интересен в этом отношении гелий.

ли в барокамеру газ из баллона порциями по

Это нетоксичный инертный газ, с низким коэф-

50 мл. Излишки газа выходили через ослаблен-

фициентом растворимости в воде и водных рас-

ную заглушку, поэтому давление в камере не пре-

творах. Помимо низкой растворимости в воде, ге-

вышало атмосферное. Между газовой средой и

лий, в отличие от большинства других газов, име-

жидкостью протекали процессы сорбции/де-

ет

сравнительно высокий коэффициент

сорбции газов. Растворенные в жидкой капле ат-

растворимости во льду. При одной и той же тем-

мосферные газы диффундировали из жидкости в

пературе его растворимость во льду выше, чем в

газовую среду и удалялись при продувке газа че-

воде [13]. Очевидно, что при образовании льда ге-

рез камеру. Растворение инертного газа в воде

лий, встраиваясь в кристаллическую решетку

происходило до достижения максимальной рав-

льда, не будет вытесняться в окружающий рас-

новесной концентрации при данных значениях

твор и, следовательно, не будет образовывать

давления и температуры. Таким образом проис-

микропузырьки.

ходила смена состава газов, растворенных в капле

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

ВЛИЯНИЕ ГАЗОВ НА ЦЕЛОСТНОСТЬ СТРУКТУРЫ ЛЬДА

847

Рис. 1. (а) - Схема экспериментальной установки, используемой для изучения кристаллизации растворов в газовой

атмосфере: 1 - объектив микроскопа с CCD-камерой, 2 - столик микроскопа, 3 - кювета-барокамера, 4 - смотровое

окно, 5 - вход газа, 6 - выход газа и вход термопары, 7 - термопара, 8 -теплообменник, 9 - каналы для подключения

охлаждающего термостата. (б) - Схема титановой кюветы-барокамеры: 1 - корпус; 2 - основной отсек, объем 1 мл,

место установки верхнего смотрового окна; 3 - место установки нижнего смотрового окна; 4 - резервный отсек,

объем 1 мл, место установки дополнительного верхнего смотрового окна; 5 - газовые каналы; 6 - входной штуцер; 7 -

выходной штуцер с ниппелем.

жидкости. Перед охлаждением входной и выход-

гелия, аргона, ксенона и гексафторида серы. В

ной штуцеры затягивали, перекрывая ход газа, и

качестве контроля использовали атмосферный

далее газовую атмосферу не меняли. Скорость

воздух.

охлаждения капли в барокамере составляла

При наблюдении за замораживанием воды и

1°С/мин. Система была снабжена системой тер-

растворов фиксировали температуру льдообразо-

мостатирования, которая позволила проводить

вания, сайты первичной нуклеации льда, наличие

наблюдения при контролируемой температуре в

и рост микропузырьков газа, наличие и паттерн

интервале от 0°C до -50°C. Кювету вставляли в

растрескивания криогидрата при дальнейшем

П-образный теплообменник, охлаждающий ее с

охлаждении.

задней и боковых поверхностей. Теплообменник

подключали к жидкостному криотермостату FT-

311-80 (ЛОИП, Россия). В качестве хладоагента

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

использовали этиловый спирт. Температуру ба-

1. Влияние газов на целостность структуры льда,

рокамеры контролировали при помощи цифро-

формирующегося при замораживании воды. В пер-

вого термометра ATT-2006 (ЗАО НПП «Эликс»,

вом эксперименте мы исследовали влияние арго-

Россия) с точностью 0.1°C (термопара ТМКн).

на, ксенона, гексафторида серы, а также гелия на

Термопару вводили в корпус барокамеры через

структуру массива льда, образующегося при за-

выходной газовый канал, ввод герметизировали.

мораживании исследуемой аликвоты воды. В ка-

Датчик располагали над каплей, касаясь ее по-

честве контроля наблюдали замораживание кап-

верхности (виден на снимках, например, на

ли в атмосфере воздуха.

рис. 4г). Чтобы атмосферная влага не конденси-

Известно, что вследствие преодоления энерге-

ровалась на смотровом окне и не ухудшала изоб-

тического барьера при охлаждении кристаллиза-

ражение исследуемой системы, наблюдения про-

водили через тонкий слой этилового спирта, ко-

ция происходит не в точке равновесного кристал-

торый наносили на внешнюю поверхность

лообразования, а при более низкой температуре в

верхнего смотрового окна.

переохлажденной жидкости. Нуклеация льда при

охлаждении является стохастическим процессом

В качестве исследуемой жидкости использова-

и ее точная температура зависит от скорости

ли деионизированную воду высокой степени

охлаждения и наличия частиц-нуклеаторов в рас-

очистки с удельным сопротивлением 17 МОм∙см,

творе или на границах капли [18]. В наших экспе-

(Sartorius Arium Pro, Weighing Technology GmbH,

риментах нуклеация воды происходила в диапа-

Германия), среду DMEM (Gibco, Life Technology

зоне -4 ~ -7°C (см. табл. 1) и начиналась с быст-

Corp., Великобритания), консервирующий рас-

рого образования тонкой корки льда на

твор «ЕвроКоллинз» (KH₂PO₄ -2.04 г/л, KCl -

поверхности, после чего продолжалась в объеме

1.12 г/л, K₂HPO₄ - 7.3 г/л, NaHCO₃ - 0.84 г/л,

капли.

глюкоза - 34.96 г/л), раствор «ЕвроКоллинз без

Состав газовой фазы внутри барокамеры не

глюкозы», а также этиленгликоль (Sigma-Aldrich,

оказывал влияния ни на температуру нуклеации

США). Растворы исследовали под атмосферой

кристаллов льда, ни на местоположение сайтов

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

848

КОБЕЛЕВ и др.

Таблица 1. Характеристика замораживания воды в атмосфере различных газов

Температура (°С) начала

Температура (°С) и характер

Наличие газовых

процесса растрескивания и

Атмосфера

нуклеации при скорости

микропузырьков в поле

наличие трещин при

охлаждения 1°С/мин

капли

температуре -50°С

-5.2 ± 0.8

Микропузырьки размером

-32.0 ± 5.0

Воздух

Первичная нуклеация на

5-250 мкм по всему полю

Наличие множества трещин

n = 8

поверхности капли

капли

в объеме капли

Незначительное количество

-5.0 ± 1.0

-33.4 ± 4.0

Гелий

микропузырьков в поле

Первичная нуклеация на

Наличие трещин в объеме

n = 10

капли или их полное

поверхности капли

капли

отсутствие

-4.8 ± 0.3

Микропузырьки размером

-29.6 ± 5.4

Аргон

Первичная нуклеация на

5-100 мкм по всему полю

Наличие множества трещин

n = 10

поверхности капли

капли

в объеме капли

-5.3 ± 1.5

Микропузырьки размером

н/о

Ксенон

Первичная нуклеация на

5-100 мкм по всему полю

Наличие множества трещин

n = 4

поверхности капли

капли

в объеме капли

-5.5 ± 0.5

Микропузырьки размером

-31.7 ± 6.4

Гексафторид серы

Первичная нуклеация на

5-100 мкм по всему полю

Наличие множества трещин

n = 10

поверхности капли

капли

в объеме капли

первичной нуклеации. Фронт кристаллизации

При замораживании капли воды в атмосфере

продвигался симметрично от краев капли, где она

воздуха наблюдали возникновение многочислен-

наиболее интенсивно охлаждалась, к центру. Так

ных микропузырьков размером

5-250 мкм

как плотность льда меньше плотности жидкой

(рис. 3а).

воды, то по мере кристаллизации объем аликвоты

Кристаллизация воды в атмосфере аргона,

воды увеличивался, за счет чего в центре отвер-

ксенона и гексафторида серы также происходила

девшей капли образовывалось вздутие. Такая де-

с образованием газовых микропузырьков разме-

формация формы капли сама по себе не вызывала

ром 5-100 мкм (рис. 3б-г). При описанных мето-

растрескивания льда.

дах наблюдения не было выявлено заметной раз-

ницы в количестве и размере микропузырьков га-

При дальнейшем охлаждении наблюдали рас-

за при замораживании в атмосфере аргона,

трескивание льда. Процесс растрескивания начи-

ксенона и гексафторида серы. Кристаллизация

нался в диапазоне температур от -20 до -40°С.

капли воды в атмосфере гелия резко отличалась,

Мы не выявили какого-либо влияния газовой ат-

так как при этом либо не наблюдалось образова-

мосферы на температуру появления первых тре-

ния микропузырьков газа, либо они были мало-

щин (рис. 2а-е). Что касается количества возник-

численны. Образовавшийся лед был прозрачным,

ших трещин, то в атмосфере гелия мы фиксиро-

с наличием единичных микропузырьков

вали как образцы с выраженными явлениями

(рис. 3д, е).

растрескивания льда, так и практически полно-

Примечательно, что структура льда, заморо-

стью лишенные их (рис. 2д, е). С нашей точки

женного в атмосфере аргона, ксенона, гексафто-

зрения можно говорить о тенденции к снижению

рида серы и воздуха визуально выглядела сход-

явления растрескивания в атмосфере гелия, что

ной. При этом аргон, ксенон и гексафторид серы

логично связать с сокращением газовой фазы в

значительно отличаются по показателю раство-

растворе. Однако чтобы эту тенденцию достовер-

римости в воде. Ксенон имеет сравнительно вы-

но подтвердить, требуются эксперименты в со-

сокий коэффициент растворимости (5.0 ммоль/л

ставе большей выборки, а также модель подсчета

при 20°С), в то время как гексафторид серы слабо

выраженности процесса явления растрескива-

растворим в воде (0.29 ммоль/л) и по этому пока-

ния, например, по общей протяженности трещин

зателю близок к гелию (0.40 ммоль/л при 20°С,

в поле образца.

растворимость дана по работе [19]). Образцы

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

ВЛИЯНИЕ ГАЗОВ НА ЦЕЛОСТНОСТЬ СТРУКТУРЫ ЛЬДА

849

Рис. 2. Фотографические изображения явления растрескивания массива льда капли воды, замороженной в кювете-

барокамере в условиях продувки воздухом (а), аргоном (б), ксеноном (в), гексафторидом серы (г) и гелием (д, е).

Изображения получены при температуре -50°С.

льда, полученные в атмосфере ксенона и гек-

щим ему встраиваться в кристаллическую решет-

сафторида серы, мало отличались друг от друга,

ку льда [20]. Вероятно, именно это свойство по-

тогда как использование гелия привело к замет-

служило причиной резкого отличия льда,

ным изменениям. По-видимому, существенное

замороженного в атмосфере гелия.

влияние на возникновение нарушений структуры

2. Влияние гелия на целостность структуры льда,

льда оказывает не только количество растворен-

формирующегося при замораживании растворов

ного газа, но и его природа. Гелий (наряду с водо-

DMEM, «ЕвроКоллинз» и «ЕвроКоллинз без глю-

родом и неоном) обладает аномально высоким

козы». В связи выраженным действием гелия,

коэффициентом растворимости во льду, обуслов-

предохраняющим массив льда от образования

ленным малым размером молекулы, позволяю-

микропузырьков, замораживание растворов ре-

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

850

КОБЕЛЕВ и др.

Рис. 3. Фотографические изображения структуры льда капли воды, замороженной в кювете-барокамере в условиях

продувки воздухом (а), аргоном (б), ксеноном (в), гексафторидом серы (г) и гелием (д, е). Изображения получены

при температуре -50°С.

гистрировали в атмосфере воздуха и гелия. Среду

В процессе медленного замораживания исследуе-

DMEM часто используют для консервации ли-

мых растворов часть воды кристаллизуется в виде

ний эукариотических клеток, добавляя в нее

чистого льда. В оставшихся незамерзшими областях

стандартные криопротекторы. Раствор «Евро-

концентрируются соли и прочие вещества. Эти обла-

Коллинз» относится к первому поколению кон-

сти отвердевают в виде криогидрата при более низ-

сервирующих растворов для гипотермического

кой температуре, чем водный лед.

хранения органов. Консервирующие растворы в

будущем имеют шанс войти в состав криозащит-

При замораживании DMEM (рис. 4а) и «Евро-

ных растворов для криоконсервации органов, ко-

Коллинз» в атмосфере воздуха образование крио-

гда такая технология будет разработана.

гидрата сопровождалось выделением микропузырь-

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

ВЛИЯНИЕ ГАЗОВ НА ЦЕЛОСТНОСТЬ СТРУКТУРЫ ЛЬДА

851

Рис. 4. Фотографические изображения массива льда растворов DMEM (а, б) и «ЕвроКоллинз без глюкозы» (в, г),

замороженных в кювете-барокамере в атмосфере воздуха (а, в) и гелия (б, г). Изображения получены при

температуре -12°С.

ков растворенных газов. Располагаясь между кри-

оказывают существенное влияние на структуру

сталлитами, микропузырьки вызывали появление

замороженных растворов [21]. Добавление этих

микротрещин и разломов в массиве льда. Первые

веществ повышает вязкость жидкости и способ-

очаги трещин появлялись при температуре около

ствует стеклованию криогидрата. Возникающие

-13°C через 1-2 мин после начала кристаллиза-

аморфные структуры обладают одновременно

ции. Из каждого очага формировалось несколько

повышенной эластичностью и более высоким ко-

разломов длиной до 200 мкм и шириной 10-

эффициентом температурного сжатия по сравне-

50 мкм. Через 2-5 мин микротрещины распро-

нию с кристаллами льда, что приводит к возник-

странялись по всей видимой поверхности замо-

новению термомеханических напряжений при

роженной капли. Кристаллизация раствора «Ев-

дальнейшем охлаждении [22,23].

роКоллинз без глюкозы» (рис. 4в) несколько от-

Продувка гелия над растворами DMEM и «Ев-

личалась: скопления газовых микропузырьков,

роКоллинз» (стандартным и без глюкозы) непо-

сливаясь, образовывали протяженные полости

средственно перед замораживанием в подавляю-

длиной 2-5 мм, в последующем формирующие

щем большинстве экспериментов позволила

трещины.

предохранить образующийся лед от возникнове-

Различие в структуре криогидрата, образован-

ния газовых полостей или отдельных микропу-

ного раствором «ЕвроКоллинз без глюкозы» и

зырьков (рис. 4б, г). В серии экспериментов на-

остальными растворами, можно объяснить тем,

блюдения за образовавшимся льдом проводили в

что последний содержит исключительно неорга-

течение 1 ч при -50°C. За это время образование

нические соли, в то время как остальные раство-

микронеоднородностей во льду не наблюдалось.

ры помимо солей содержат сахара либо амино-

кислоты. Как сахара, так и большинство амино-

3. Влияние этиленгликоля на целостность струк-

кислот обладают криозащитными свойствами и туры льда и поведение газовой фазы при заморажи-

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

852

КОБЕЛЕВ и др.

Таблица 2. Характеристика замораживания растворов этиленгликоля до -50°С

Наличие микропузырьков в поле капли, а

Температура (°С) и характер нуклеации при

Раствор

также характер растрескивания льда и

скорости охлаждения 1°/мин

криогидрата при охлаждении

-9.5 ± 1.3

Микропузырьки отсутствуют. Наличие

Вода +

Первичная нуклеация на поверхности

микротрещин (10-50×200 мкм) после

этиленгликоль (1%)

капли

кристаллизации объема капли

-11.0 ± 1.1

Вода +

Микропузырьки отсутствуют. Трещины

Первичная нуклеация в объеме капли;

этиленгликоль (10%)

отсутствуют

образуются дендритоподобные кристаллы

-41.6 ± 3.6

Вода +

Первичная нуклеация на стенках отсека или

Микропузырьки отсутствуют. Трещины

этиленгликоль (45%)

вблизи них; образуется лед в виде массива

отсутствуют

тонкой слоистой структуры

-11.0 ± 1.6

DMEM +

Микропузырьки отсутствуют. Трещины

Первичная нуклеация в объеме капли;

этиленгликоль (10%)

отсутствуют

образуются дендритоподобные кристаллы

-41.0 ± 3.4

DMEM +

Первичная нуклеация на стенках отсека или

Микропузырьки отсутствуют. Трещины

этиленгликоль (45%)

вблизи них; образуется лед в виде массива

отсутствуют

тонкой слоистой структуры

Примечание. Для всех растворов n = 4.

вании. На следующем этапе мы исследовали вли-

Следует отметить, что полное отвердевание

яние криопротектора этиленгликоля на структу-

водных растворов этиленгликоля происходит при

ру твердой фазы при замораживании в атмосфере

температуре ниже -75°С, поэтому в наших экспе-

воздуха. Для этого мы замораживали ряд раство-

риментах полное отвердевание раствора не про-

ров этиленгликоля разной концентрации до тем-

исходило.

пературы -50°С (см. табл. 2).

С увеличением содержания криопротектора до

Замораживание водного раствора этиленгли-

10 об. % изменился характер замораживания рас-

коля низкой концентрации (1 об. %) имело как

творов. Образование твердой фазы в растворах c

сходства, так и отличия от кристаллизации чи-

10 об. % этиленгликоля начиналось в объеме

стой воды. После образования поверхностной

жидкости без возникновения поверхностного

корки льда объем жидкости кристаллизовался

льда. Первые дендритоподобные кристаллы по-

симметрично от краев к центру. Даже такое не-

являлись на боковой поверхности отсека барока-

значительное

содержание криопротектора

меры (рис. 5а). Микропузырьки или трещины в

предотвратило образование видимых газовых

твердой фазе отсутствовали (рис. 5б). Дальней-

микропузырьков. Однако его оказалось недоста-

ший рост содержания этиленгликоля вызвал сни-

точно для предохранения массива льда от возник-

жение температуры кристаллизации переохла-

новения микротрещин при дальнейшем охлажде-

жденной капли до -40°С. Характер кристаллиза-

нии. Неясным остается механизм, с помощью ко-

ции в растворах с

45 об.

% этиленгликоля

торого реализовался феномен отсутствия

отличался от кристаллизации более разбавлен-

видимой газовой фазы при отвердевании раство-

ных растворов. Образование твердой фазы начи-

ра, поскольку снижением коэффициента раство-

налось на стенках отсека или вблизи них. Твердая

римости газов в системе «вода-этиленгликоль»

фаза образовывалась в виде крупного массива,

при таком содержании этиленгликоля можно

который имел слоистую структуру, образованную

пренебречь.

тонкими плоскими дендритами (рис. 5в).

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

ВЛИЯНИЕ ГАЗОВ НА ЦЕЛОСТНОСТЬ СТРУКТУРЫ ЛЬДА

853

Рис. 5. Фотографические изображения капель 10%-го (а, б) и 45%-го (в) водного раствора этиленгликоля, охлаждае-

мых в кювете-барокамере в атмосфере воздуха. (а) - Появление первых дендритоподобных кристаллов льда при тем-

пературе -7°С; (б) - отвердевший 10%-й раствор при температуре -15°С; (в) - структура дендритов, образованных в

процессе кристаллизации 45%-го раствора этиленгликоля; изображение получено при температуре -45°С.

Массив имел однородное строение без трещин

ние на структуру криогидрата, чем выше содер-

и включений микропузырьков газа или жидко-

жание криопротектора.

сти. В серии наблюдений в течение 1 ч с охлажде-

Уже 1 об. % этиленгликоля предотвращает вы-

нием до -50°С целостность массива сохранялась

неизменной.

деление газа в виде наблюдаемых в световой мик-

роскоп микропузырьков. Однако применяемые

Известно, что криопротекторы оказывают су-

нами методы исследования не позволяют с уве-

щественное влияние на структуру замороженных

ренностью утверждать об отсутствии нанораз-

водных растворов. Введение криопротекторов в

мерных пузырьков, не фиксируемых световым

раствор снижает соотношение кристаллического

льда относительно остеклованного криогидрата в

микроскопом. Более высокие концентрации эти-

отвердевших растворах [24, 25], изменяет морфо-

ленгликоля предотвратили как образование ви-

логию льда [21, 26], в отдельных случаях может

димых микропузырьков, так и растрескивание

менять тип образующихся кристаллов льда, спо-

криогидрата при охлаждении до -50°С. В то же

собствуя образованию метастабильного кубиче-

время нельзя исключить, что растрескивание бу-

ского льда вместо гексагонального даже при

дет происходить в более низкой температурной

умеренных скоростях охлаждения [27]. Криопро-

зоне, как это показано для некоторых витрифи-

текторы также повышают эластичность остекло-

цирующих растворов с криопротекторами [28],

ванного криогидрата [21]. Наше исследование

так как применяемая нами система не позволяла

подтверждает сильное влияние этиленгликоля на

структуру отвердевшего раствора. При этом газо-

проводить наблюдения при более низких темпе-

вая составляющая оказывает тем меньшее влия-

ратурах.

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

854

КОБЕЛЕВ и др.

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. C. Polge, A. U. Smith, and A. S. Parkes, Nature 164,

1. Кристаллизация капли воды (объем

≈

666 (1949).

≈ 200 мкл, диаметр ≈12 мм; высота ≈1.7 мм) в ат-

2. S. Sheleg, H. Hixon, B. L. Cohen, et al., Int. J. Clin.

мосфере воздуха происходит с нарушением це-

Exp. Pathol. 1 (5), 440 (2008).

лостности структуры льда. В замороженных об-

разцах наблюдается образование газовых микро-

3. S. V. Sheleg, H. L. Hixon, S. A. Svarovsky, and B. Co-

hen, Patent US8124329B2 (2012).

пузырьков диаметром до 250 мкм. Продувка над

поверхностью капли воды аргона, ксенона или

4. P. Shannon, J. Dairy Sci. 48, 1357 (1965).

гексафторида серы перед замораживанием позво-

5. P. Shannon, N. Z. Dairy Board. 47, 16 (1971).

ляет снизить максимальный размер микропу-

6. А. И. Пономарев, О. Г. Макеев, А. И. Зверева и др.,

зырьков до 100 мкм.

в сб. Материалы III межрегиональной научно-прак-

тической конференции «Клеточные технологии -

2. Продувка гелия над поверхностью воды,

практическому здравоохранению» (Екатеринбург,

растворов DMEM и «ЕвроКоллинз» перед замо-

2014), сс. 78-83.

раживанием позволяет устранить или значитель-

7. А. И. Пономарев, О. Г. Макеев, А. И. Зверева и др.,

но уменьшить образование газовых микропу-

Вестн. Урал. мед. академ. науки 5, 98 (2014).

зырьков в процессе кристаллизации. Для форми-

руемого при этом массива льда характерна

8. С. В. Уграицкая, Н. В. Шишова, Е. Л. Гагаринский

и др., Биофизика 63 (3), 510 (2018).

тенденция к снижению вероятности растрескива-

ния при охлаждении до -50°С, что может способ-

9. М. Н. Буслаева и О. Я. Самойлов, Журн. структур-

ствовать выживаемости биологического материа-

ной химии 4 (4), 502 (1963).

ла при консервации. Данный феномен позволяет

10. S. S. Bari and J. Hallett, J. Glaciol. 13 (69), 489 (1974).

объяснить механизм криозащитного эффекта ге-

11. G. Kletetschka and J. Hruba, BioRes. Open Access 4

лия, отмеченного при замораживании некоторых

(1), 209 (2015).

клеточных линий млекопитающих [8].

12. G. J. Morris, E. Acton, B. J. Murray, et al., Cryobiolo-

gy 64, 71 (2012).

3. Добавление в раствор криопротектора -

13. В. И. Косяков, В. А. Шестаков, Ж. физ. химии 76

этиленгликоля - в концентрации 1-10 об. % поз-

(5), 815 (2002).

воляет снизить или полностью предотвратить вы-

деление газов в виде микропузырьков при замо-

14. E. A. Smelik and H. E. King Jr., Amer. Mineralogist

раживании. Механизм, с помощью которого реа-

82, 88 (1997).

лизуется данный феномен, остается неясным.

15. S. Takeya, T. Uchida, J. Nagao, et al., Chem. Eng. Sci.

Добавление этиленгликоля в концентрации

60 (5), 1383 (2005).

10 об. % и более предотвращает растрескивание

16. H. Shimizu, S. Hori, T. Kume, et al., Chem. Phys. Lett.

растворов при охлаждении до -50°С.

368, 132 (2003).

17. A. Kobelev, V. Yashin, N. Penkov, et al., Crystals 9 (4),

215 (2019).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

18. T. Koop and B. Zobrist, Phys. Chem. Chem. Phys. 11

(46), 10839 (2009).

Работа выполнена в рамках государственного

19. А. Ю. Намиот, Растворимость газов в воде. Спра-

задания Министерства науки и высшего образо-

вочное пособие (Недра, М., 1991).

вания Российской Федерации (тема №АААА-

20. В. И. Косяков и В. А. Шестаков, Журн. физ. химии

А20-120101390069-4) (блоки 2 и 3 раздела «Резуль-

76 (5), 815 (2002).

таты»), а также при финансовой поддержке Рос-

сийского фонда фундаментальных исследований

21. А. А. Андреев, Д. Г. Садикова и Н. А. Ивличева,

в рамках научного проекта № 19-34-90187 (блок 1

Биофизика 62 (2), 213 (2017).

раздела «Результаты»).

22. P. S. Steif, M. C. Palastro, and Y. Rabin, Med. Eng.

Phys. 29 (6), 661 (2007).

23. D. P. Eisenberg, P. S. Steif, and Y. Rabin, Cryogenics

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

(Guildf) 64, 86 (2014).

24. G. M. Fahy, Cryobiology 17 (4), 371 (1980).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

25. S. Zhang, X. Yu, Z. Chen, et al., Cryobiology 66 (2),

интересов.

186 (2013).

26. А. А. Андреев, Д. Г. Садикова, Э. Н. Гахова и др.,

Биофизика 54 (5), 869 (2009).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

27. P. Boutron, P. Mehl, A. Kaufmann, et al., Cryobiology

Настоящая работа не содержит описания ис-

23 (5), 453 (1986).

следований с использованием людей и животных

28. 28.Y. Rabin, P. Steif, K. Hess, et al., Cryobiology 53

в качестве объектов.

(1), 75 (2006).

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

ВЛИЯНИЕ ГАЗОВ НА ЦЕЛОСТНОСТЬ СТРУКТУРЫ ЛЬДА

855

Influence of Gases on the Structural Integrity of Ice Formed During the Freezing

of Water and Cryoprotective Solutions: an Optical-Microscopic Study

A.V. Kobelev, N.V. Shishova, S.V. Ugraitskaya, L.V. Zalomova, V.A. Yashin,

N.V. Penkov, and E.Е. Fesenko (Jr.)

Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

Using optical microscopy, the influence of air, helium, argon, xenon and sulfur hexafluoride on the integrity

of the ice, formed during the freezing of water and a number of cryoprotective solutions in the temperature

range from 0 to -50°C, was investigated. It is shown that crystallization of a water droplet with a volume of

≈200 μl in the ambient air leads to a change in the structural integrity of ice. In frozen samples, the formation

of gas microbubbles up to 250 μm in diameter is observed. The process of blowing with argon, xenon, or sulfur

hexafluoride over the surface of a water droplet before freezing gives the possibility to decrease the maximum

size of microbubbles to 100 μm. The helium blowing over the surface of water, DMEM and Euro-Collins

solutions can completely eliminate or significantly reduce the formation of gas microbubbles during crystal-

lization. As a result, there is a tendency of the ice mass formed to become more resistant to cracking when the

temperatures down to -50°C. This effect may contribute to survival of the biological material following cryo-

preservation. Addition of a cryoprotectant ethylene glycol at a concentration of 1-10 vol. % to the solution

reduces or completely prevents the release of gas microbubbles during freezing. The mechanism underlying

this phenomenon remains unclear. Also, addition of ethylene glycol at a concentration of 10 vol. % or more

keeps ice from cracking when cooled to -50°C.

Keywords: cryopreservation, ice crystals, ethylene glycol, inert gases, helium, microbubbles, cracking

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021