БИОФИЗИКА, 2021, том 66, № 5, с. 889-899

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.322.9

МОДЕЛИРОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГЕТЕРОДИМЕРА UxuR-ExuR

С КОМПОНЕНТАМИ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ПУТИ УТИЛИЗАЦИИ

ГЕКСУРОНАТОВ В Escherichia coli

*Институт белка РАН, 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 4

**Институт биофизики клетки РАН - обособленное подразделение ФИЦ «Пущинский научный центр биологических

исследований РАН», 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3

E-mail: yapurtov@yahoo.com

Поступила в редакцию 27.04.2021 г.

После доработки 27.05.2021 г.

Принята к публикации 28.05.2021 г.

Фактор транскрипции UxuR является репрессором ряда генов катаболизма гексуронатов. Он может

образовывать гетеродимеры со своим паралогом ExuR, что в присутствии глюкуроната ведет к ак-

тивации репрессируемых UxuR генов. Ранее методом гибкого последовательного молекулярного

докинга было предсказано, что сахара связываются с междоменными линкерами UxuR и ExuR,

влияя на взаимное расположение доменов белков. Аналогичные расчеты на моделях гетеродимера

UxuR-ExuR, соответствующих четырем точкам его молекулярно-динамической симуляции, тоже

предсказывают связывание сахаров с междоменными линкерами. Изменения в конформации белка

модулируют место и степень аффинности такого взаимодействия. Выдвигается гипотеза о появле-

нии более стабильных комплексов UxuR-ExuR-глюкуронат с повышенной аффинностью связыва-

ния с некоторыми конформациями междоменных линкеров белков. Это уменьшает число свобод-

ных мономеров, а значит, и гомодимеров UxuR в присутствии этих сахаров, и снижает репрессию

UxuR его регулона.

Ключевые слова: гетеродимер UxuR-ExuR, регуляция транскрипции, гексуронаты, гибкий молекулярный

докинг, конформационные изменения белка.

DOI: 10.31857/S0006302921050070

Основным способом реакции прокариот на

контролирует метаболизм N-ацетилглюкозамина

внешние трофические стимулы является избира-

[1], который связывается с С-концевым доменом

тельное модулирование транскрипционной ак-

белка, приводя к изменению конформации меж-

тивности соответствующих генов. Ферменты, во-

доменного линкера, что, в свою очередь, влияет

влекаемые в метаболические пути, как правило,

на ДНК-связывающие свойства NagR. При взаи-

организованы в опероны и находятся под общим

модействии представителя ROK-семейства глю-

контролем транскрипционных факторов, зача-

кокиназы SgGlkA из Streptomyces griseous с глюко-

стую чувствительных к компонентам контроли-

зой [2] происходят структурные изменения в

руемых метаболических путей.

междоменном участке С-концевого домена бел-

Необходимость связывания с низкомолеку-

ка, в результате которых SgGlkA взаимодействует

лярным лигандом, который является субстратом

с ДНК. Аналогичная схема активации регулято-

либо продуктом регулируемых ферментативных

ров транскрипции наблюдается в LacI/GalR-се-

реакций, показана для многих белков-регулято-

мействе, классическим представителем которого

ров транскрипции. Для некоторых транскрипци-

является регулятор лактозного оперона [3]. У бел-

онных факторов механизм активации при связы-

ков-регуляторов этого семейства функционально

вании с лигандом хорошо изучен и считается об-

важны два структурно подвижных участка. В лин-

щим в пределах как минимум семейства этих

кере между ДНК- и эффекторсвязывающими до-

факторов. Как правило, при взаимодействии с

менами возможно образование спирального

лигандом индуцируются изменения в конформа-

участка «hinge helix», необходимого для специфи-

ции белка.

ческого узнавания ДНК [4-7]. Между N- и С-

Представитель GntR-семейства транскрипци-

концевыми субдоменами С-концевого домена,

онных факторов белок NagR из Bacillus subtilis который является мишенью для связывания с мо-

889

890

ПУРТОВ и др.

лекулами-эффекторами, также возможно образо-

так же как и в мономерной, был доступен D-фрук-

вание «шарнира», что приводит к переориента-

туронату, D-галактуронату и D-глюкуронату.

ции N-концевого субдомена С-концевого домена

Предполагается, что проникновение лигандов

и смещению «hinge helix» и N-концевого домена в

внутрь С-концевого домена белка провоцирует

позицию, которая способствует связыванию с

реорганизацию расположения альфа-спиралей

ДНК.

домена и, как следствие, влияет на ориентацию

междоменного линкера и ориентацию N-конце-

Таким образом, подвижные малоструктуриро-

вого домена относительно С-концевого.

ванные участки белка являются удобной мише-

нью для взаимодействия с молекулами-эффекто-

В присутствии глюкуроната UxuR и ExuR спо-

ра и через изменение конформации таких участ-

собны образовывать гетеродимер [16], в результа-

ков часто происходит модулирование активности

те чего происходит активация репрессируемых

содержащих их транскрипционных факторов.

UxuR генов. Таким образом, ExuR может счи-

таться фактором, снимающим в присутствии

Транскрипционный репрессор UxuR и его па-

глюкуроната репрессорный эффект белка UxuR,

ралог ExuR (совпадение последовательности

что объясняет запуск бактериями процесса ути-

45%) контролируют транскрипцию генов ключе-

лизации гексуронатов при их наличии в среде.

вых ферментов пути Эшвелла, в ходе которого

Неясно, однако, какие структурные факторы де-

гексуронаты и гексуроновые кислоты адаптиру-

лают более предпочтительным образование ком-

ются для включения в цикл гликолиза [8-10]. Оба

плекса «UxuR-ExuR-гексуронат(глюкуронат)»,

этих двухдоменных белка относятся к GntR-се-

чем комплексов гомодимерных форм этих белков

мейству транскрипционных факторов [10, 11] и

с сахарами. Одним из путей исследования этого

функционально активны в форме димеров.

вопроса является построение модели гетеродиме-

N-концевой ДНК-связывающий домен имеет ти-

ра в комплексе с различными лигандами и срав-

пичный wHtH-мотив [12], С-концевой эффек-

нение этих моделей с ранее полученными дан-

торсвязывающий димеризационный домен более

ными.

разнороден по структуре. В зависимости от струк-

туры С-домена выделяют семь подсемейств, раз-

личающихся количеством альфа-спиралей и на-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

личием/количеством бета-слоев [13]. Белки UxuR

Использовавшиеся в работе модели молекул са-

и ExuR относятся к FadR-подсемейству GntR-се-

харов. В работе были использованы модели саха-

мейства транскрипционных факторов.

ров альфа-D-глюкозы, D-фруктуроната, D-га-

Поскольку интермедиаты путей Эшвелла и

лактуроната, D-глюконата и D-глюкуроната.

Энтнера-Дудорова могут влиять на взаимодей-

3D-модели сахаров получены из PubChem DB и

ствие UxuR с ДНК [14], методом молекулярного

подготовлены для моделирования с помощью

докинга была изучена возможность образования

программы OpenBabel (v. 2.2.3) [18]. Также были

комплексов мономерных форм этих белков с раз-

использованы фосфорилированные производ-

личными сахарами [15]. Были предсказаны места

ные глюкозы (альфа-D-глюкозо-6-фосфат) и

взаимодействия лигандов (сахаров, молекул-эф-

фруктозы (фруктозо-6-фосфат и фруктозо-1,6-

фекторов) с белками, найдены два участка на мо-

бисфосфат). 3D-модели этих сахаров получены

лекуле UxuR и один - на ExuR. Оба белка связы-

из PubChem или ChemSpider и подготовлены для

вали лиганды на поверхности междоменного

моделирования с помощью пакета программ Avo-

линкера, причем общая область связывания за-

gadro (v. 1.2.0.) [19].

нимала участок больший, чем необходим для свя-

Реконструкция димераUxuR. Реконструкция

зывания одного лиганда, а значения аффинности

трехмерной структуры димера UxuR осуществле-

лигандов не предполагали явной предпочтитель-

на с использованием аминокислотной последо-

ности какого-либо лиганда перед другими. Вто-

вательности UxuR Escherichia coli K-12 MG1655

рой сайт взаимодействия UxuR с лигандом (наи-

(T00007 KEGG K13637) [14], а димера ExuR - с

более вероятные кандидаты - D-фруктуронат,

использованием аминокислотной последова-

D-галактуронат и D-глюкуронат) располагался

тельности UxuR Escherichia coli K-12 MG1655

между альфа-спиралями С-концевого домена

(T00007 KEGG K19775) [10]. Поиск модели и ре-

[16]. Аналогичные результаты по взаимодей-

конструкцию белка проводили с помощью он-

ствию UxuR с лигандами были получены для ди-

лайн-ресурса SWISS-MODEL [20]. За основу был

мерной формы белка [17]. Как и в случае мономе-

взят белок GntR из Streptococcus agalactiae (PDB

ра белка, наблюдались два места связывания ли-

6az6) [21] с совпадением по последовательности

гандов. Один располагался на поверхности,

27.9% для UxuR и ExuR.

формируемой междоменными линкерами димера

и, частично, первой альфа-спиралью N-концево-

Реконструкция гетеродимера UxuR и ExuR на

го домена, второй - в кармане внутри С-концево-

основе полученной в SWISS-MODEL модели

го домена. Второй сайт в димерной форме белка,

проведена с использованием пакета программ

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

МОДЕЛИРОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГЕТЕРОДИМЕРА UxuR-ExuR

891

Рис. 1. Структура гетеродимера UxuR-ExuR, полученная на 100-й наносекунде молекулярно-динамической симуля-

ции. Светло-серым цветом выделен мономер ExuR, темно-серым цветом - мономер UxuR. Структура гетеродимера

представлена в двух проекциях, развернутых на 90° относительно друг друга, N-конец белка внизу.

Swiss-PdbViewer (v. 4.1.0) [22]. Полученная струк-

Для визуализации результатов докинга использо-

тура проведена через молекулярно-динамиче-

вали AutoDockToolsPython Molecular viewer

скую симуляцию для изучения позиционной ва-

(v. 1.5.6) [25].

риабельности атомов в белке и выбора структур

для докинга. Для этого использовали пакет про-

РЕЗУЛЬТАТЫ

грамм OpenMMZephyr (v. 2.0.3) [23]. Симуляцию

проводили при температуре 310.15 K в силовом

Структура гетеродимера UxuR-ExuR. В соответ-

поле Amber96 и среде «accurate water» в течение

ствии с общим планом организации транскрипци-

100 нс. В качестве мишеней для докинга исполь-

онных факторов семейства GntR входящие в со-

зовали структурные модели белка, соответствую-

став гетеродимера мономеры UxuR и ExuR были

щие 50-й (далее 50 нс), 60-й (далее 60 нс), 90-й

смоделированы как двухдоменные белки с ДНК-

(далее 90 нс) и 100-й наносекунде (далее 100 нс)

связывающими N-концевыми доменами, димери-

молекулярно-динамической траектории, что поз-

зационными/эффекторсвязывающими С-конце-

воляло сравнить изменения структуры как на от-

выми доменами и слабоструктурированными

носительно коротком (10 нс), так и на более про-

линкерами между доменами. Для проверки ста-

должительном (50 нс) периоде времени.

бильности полученной структуры и изучения по-

зиционной вариабельности атомов в белке гетеро-

Гибкий молекулярный докинг. Гибкий молеку-

димер UxuR-ExuR был проведен через молеку-

лярный докинг осуществляли с использованием

лярно-динамическую симуляцию с продол-

программного ресурса Autodock VINA package

жительностью траектории 100 нс (рис. 1).

[24]. Все потенциально подвижные связи в струк-

туре каждого лиганда сохраняли гибкими. Для

N-концевой домен ExuR (Met1-Glu59) форми-

каждого лиганда были определены места предпо-

ровал три альфа-спирали, соответствующие мо-

чтительного связывания и рассчитаны значения

тиву wHtH. Заметной вариабельности структуры

ΔG (аффинность; чем больше изменение G, тем

не наблюдалось, альфа-спирали были стабильны

выше аффинность). Методом последовательного

с редкими и временными смещениями на один

докинга определена заселенность каждой выяв-

аминокислотный остаток в какую-либо сторону.

ленной поверхности взаимодействия с лиганда-

Для модели, соответствующей 90 нс, на участке

ми. Для этого производилась серия последова-

Glu2-Glu5 однократно формировалась структура,

тельных расчетов, в каждом из которых учитыва-

подобная бета-слою. N-концевой домен UxuR

лись результаты предыдущих раундов докинга,

(Met1-Lys60) организован аналогичным образом,

при этом лиганды с самой большой аффинно-

альфа-спирали также оставались достаточно ста-

стью последовательно добавлялись к мишени и

бильны. В неструктурированных участках домена

полученные комплексы использовались в следу-

могли временно формироваться структуры, по-

ющем раунде докинга. Для каждого углевода про-

добные бета-слою (Thr25-Tyr285 на структуре, со-

водили по десять последовательных итераций.

ответствующей 50 нс).

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

892

ПУРТОВ и др.

С-концевой домен белков UxuR и ExuR сфор-

ности гетеродимера предсказываемых мест взаи-

мирован семью альфа-спиралями, что соответ-

модействия с сахарами показало, что поверх-

ствует структурам гомологичных белков подсе-

ность, формируемая междоменными линкерами

мейства FadR. В ExuR С-концевой домен вклю-

белков, предпочтительнее других мест связыва-

чал в себя аминокислотные остатки с Pro94 по

ния. Большинство рассмотренных сахаров при

Ser258. Формирующие этот домен альфа-спирали

последовательном докинге формировали струк-

и их взаимная конфигурация сохраняли стабиль-

туры, подобные тяжам, расположенным вдоль

ность на всех рассмотренных точках молекуляр-

междоменных линкеров и прилегающих к ним

но-динамической траектории за исключением

участков, в прочих местах (преимущественно в

незначительных смещений на один-три амино-

пространстве между С-концевыми доменами)

кислотных остатка или незначительных времен-

лиганды располагались редко (рис. 3).

ных деформаций альфа-спиралей. В неструкту-

Так, D-галактуронат, D-фруктуронат и альфа-

рированных участках могли возникать структу-

D-глюкоза во всех четырех структурах формиро-

ры, подобные бета-слою (Gln115-Thr117

- в

вали тяжи на линкерах белка. D-глюкуронат фор-

структуре, соответствующей траектории 50 нс;

мировал тяж в структурах с траекториями 60, 90 и

Gln141-Asp143 и Phe226-Glu228 - в структуре, со-

100 нс, тогда как в структуре 50 нс половина ли-

ответствующей траектории 60 нс; Ser140-Thr142 -

гандов располагалась в пространстве между С-

в структуре, соответствующей траектории 100 нс).

концевыми доменами. В отличие от трех сахаров,

С-концевой домен UxuR сформирован амино-

D-глюконат только в структуре 90 нс формировал

кислотными остатками с Pro95 по Ala257. Анало-

отчетливый тяж. На остальных структурах с лин-

гично ExuR, образующие этот домен UxuR аль-

керами взаимодействовало около половины ли-

фа-спирали и их взаимная ориентация остава-

гандов, остальные распределялись по поверхно-

лись стабильны с незначительными вариациями

сти белка.

размещения и низкой степенью деформации

структуры. Небольшие подобные бета-слоям

К сожалению, вариабельность значений аф-

участки временно возникали в неструктуриро-

финности, полученных в результате расчетов, в

ванных участках домена (Ser138-Ala140, Asn177-

подавляющем большинстве случаев не позволяет

Pro179 в структуре, соответствующей траектории

уверенно говорить о специфичности взаимодей-

50 нс; Lys228-Leu231 в структуре, соответствую-

ствия лиганда с поверхностью белка. В норме

щей траектории 90 нс; Asp253-Ala257 в структуре,

диапазон изменения значений аффинности в

соответствующей траектории 100 нс).

пределах одного раунда докинга (разница между

Междоменные линкеры в обеих белках (Gly60-

максимальным и минимальным значением аф-

Gly93 в ExuR и Gly61-Gly94 в UxuR) оставались

финности в одном раунде докинга) не превышал

слабоструктурированными во всех рассмотрен-

0.5 ккал/мол. Однако в ряде случаев диапазон из-

ных точках молекулярно-динамической траекто-

менения значений аффинности был больше этого

рии. В них могло происходить формирование ко-

значения (табл. 1).

ротких временных участков, похожих на бета-

Таким образом, четыре сахара могут демон-

слой (Ile70-Val72 в структуре, соответствующей

стрировать некоторую специфичность к участку

траектории 50 нс и Val62-Arg65 в структуре, соот-

взаимодействия на поверхности белка. Три из

ветствующей траектории 90 нс для ExuR; Val63-

них (D-глюкуронат и D-галактуронат и в мень-

Arg66 и Val63-Val 65 на структуре, соответствую-

шей степени D-фруктуронат) предпочтительно

щей 50-й и 100-й наносекунде траектории для

связываются именно с междоменными линкера-

UxuR). В целом линкеры располагались доста-

ми белков. Область связывания D-глюконата де-

точно компактно, приближая N-концевой домен

локализована и охватывает дополнительно участ-

белка к поверхности С-концевого домена так, что

ки на поверхности С-концевых доменов. Высо-

расположенные в линкерах аминокислотные

кое значение аффинности для альфа-D-глюкозы

остатки могли взаимодействовать с аминокис-

(1 ккал/мол для третьей итерации в структуре с

лотными остатками белка N- и С-концевых доме-

временем моделирования 90 нс) связано по всей

нов. Формирование области контакта между

видимости с конфигурацией лигандов, получен-

С-концевыми доменами белков осуществлялось

ных на первых двух итерациях докинга, рядом с

за счет взаимодействий первой и четвертой аль-

которыми располагался лиганд третьей итерации.

фа-спиралей С-концевых доменов обеих белков

(Pro94-Thr114 и Ser157-Arg170 - для ExuR, Pro95-

Рассмотрение индивидуальных комплексов

Gln374 и Ser162-Ser171 - для UxuR). Таким обра-

гетеродимера с молекулой сахара позволяет опре-

зом, структура гетеродимера оставалась стабиль-

делить аминокислотные остатки, вовлеченные в

ной на протяжении всей траектории молекуляр-

такое взаимодействие. В UxuR такими остатками

но-динамической симуляции (рис. 2).

могут быть Gln8, Arg9, Gln12, Arg 19, Lys60, Arg67,

Структура комплекса гетеродимера UxuR-ExuR

Glu64, Arg66, Asp75, Asn76, Ser79, Gln80, Asn81,

с сахарами. Изучение распределения по поверх-

Asp83, Glu166, Arg169 и Ser171; в ExuR - Glu57,

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

МОДЕЛИРОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГЕТЕРОДИМЕРА UxuR-ExuR

893

Рис. 2. Наложение структур гетеродимера UxuR-ExuR, полученных на 50-й, 60-й, 90-й и 100-й наносекундах

молекулярно-динамической симуляции. Светло-серый цвет соответствует структуре 50 нс, темно-серый - 100 нс,

промежуточные варианты - 60 нс и 90 нс соответственно. (а), (б) - Структуры гетеродимера в двух проекциях,

развернутых на 90° относительно друг друга, N-конец белка находится слева; (в) - структура линкера, вид со стороны

С-концевого домена; (г) - структуры линкера, вид с боковой стороны белка, соответствует линкеру на рис. (б).

Glu63, Arg65, Lys66, Asn75, Arg78, Gln80, Glu88,

взаимодействие с сахарами, чем любая другая по-

Asn107, Gln145, Glu164, Arg170, Ser171 и Asn173.

верхность белка. По всей видимости, взаимодей-

ствие сахаров именно с этой областью будет ока-

Таким образом, предсказанное взаимодей-

зывать влияние на структуру гетеродимера UxuR-

ствие гетеродимера UxuR-ExuR с молекулами са-

ExuR.

харов происходило преимущественно на поверх-

ности, формируемой междоменными линкерами

Структура комплекса гетеродимера UxuR-ExuR

и пространственно прилегающими к ним поверх-

с фосфорилированными производными сахаров.

ностями первой и четвертой альфа-спиралей бел-

Помимо сахаров было изучено взаимодействие с

ков. Кроме этого, имело место взаимодействие

гетеродимером некоторых фосфорилированных

сахаров с некоторыми межспиральными неструк-

производных этих сахаров. Альфа-D-глюкозо-6-

турированными участками С-концевых доменов

обеих белков. Тем не менее линкерный участок

фосфат, фруктозо-6-фосфат и фруктозо-1,6-бис-

между доменами в большей степени вовлечен во

фосфат являются компонентами практически

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

894

ПУРТОВ и др.

Рис. 3. Распределение по поверхности гетеродимера UxuR-ExuR (структура с траекторией 100 нс) моделей D-глюко-

ната (а), D-глюкуроната (б) и D-галактуроната (в).

Таблица 1. Распределение итераций последовательного докинга лигандов сахаров на моделях гетеродимера,

полученных в результате молекулярно-динамической симуляции, с повышенным диапазоном изменения

значений аффинности (>0.5 ккал/мол)

50 нс

60 нс

90 нс

100 нс

Альфа-D-глюкоза

3 (1 ккал/мол)

1 (0.8 ккал/мол)

3 (0.7 ккал/мол)

D-глюконат

4 (0.6 ккал/мол)

8 (0.6 ккал/мол)

8 (0.9 ккал/мол)

6 (0.7 ккал/мол)

2 (0.8 ккал/мол)

2 (0.7 ккал/мол)

5 (0.6 ккал/мол)

4 (0.7ккал/мол)

4 (0.6 ккал/мол)

D-глюкуронат

1 (0.7 ккал/мол)

6 (0.7 ккал/мол)

8 (0.7 ккал/мол)

7 (0.8 ккал/мол)

10 (0.9 ккал/мол)

8 (0.7 ккал/мол)

5 (0.6 ккал/мол)

1 (0.8 ккал/мол)

1 (0.6 ккал/мол)

4 (0.6 ккал/мол)

D-галактуронат

6 (0.7 ккал/мол)

2 (0.9 ккал/мол)

7 (0.6 ккал/мол)

9 (0.6 ккал/мол)

9 (0.8 ккал/мол)

4 (0.8 ккал/мол)

9 (0.6 ккал/мол)

D-фруктуронат

4 (0.7 ккал/мол)

9 (0.6 ккал/мол)

10 (0.9 ккал/мол)

10 (0.7 ккал/мол)

Примечание. В скобках указан диапазон изменения значений аффинности для приведенных номеров итераций докинга.

Курсивом обозначены итерации со связыванием лиганда с UxuR, прямым шрифтом - с ExuR. Темно-серым цветом отмечены

итерации с размещением лиганда на С-концевом домене, кроме 1-й и 4-й альфа-спиралей; светло-серым - между

С-концевыми доменами; без окраски - на линкере и на 1-й и 4-й альфа-спиралях C-концевого домена.

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

МОДЕЛИРОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГЕТЕРОДИМЕРА UxuR-ExuR

895

Рис. 4. Распределение лигандов D-глюконата (а), D-глюкуроната (б) и D-галактуроната (в) на моделях гетеродимера,

полученное в результате молекулярно-динамической симуляции. Ориентация белка соответствует представленной на

рис. 3.

всех ферментативных циклов в клетке и также

Несмотря на то что фосфорилированные про-

могут взаимодействовать с поверхностью белка.

изводные сахаров, так же как и сами сахара, в ос-

новном связываются с областью междоменных

Распределение этих трех фосфорилированных

линкеров и прилегающими областями на С-кон-

производных сахаров по поверхности гетероди-

цевых доменах гетеродимера, их молекулы рас-

мера в целом воспроизводит распределение саха-

пределены более диффузно. Молекулы альфа-D-

ров. Наиболее предпочтительной оставалась

глюкоза-6-фосфата (157 Å²), фруктозы-6-фосфа-

поверхность, формируемая междоменными лин-

та (165 Å²) и фруктозы-1,6-бисфосфата (203 Å²)

керами белков. Однако распределялись фосфо-

несколько крупнее, чем молекулы рассмотрен-

рилированные производные более разреженно, и

бóльшая их часть взаимодействовала с другими

ных ранее сахаров (D-галактоуронат (127 Å²),

участками белковой поверхности, в основном с

D-глюкуронат (138 Å²), D-фруктуронат (127 Å²),

С-концевым доменом (рис. 5). Вариабельность

альфа-D-глюкоза (110 Å²)), что может затруднять

значений аффинности в большинстве случаев

их адаптацию к относительно подвижной поверх-

также не превышала 0.5 ккал/мол, но, как и в слу-

ности линкеров (рис. 6). Взаимодействие фосфо-

чае с сахарами, в некоторых итерациях докинга

рилированных производных сахаров происходит

для каждого фософрилированного производного

с теми же аминокислотными остатками в белках,

значения аффинности позволяют предполагать

что и при взаимодействии с простыми сахарами.

несколько большую специфичность связывания

Таким образом, фософрилированные производ-

лигандов для определенных участков поверхно-

ные сахаров сохраняют способность взаимодей-

сти белка.

ствовать с областью междоменных линкеров и

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

896

ПУРТОВ и др.

Таблица 2. Распределение итераций последовательного докинга лигандов фосфорилированных производных са-

харов на моделях гетеродимера, полученных в результате молекулярно-динамической симуляции, с повышен-

ным диапазоном изменения значений аффинности (>0.5 ккал/мол)

50 нс

60 нс

90 нс

100 нс

1 (0.6 ккал/мол)

2 (0.8 ккал/мол)

3 (0.6 ккал/мол)

Альфа-D-глюкоза-6

1 (0.6 ккал/мол)

3 (0.6 ккал/мол)

6 (0.6 ккал/мол)

7 (0.7 ккал/мол)

фосфат

9 (0.7 ккал/мол)

4 (0.8 ккал/мол)

9 (0.7 ккал/мол)

8 (0.8 ккал/мол)

10 (0.6 ккал/мол)

10 (0.7 ккал/мол)

2 (0.8 ккал/мол)

1 (0.8 ккал/мол)

1 (0.7 ккал/мол)

6 (1 ккал/мол)

2 (0.8 ккал/мол)

4 (0.8 ккал/мол)

5 (0.7 ккал/мол)

Фруктозо-6-фосфат

7 (0.6 ккал/мол)

4 (0.9 ккал/мол)

8 (0.8 ккал/мол)

7 (0.7 ккал/мол)

8 (0.6 ккал/мол)

7 (0.6 ккал/мол)

9 (0.7 ккал/мол)

9 (0.8 ккал/мол)

1 (0.6 ккал/мол)

Фруктозо-1,6-

8 (0.6 ккал/мол)

3 (0.6 ккал/мол)

бисфосфат

9 (0.7 ккал/мол)

8 (0.9 ккал/мол)

9 (0.7 ккал/мол)

Примечание. В скобках указан диапазон изменения значений аффинности для приведенных итераций докинга. Курсивом

обозначены итерации со связыванием лиганда с UxuR, прямым шрифтом - с ExuR. Светло-серым цветом отмечены итерации

с размещением лиганда между С-концевыми доменами; без окраски - на линкере и на 1-й и 4-й альфа-спиралях C-концевого

домена.

прилегающих областей на поверхности белков и,

высокой и варьируется незначительно. Однако в

тем самым, влиять на гетеродимер UxuR-ExuR.

случае некоторых сахаров (D-глюкуроната, D-га-

лактоуроната и, в меньшей степени, D-фруктуро-

ната) значения аффинности, полученные в ите-

ОБСУЖДЕНИЕ

рациях докинга, имеют более высокие значения.

Как ранее было показано, взаимодействие раз-

Молекулы D-глюконата распределены по по-

личных сахаров с димером UxuR и мономерами

верхности белка более диффузно, а в случае

UxuR и ExuR происходит примерно с одной и той

D-глюкозы специфичность взаимодействия не-

же областью на поверхности белка, включающей

высока. Для фосфорилированных производных

в себя линкер и прилегающие альфа-спирали С-

сахаров наблюдается аналогичная D-глюконату

концевого домена, и с невысокой аффинностью,

модель взаимодействия.

слабо варьирующей от сахара к сахару [17]. Кроме

Междоменные линкеры, как правило, являют-

того, D-фруктуронат, D-галактуронат и D-глю-

ся неструктурированными и лабильными участ-

куронат способны взаимодействовать с «карма-

ками белковой цепи. Несмотря на определенное

ном» на С-концевом домене UxuR, влияя тем са-

постоянство их структуры, она достаточно по-

мым на укладку альфа-спиралей в домене и,

движна, чтобы провоцировать изменение распре-

посредством этого, на конформацию междомен-

деления по нему лигандов (при докинге в струк-

ного линкера и ориентацию N-концевого домена

турах 50 нс, 60 нс, 90 нс и 100 нс). Аффинность са-

относительно С-концевого домена и ДНК-ми-

харов при этом также варьируется. Исходя из

шени.

степени их вовлеченности во взаимодействие с

В исследуемом в данной работе комплексе ге-

несколькими лигандами (рис. 4 и 6), междомен-

теродимера с лигандами складывается в целом

ные линкеры представляют собой некий ин-

схожая ситуация. Основной мишенью для всех

терфейс, несводимый к простому набору состав-

лигандов оказываются междоменные линкеры

ляющих его аминокислотных остатков. Вариа-

белков. Взаимодействие с «карманом» в С-конце-

тивность мест взаимодействия лигандов и

вом домене UxuR не происходит, что предполага-

вариативность аффинности такого взаимодей-

ет отсутствие у гетеродимера UxuR-ExuR способ-

ствия предполагает, что чем выше количество ли-

ности регулировать транскрипцию с генов-ми-

ганда, тем выше шанс для него «встретиться» с

шеней UxuR. Аффинность взаимодействия

линкерами, находящимися в «нужной» конфор-

гетеродимера к лигандам остается в основном не-

мации.

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

898

ПУРТОВ и др.

Рис. 6. Распределение лигандов альфа-D-глюкозы (а), фруктозо-6-фосфата (б) и фруктозо-1,6-бисфосфата (в) на моделях

гетеродимера, полученных в результате молекулярно-динамической симуляции. Ориентация белка соответствует

представленной на рис. 5.

ции доменов относительно друг друга. В результа-

UxuR. Вероятность зафиксировать короткоживу-

те более стабильные комплексы гетеродимеров

щую «нужную» конформацию линкера, которая

UxuR-ExuR с глюкуронатом будут накапливать-

необходима для образования стабильного ком-

ся, а количество мономеров UxuR, способных

плекса с лигандом (или с несколькими молекула-

формировать гомодимер, будет уменьшаться, что

ми лиганда), выше при относительно высоком

снизит репрессию регулона UxuR.

количестве лиганда в среде (D-глюкуроната и,

Возможно, D-галактуронат будет взаимодей-

возможно, D-галактуроната). Мы предполагаем,

ствовать с гетеродимером UxuR-ExuR похожим

что таким образом может осуществляться баланс

образом, с проявлением аналогичного влияния

между репрессией генов ферментов пути Эшвел-

на активность UxuR как транскрипционного

ла и количеством субстрата в среде.

фактора. В пользу этого свидетельствует сходство

предсказываемых для него комплексов с гетеро-

димером с комплексами гетеродимера с D-глю-

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

куронатом. Вариабельность интерфейса на лин-

кере позволяет предположить концентрационно-

Работа выполнена при финанcовой поддеpжке

зависимый от глюкуроната характер регуляции

Pоccийcкого научного фонда (гpант № 18-14-

транскрипционной активности генов регулона

00322.

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

МОДЕЛИРОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГЕТЕРОДИМЕРА UxuR-ExuR

899

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

11. S. Rigali, A. Derouaux, F. Giannotta, and J. Dusart, J.

Biol. Chem. 277, 12507 (2002).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

12. L. Aravind, V. Anantharaman, S. Balaji, et al., FEMS

интересов.

Microbiol. Rev. 29, 231 (2005).

13. D. Jain, IUBMB Life 67, 556 (2015).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

14. C. B. Utz, A. B. Nguyen, D. J. Smalley, et al., J. Bacte-

Настоящая работа не содержит описания ис-

riol. 186, 7690 (2004).

следований с использованием людей и животных

15. M. N. Tutukina, A. V. Potapova, P. K. Vlasov, et al., J.

в качестве объектов.

Biomol. Struct. Dyn. 34, 2296 (2016).

16. M. N. Tutukina, A. V. Potapova, J. A. Cole, and

O. N. Ozoline, Microbiology 162, 1220 (2016).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

17. Ю. А. Пуртов, М. Н. Тутукина, А. Д. Никулин и

1. S. B. Fillenberg, F. C. Grau, G. Seidel, and

О. Н. Озолинь, Биофизика 64, 61 (2019).

Y. A. Muller, Nucl. Acids Res. 43, 1283 (2015).

18. N. M. O’Boyle, M. Banck, C. A. James, et al., J.

2. K. Miyazono, N. Tabei, S. Morita, et al., J. Bacteriol.

Cheminform. 3, 33 (2011).

194, 607 (2012).

19. M. D. Hanwell, D. E. Curtis, D. C. Lonie, et al., J.

3. F. Jacob and J. Monod, J. Mol. Biol. 3, 318 (1961).

Cheminform. 4, 17 (2012).

4. S. E. Bondos, L. Swint-Kruse, and K. S. Matthews, J.

20. A. Waterhouse, M. Bertoni, S. Bienert, et al., Nucl. Ac-

Biol. Chem. 290, 24669 (2015).

ids Res. 46, W296 (2018).

5. M. A. Schumacher, G. S. Allen, M. Diel, et al., Cell

21. M. S. Little, S. J. Pellock, W. G. Walton, et al., Proc.

118, 731 (2004).

Natl. Acad. Sci. USA 115, E152 (2018).

6. C. G. Kalodimos, Science 305, 386-389 (2004).

22. N. Guex and M. C. Peitsch, Electrophoresis 18, 2714

7. M. Lewis, G. Chang, N. C. Horton, et al., Science 271,

1247 (1996).

(1997).

8. R. Portalier, J. Robert-Baudouy, and F. Stoeber, J.

23. M. S. Friedrichs, P. Eastman, V. Vaidyanathan, et al., J.

Bacteriol. 143, 1095 (1980).

Comput. Chem. 30, 864 (2009).

9. P. Ritzenthaler, M. Mata-Gilsinger, and F. Stoeber, J.

24. O. Trott and A. J. Olson, J. Comput. Chem. 31, 455

Bacteriol. 143, 1116 (1980).

(2009).

10. D. A. Rodionov, A. A. Mironov, A. B. Rakhmaninova,

25. G. M. Morris, R. Huey, W. Lindstrom, et al., J. Com-

and M. S. Gelfand, Mol. Microbiol. 38, 673 (2000).

put. Chem. 30, 2785 (2009).

Modeling the Interaction of the UxuR-ExuR Heterodimer with the Components

of the Metabolic Pathway for Hexuronate Utilization in Escherichia coli

Y.A. Purtov*^, **, S.V. Tishchenko*, and A.D. Nikulin*

* Institute of Protein Research, Russian Academy of Sciences, Institutskaya ul. 4, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

**Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

The UxuR transcription factor is a repressor for a number of genes of the hexuronate catabolism. This protein

can form heterodimers with its paralogous ExuR protein, leading to activation of repressed UxuR genes in the

presence of glucuronate. Previously, when sequential molecular docking was done with the flexible receptor,

it was predicted that sugars bind to the interdomain linkers UxuR and ExuR, affecting the mutual arrange-

ment of the protein domains. Similar calculations for the models of the UxuR-ExuR heterodimer, corre-

sponding to four points of its molecular dynamics simulation, also predict the binding of sugars to interdo-

main linkers. Changes in protein conformation modulate the location and degree of affinity of this interac-

tion. A new hypothesis argues that UxuR-ExuR-glucuronate complexes become more stable with increased

binding affinity to some conformations of protein interdomain linkers. This may lead to a decrease in the

number of free monomers and, therefore, UxuR homodimers in the presence of these sugars, and relieves the

UxuR-mediated repression of its regulon.

Keywords: UxuR-ExuR heterodimer, transcription regulation, hexuronates, flexible molecular docking, protein

conformational changes

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021