БИОФИЗИКА, 2021, том 66, № 5, с. 871-880

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 573; 57:51-76

ИЗУЧЕНИЕ СТЕРОИДНЫХ «КЛЮЧЕЙ»

ДЛЯ АНДРОГЕННОГО РЕЦЕПТОРА

*Институт биофизики клетки РАН - обособленное подразделение ФИЦ «Пущинский научный центр биологических

исследований РАН», 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3

E-mail: samchenkoaa@mail.ru

Поступила в редакцию 08.04.2021 г.

После доработки 22.06.2021 г.

Принята к публикации 23.06.2021 г.

В работе на основе полуэмпирических квантово-химических расчетов и докинга проанализировано

конформационное многообразие изомеров природных и синтетических стероидов. Моделируется

связывание различных изомеров и аналогов тестостерона с андрогенным рецептором. Особое вни-

мание уделяется рассмотрению роли структурных и термодинамических факторов в определении

предпочтительных изомеров тестостерона, обусловливающих, возможно, наилучшее обеспечение

функционирования его комплекса с андрогенным рецептором.

Ключевые слова: тестостерон и его аналоги, электронная структура, изомеры, квантово-химический

расчет, гибкий докинг, термодинамические параметры.

DOI: 10.31857/S0006302921050057

Тестостерон, андроген стероидной природы,

андрогенными рецепторами (является фактиче-

является основным половым гормоном. В меди-

ски прогормоном), прежде чем подействовать на

цинской практике достаточно давно применяют

андрогенные рецепторы клеток органов-мише-

при гипофункции яичек и связанных с этим нару-

ней, он должен подвергнуться непосредственно в

шениях препараты тестостерона (например, те-

клетках восстановлению в 5α-позиции углерод-

стостерона пропионат) либо его синтетические

ного скелета с помощью фермента 5α-редуктазы.

аналоги. Тестостерон также используют спортс-

При этом образуется биологически активная

мены для набора мышечной массы и роста силы,

форма тестостерона - дигидротестостерон, кото-

причем часто в виде производных и миметиков (и

рый связывается с тем же андрогенным рецепто-

это считается допингом). Кроме этого, синтети-

ром в клетке, что и тестостерон.

ческий тестостерон используют при гормональ-

Как и многие биологически-активные молеку-

но-заместительной терапии для мужчин старше-

лы, стероиды функционируют по принципу

го возраста, у которых наблюдается пониженный

«ключ-замок». Они связываются в консерватив-

уровень мужского полового гормона. При уча-

ной полости в глобуле рецепторного белка.

стии тестостерона растут мышцы, образуются

Именно эти комплексы давно привлекали внима-

красные кровяные тельца, регенерируют ткани,

ние исследователей. К настоящему времени экс-

сжигается жир, происходит липидный обмен в

периментально определены структуры рецепто-

печени. В целом в любой ткани организма для

ров с некоторыми лигандами [9-11]. Несмотря на

нормальной жизнедеятельности необходим те-

повышенный интерес к проблеме активации и

стостерон [1-5]. Кроме того, ведутся исследова-

ингибирования андрогенного рецептора, суще-

ния по применению стероидов как фармакофор-

ственное значение уделяется проблеме строения

ного базиса новых инсектицидов [6].

самого андрогенного рецептора и определенных

Действие тестостерона начинается с его связы-

замен аминокислот внутри него. В то же время

вания с соответствующим рецептором. Первич-

вопрос о конформационных возможностях моле-

ные акты взаимодействия гормона с поверхно-

кулы тестостерона в сравнении с его аналогами

стью клетки, образование комплекса с рецепто-

при взаимодействии с рецептором представляет-

ром описаны во множестве работ. Наиболее

ся недостаточно ясным - учитывая строение ука-

подробными и последними из них являются ра-

занного рецептора и высокую консервативность

боты [7, 8]. Важно отметить, что сам тестостерон

полости, где осуществляется взаимодействие.

биологически малоактивен и слабо связывается с

Опять же, интересен вопрос влияния водного

871

872

САМЧЕНКО и др.

окружения и катионов на взаимодействия произ-

Поиски и анализ мест связывания изомеров

водных тестостерона с активным центром. Нами

тестостерона с андрогенным рецептором были

запланированы исследования в данном направ-

выполнены с помощью метода гибкого докинга,

лении, но на настоящем этапе мы начали иссле-

который хорошо реализован в пакете Autodock

дование лигандов в газовой фазе, а сами расчеты

VINA [15]. В качестве моделей фермента, ставше-

и моделирование взаимодействия их с активным

го мишенью для докинга, в банке данных про-

центром проводили без участия воды.

странственных структур белков (Protein Data

Bank, PDB) были выбраны структуры андроген-

В данной работе на базе современных методов

ного рецептора человека (коды молекул: 2Q7I и

вычислительной химии проведен сравнительный

1T7T). Структуры были получены методом рент-

анализ изомеров молекулы тестостерона, дигид-

геновской дифракции с разрешениями 1.87 и

ротестостерона, а также некоторых их аналогов.

1.7 Å соответственно, этого вполне достаточно

На основании расчетов гибкого докинга изоме-

для компьютерных расчетов методом гибкого до-

ров указанных молекул на андрогенный рецептор

кинга. В процессе подготовки к расчетам данные

мы картировали места их связывания и проана-

модели были очищены от молекул воды и других

лизировали полученные величины энергий тако-

веществ. Важно отметить, что эти рецепторы бы-

го взаимодействия.

ли закристаллизованы вместе с тестостероном и

Целью данной работы является теоретическое

дигидротстостероном, которые являются актива-

исследование структурных свойств изомеров те-

торами рецептора (при этом дигидротестостерон

стостерона в изолированной форме. Помимо это-

действует сильнее, нежели тестостерон [7, 16]).

го, в работе исследуется связывание различных

Поскольку местоположение этих молекул на ре-

изомеров и аналогов тестостерона с андрогенным

цепторе известно, мы начали наши расчеты с вос-

рецептором. Особое внимание уделяется рас-

создания структур экспериментально получен-

смотрению роли структурных и термодинамиче-

ных комплексов. Этим достигалась калибровка

ских факторов в определении предпочтительных

выбранного пакета для докинга (Autodock VINA)

изомеров тестостерона, обусловливающих по

на конкретных примерах комплексов «андроген-

возможности наилучшее обеспечение функцио-

ный рецептор + тестостерон». В начале расчета

нирования его комплекса с андрогенным рецеп-

программа строит поверхность жесткой белковой

тором.

глобулы с учетом частичных зарядов аминокис-

лотных остатков. Для того чтобы провести поиск

мест связывания лигандов на всей поверхности

МЕТОДЫ

белка-мишени, мы не стали ограничивать об-

ласть поиска какой-то небольшой ячейкой для

Для расчетов структурных, спектроскопиче-

докинга, а задали ее размер таким, чтобы в нее

ских и термодинамических особенностей указан-

поместился весь рецептор (50 × 44 × 54 Å - для

ных биомолекул использовали полуэмпириче-

молекулы с кодом 2Q7I, 52 × 50 × 60 Å - для моле-

скую квантово-химическую MNDO-методику в

кулы с кодом 1Т7Т). Центры молекул находились

вариантах параметризации PM3. Выбор такого

в точках со следующими координатами: x =

инструмента исследований обусловлен наилуч-

= 22.648, y = 5.739 и z = 11.037 для рецептора с ко-

шим соотношением (для данного типа задач) точ-

дом 2Q7I; x = -10.879, y = 9.907 и z = 44.556 - для

ности расчета и необходимых вычислительных

рецептора с кодом 1Т7Т. Эти же данные для ми-

ресурсов, неоднократно проверенных нами [12-

шеней мы использовали и для последующих рас-

14]. В ходе расчетов использовали усиленные

четов всех полученных с помощью полуэмпири-

критерии достижения глобального минимума по-

ческих методов изомеров тестостерона. Сами же

верхности потенциальной энергии исследуемых

лиганды в расчетах были максимально подвиж-

молекул. Мы добивались не только максималь-

ны: в конформационном поиске допускалось

ных по значению теплот образования оптимизи-

вращение вокруг одинарных связей по всем сте-

руемых структур, но и отсутствия отрицательных

пеням свободы. Выполненный нами расчет до-

значений частот в рассчитанных спектрах нор-

кинга основного изомера тестостерона позволил

мальных колебаний всех возможных изомеров те-

воспроизвести структуру комплекса, ранее полу-

стостерона. Этим достигалось исключение из

ченную с помощью рентгеновской кристаллогра-

рассмотрения большого числа промежуточных,

фии. При этом пакет Autodock VINA позволил со-

метастабильных структур.

отнести конкретную геометрию лиганд-белково-

Для всех изомеров были проанализированы их

го комплекса с полной энергией связывания,

основные структурные характеристики. Кроме

которая здесь именуется аффинностью («срод-

того, нами были рассмотрены другие важные па-

ство»). В VINA используется один из методов гло-

раметры: теплота образования, инерциальный

бальной стохастической оптимизации - повторя-

дефект, абсолютная энтропия, дипольный мо-

ющийся локальный поиск, описанный в работе

мент.

[17]. В этом алгоритме последовательность шагов

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

ИЗУЧЕНИЕ СТЕРОИДНЫХ «КЛЮЧЕЙ»

873

принимается в соответствии с критерием Метро-

аффинностями в активном центре уступала, ино-

полиса, а локальная оптимизация достигается

гда даже с существенным значением (около 5 и

методом Бройдена-Флетчера-Голдфарба-Шан-

более ккал/моль). Поэтому мы не приводим

но. Программа производит расчет энергии связы-

эти данные в таблице и не описываем подробно в

вания (аффинности) низкомолекулярного веще-

статье, поскольку не считаем их основополагаю-

ства к части белка:

щими.

Энергия связывания (ΔG) = A + B + C - D,

Величины аффинности связывания каждого

ккал/моль,

из изомеров с рецептором отличаются друг от

друга не столь существенно, как величины теплот

где A - сумма общей межмолекулярной энергии,

образования каждого из лигандов. Различия в ве-

энергии ван-дер-ваальсового взаимодействия,

электростатической энергии, энергии десольва-

личинах энтальпии образования (H_fo) позволи-

тации и энергии водородных связей; B - общая

ли нам выявить ряд структур с минимальными

внутренняя энергия; C - свободная энергия вра-

значениями этого параметра (выделены серым в

щения; D - несвязанная энергия системы.

табл. 1): это изомеры с номерами 10, 20, 24, 33, 40,

46 и 56 (вынесены в табл. 2).

Полная энергия связывания составила -10.6 и

-11.0 ккал/моль соответственно для молекул с

Пространственные структуры изомеров тесто-

кодами 2Q7I и 1T7T. Для изучения геометрии по-

стерона (табл. 2) представлены на рис. 1. Структу-

лучаемых комплексов и анализа типов взаимо-

ры представлены таким образом, что слева напра-

действий мы использовали пакет PLIP [18] Ос-

во и сверху вниз постепенно у каждой структуры

новные виды взаимодействия, стабилизирующие

уменьшается теплота образования, т.е. самая

такой комплекс, - это водородные связи боковых

верхняя и левая является самой выгодной по теп-

групп аминокислот полости рецептора с атомами

лоте образования.

кислорода в составе лиганда, а также гидрофоб-

Говоря о пространственном строении тесто-

ные взаимодействия между стероидной цикличе-

стерона, следует отметить, что в состав его моле-

ской системой и лейцинами (Leu704 и Leu873) и

кулы входят два кольца «циклогексана». У цикло-

фенилаланинами (Phe764 и Phe876) на внутрен-

гексана существуют два основных конформера,

ней поверхности полости андрогенного рецеп-

которые существенно отличаются друг от друга

тора.

по термодинамическим характеристикам [19-21].

Конформеры циклогексана представлены на

рис. 2. Самым стабильным является конформер в

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

форме «кресла» (рис. 2а). Вторым, менее стабиль-

В ходе подготовки расчетов мы смоделировали

ным конформером является конформер в форме

64 изомерных формы тестостерона. Для каждой

«ванны», но так как геометрия «ванны» для цик-

из них был выполнен оптимизационный конфор-

логексана на самом деле является лишь теорети-

мационный анализ с поиском глобальных мини-

чески предсказанной, то в природе эта форма

мумов энергии структур с контролем отсутствия

имеет вид, представленный на рис. 2б (форма

отрицательных значений частот в рассчитанных

«полуванны»). При такой топологии не возникает

спектрах нормальных колебаний - появление та-

напряженности между двумя водородами (ориен-

ких частот свидетельствовало бы о метастабиль-

тированными в одну сторону), которая возникала

ном, переходном состоянии молекулы [13, 14]. В

бы, если конформеры находились в идеальной

табл. 1 представлены все изомеры, их теплоты об-

форме «ванны» [19-21].

разования и аффинности к рецепторам тестосте-

Анализ наиболее выгодных изомеров тестосте-

рона (2Q7I и 1T7T).

рона (табл. 2, 20 и 46) позволяет отметить, что все

Обращает на себя внимание чрезвычайно вы-

«внутренние» циклогексановые кольца имеют

сокая консервативность связывания каждого из

конформацию «кресел». В то же время в других

изомеров с рецептором - об этом свидетельствует

изомерах, представленных на рис. 1 и в табл. 2,

идентичная локализация каждого из лигандов

лишь одно из двух циклогексановых колец имеет

(«+» в таблице означает, что исследуемая молеку-

такую конформацию (схематически на рис. 1

ла с наилучшей аффинностью находилась в поло-

конформации «кресла» обозначены цифрой 1, а

сти активного центра рецептора). При этом поло-

«ванны» и «полуванны» - цифрой 2). В остальных

жение лигандов хорошо соответствует локализа-

структурах (не представленных на рис. 1) «внут-

ции тестостерона в комплексе, структура

ренние» циклогексановые кольца совсем не име-

которого решена экспериментально [9, 10]. Все

ли самых стабильных форм конформера («крес-

изомеры, которые находились в активном центре

ло»). Такое состояние структур изомеров тесто-

андрогенного рецептора, имели наибольшую аф-

стерона вызвано наличием двух метильных групп

финность по сравнению с аффинностями изоме-

в молекулах. Метильные группы являются внут-

ров, не попадающих в активный центр рецептора.

ренними ограничителями стереохимических из-

Аффинность этих локализаций по сравнению с

менений и перестроек разных изомеров тестосте-

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

ИЗУЧЕНИЕ СТЕРОИДНЫХ «КЛЮЧЕЙ»

877

Рис. 2. Конформационные состояния циклогексана РМ3 МОРАС: (а) -«кресло», (б) - «полу-ванна».

Рис. 3. Схематическое расположение тестостерона и его аналогов в активном центре андрогенного рецептора.

рона. Указанные особенности пространственно-

Показано, что они являются более сильными ак-

го строения изомеров тестостерона влияют на

тиваторами андрогенного рецептора [7, 8, 22-24].

локализацию каждого из изомеров при их связы-

При исследовании положения структур в ре-

вании внутри андрогенного рецептора. Именно

цепторе нами было выявлено, что плоскости мо-

поэтому, несмотря на большое разнообразие изо-

лекулы наиболее термодинамически стабильного

мерных форм, в роли активатора андрогенного

изомера тестостерона (тестостерон 20), дигидро-

рецептора выступает самый термодинамически

тестостерона и метриболона полностью совпада-

стабильный изомер, который в настоящее время

ют друг с другом. В то же время плоскость изоме-

применяется в медицине и других областях - 17β-

ра тестостерона с номером 46 лежит внутри ре-

гидрокси-10,13β-диметиландрост-4-ен-3-он

[1-

цептора ровно перпендикулярно указанным

8]. Его зеркально отраженная в плоскости струк-

изомерам (вдоль большой оси молекулы) (рис. 3).

тура (17β-гидрокси-10,13α-диметиландрост-4-ен-

Аффинности иследуемых молекул приведены

3-он) - энергетический эквивалент, тем не менее

в табл. 3. Примечательно, что тестостерон 20, ди-

сильно уступающий в аффинности к андрогенно-

гидротестостерон и метриболон по аффинности

му рецептору. Это является еще одним подтвер-

эквиэнергетичны: разница в свободной энергии

ждением высокой геометрической специфично-

связывания не превышает 1 ккал/моль, тогда как

сти лиганда при образовании комплекса «тесте-

аффинность тестостерона

46 отличается от

стерон + рецептор». Данный факт потребовал

остальных примерно на 2 ккал/моль.

более тщательного изучения взаимодействия с

Анализ пространственного строения изучае-

рецептором других, более сильных аналогов те-

мых биологически активных лигандов показал,

стостерона: дигидротестостерона и метриболона.

что тестостерон 20, дигидротестостерон и метри-

Таблица 3. Аффинности лигандов к рецепторам 2Q7I и 1T7T

Аффинность к рецептору 2Q7I,

Аффинность к рецептору 1Т7Т,

№ молекулы

ккал/моль

Тестостерон 20

-10.6

-11.0

Тестостерон 46

-9.0

Дигидротестостерон

-10.7

-11.2

Метриболон

-9.8

-10.4

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

ИЗУЧЕНИЕ СТЕРОИДНЫХ «КЛЮЧЕЙ»

879

ладать «невыплощенные» молекулы, поскольку

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

все три оси молекулы будут задействованы в рас-

Настоящая работа не содержит описания ис-

чете этой величины.

следований с использованием людей и животных

Как показал расчет, для этих структур наиболь-

в качестве объектов.

шая величина дефекта была у тестостерона-46:

Δ′ = -962.343 u⋅Å². Следом за ним идет тестосте-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

рон-20: Δ′ = -510.888 u⋅Å² и далее дигидротестосте-

1. C. Eisenegger, J. Haushofer, and E. Fehr, Trends Cog-

рон (Δ′ = -495.305 u⋅Å²). Наконец, наиболее плос-

nitive Sci. 15 (6), 263 (2011).

кой молекулой является метриболон Δ′ =

2. V. Tyagi, M. Scordo, R. S. Yoon, et al., Rev. Urol. 19

= -462.194 u⋅Å², как и было предсказано нами

(1), 16 (2017).

выше.

3. M. Bialek, P. Zaremba, K. K. Borowicz, and

Из литературных данных известно, что самым

S. J. Czuczwar, Pol. J. Pharmacol. 56, 509 (2004).

«сильным» активатором андрогенного рецептора

4. F. Saad and L. Gooren, J. Steroid Biochem. Mol. Biol.

является метриболон, вторым по силе является

114 (1-2), 40 (2009).

дигидротестостерон и на третьем месте стоит те-

5. J. McHenry, N. Carrier, E. Hull, and M. Kabbaj,

стостерон 20 [7, 16, 22-24].

Front. Neuroendocrinology 35 (1), 42 (2014).

Следует обратить внимание, что в данной ра-

6. М. С. Кондратьев, А. А. Самченко, В. М. Комаров

боте нами детально не рассматривалось внутрен-

и Н. Н. Хечинашвили, Актуальная биотехнология

нее строение андрогенного рецептора и тополо-

3, 529 (2020).

гия его активного центра. При исследовании изо-

7. M. H. E. Tan, J. Li, H. E. Xu, et al., Acta Pharmacol.

меров и аналогов тестостерона нам удалось

Sinica 36, 3 (2015).

выявить некоторые особенности взаимодействия

8. L. Ni, R. Llewellyn, C. T. Kesler, et al., Mol. Cell. Biol.

этих биологически активных молекул с их рецеп-

8, 26 (2013).

тором. Следующим шагом в исследовании лиган-

9. E. B. Askew, R. T. Gampe Jr, T. B. Stanley, et al., J.

дов андрогенного рецептора будет изучение ин-

Biol. Chem. 282, 25801 (2007).

гибиторов андрогеннового рецептора, расчеты

10. E. Hur, S. J. Pfaff, E. S. Payne, et al., PLoS Biol. 2, 274

свойств этих молекул нами запланированы в сле-

(2004).

дующих работах.

11. P. M. Matias, P. Donner, R. Coelho, et al., J. Biol.

Chem. 275, 26164 (2000).

ВЫВОДЫ

12. М. С. Кондратьев, А. А. Самченко, В. М. Комаров

и А. В. Кабанов, в сб. Труды международ. конф.

Согласно расчетам, все изомеры тестостерона

«Математика, компьютер, образование» (Пущино,

имеют высокое сродство к аминокислотным

2005), с. 899.

остаткам в активном центре андрогенного рецеп-

тора (который представляет собой полость почти

13. J. P. Stewart, J. Comput. Chem. 10, 209 (1989).

в центре глобулы).

14. J. P. Stewart, J. Comput. Chem. 10, 221 (1989).

Метильные группы являются внутренними

15. O. Trott and A. J. Olson, J. Comput. Chem. 31, 455

ограничителями стереохимических изменений

(2010).

и перестроек разных изомеров тестостерона.

16. P. B. Grino, J. E. Griffin, and J. D. Wilson, Endocri-

Несмотря на большое разнообразие изомерных

nology 126 (2), 1165 (1990).

форм, самой высокой аффинностью к андроге-

17. R. Abagyan and M. Totrov, Cur. Opin. Chem. Biol. 5

новому рецептору обладает самый термодина-

(4), 375 (2001).

мически стабильный изомер, который в настоя-

18. S. Salentin, S. Schreiber, V. J. Haupt, et al., Nucl. Acids

щее время применяется в медицине и других об-

Res. 43 (W1), W443 (2015).

ластях - 17β-гидрокси-10,13β-диметиландрост-

19. H. L. Strauss and H. M. Pickett, J. Am. Chem. Soc. 92

4-ен-3-он.

(25), 7281 (1970).

Плоская пространственная структура тесто-

20. R. Kahn, R. Fourme, D. André, and M. Renaud, Acta

стерона и других гормонов андрогенного типа

Cryst. B29, 131 (1973).

имеет ключевое значение как для активации ан-

21. O. Bastiansen, L. Fernholt, H. M. Seip, et al., J. Mol.

дрогенного рецептора, так и для высокой специ-

Structure 18 (2), 163 (1973).

фичности при сборке комплекса «лиганд-ре-

22. H. Bojar, K. Maar, and W. Staib, Urol. Int. 35 (2), 154

цептор».

(1980).

23. A. O. Brinkmann, G. G. J. M. Kuiper, W. de Boer,

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

et al., Steroid Biochem. 24 (1), 245 (1986).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

24. J. Y. Dube, R. R. Tremblay, and P. Chapdelaine,

интересов.

Horm. Res. 7 (6), 333 (1976).

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021