БИОФИЗИКА, 2021, том 66, № 5, с. 937-944

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 577.3

ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА В ЭРИТРОЦИТЕ

ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ПАРЦИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ КИСЛОРОДА

*Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова,

119892, Москва, Ленинские горы, 1/12

**Национальный исследовательский технологический университет «МИСиС»,

119049, Москва, Ленинский просп., 4

E-mail: gmaksimov@mail.ru

Поступила в редакцию 17.02.2021 г.

После доработки 11.03.2021 г.

Принята к публикации 15.03.2021 г.

С помощью спектроскопии комбинационного рассеяния исследовали изменения конформация ге-

ма и глобина гемоглобина при варьировании рО₂ в среде инкубации эритроцитов и гемоглобина.

При изменении pO₂, в спектрах комбинационного рассеяния гемоглобина в эритроците и в раство-

ре наблюдаются изменения ряда характерных полос как в области 1000-1700 см^-1 (валентные коле-

бания гема), так и в высокочастотной области спектра (2800-3000 см^-1, валентные колебания ами-

нокислот глобина). Установлено, что зависимость степени оксигенации гемоглобина (sO₂), рассчи-

танной из параметров спектра комбинационного рассеяния, характеризуется S-образной кривой

только для гемоглобина в эритроците. Установлено, что различия в конформация гема при измене-

нии рО₂ меняют его способность образовывать и комплексы с NO. При увеличении рО₂ изменения

конформация гема гемоглобина в клетке сопровождаются увеличением вклада боковых -СН₃-

групп колебаний полуколец пиррола и групповых колебания связей полуколец пиррола, а конфор-

мации глобина гемоглобина обусловлено увеличением вклада колебаний Н-метиновых групп и

симметричных концевых метиленовых групп аминокислот.

Ключевые слова: рамановская спектроскопия, гемоглобин, эритроцит, рО₂.

DOI: 10.31857/S0006302921050112

разующийся при активации карбоангидразы, пе-

Известно, что связь между рН, CO₂ и срод-

ством гемоглобина (Гб) к O₂ в эритроците описы-

реносится из эритроцитов в обмен на Cl^- белком

полосы 3 (БП3). Координация между активно-

вается эффектом Бора: снижение рH в суспензии

стью карбоангидразы и БП3 осуществляется в

эритроцитов приводит к уменьшению сродства

мембране эритроцита: карбоангидраза связана с

Гб к кислороду и увеличению P₅₀ [1, 2]. Этот эф-

C-концевым доменом БП3, который обеспечива-

фект характеризует усиление диссоциации Гб и

O₂ в эритроците при увеличении рCO₂ до 40 мм

ет транспорт HCO_3-/Cl^-. Поскольку в каждом

рт. ст. (смесь растворенного газа (5%), бикарбо-

эритроците содержится около миллиона БП3, об-

мен происходит быстро и завершается на 90% в

ната (H⁺ и HCO₃, 80-90%) и карбоната гемогло-

течение 0.4-0.5 с [3, 4].

бина (5-13%). Как и O₂, CO₂ легко диффундирует

через мембрану эритроцита и переводится карбо-

В капиллярах легких Т-форма Гб (без связан-

ангидразой в HCO_3- и H⁺. Образующиеся ионы

ного O₂) характеризуется высоким сродством к

O₂ и связывание O₂с Гб (R-форма) осуществляет-

H⁺ могут связываться с остатками гистидина в

глобине, снижая его сродство к O₂ (T-форма).

ся благодаря конформационным изменениям Гб.

Об этом свидетельствует и тот факт, что глобин, у

Кроме того, снижение внутриклеточного pH сти-

которого аланин в «гемовом кармане» заменен на

мулирует синтез 2,3-дифосфоглицерата, что допол-

аспартат, обладает более низким сродством к O₂,

нительно уменьшает сродство Гб к O₂. HCO_3-, об-

так как отрицательный заряд карбоксильной

группы препятствует формированию комплекса

Сокращения: Гб - гемоглобин, БП3 - белок полосы 3,

«атом железа

- супероксид-анион». Анализ

дГб - дезоксигемоглобин, КР - комбинационное рассея-

ние, оГб - оксигемоглобин.

структуры Гб свидетельствует о том, что в процес-

937

938

СЛАТИНСКАЯ и др.

се связывания O₂ существенную роль играют

(смесь А: азот и 0.04% СО₂ (ООО «ПГС-сервис»,

факторы, обусловленные как изменением длины

Россия)) над средой инкубации с объектом иссле-

связей Fe-N гема, так и ограничениями локали-

дования (объем пробы 2 мл (Ht = 40%) в течение

зации O₂в участке связывания [5].

20 мин) при постоянном перемешивании (при

18-21°С, скорость потока газовой смеси

0.1

Отметим, что у позвоночных способность Гб

л/мин) [17, 18]. При формировании смеси с требу-

переносить O₂регулируется дополнительно кле-

емым парциальным давлением кислорода (смесь

точными процессами: как за счет активности пе-

Б) внутри герметичного бокса проводили смеши-

реносчиков ионов (например, Na⁺/Н⁺-обмен-

вание определенных долей смеси А и кислорода

ник), контролирующим внутриклеточный рН и

(рО₂ контролировали при помощи электрода КЕ-

объем клеток [6-9], так и за счет обратимого свя-

25 (Figaro Engineering Inc., Япония)). Все манипу-

зывания дезоксигемоглобина (дГб) эритроцита с

ляции при заполнении капилляров осуществляли

компонентами цитоскелета (БП3) [10-12]. Ранее

в герметичном боксе при постоянной подаче га-

с помощью метода комбинационного рассеяния

зовой смеси Б с требуемым уровнем рО₂. Для это-

(КР) было установлено, что изменения конфор-

го внутри герметичного бокса образец помещали

мации гема и глобина как в цельной крови и вы-

в предварительно продутые в течение 2 мин сме-

деленных эритроцитах, так и, собственно, моле-

сью Б стеклянные капилляры (диаметр попереч-

кул гемоглобина могут быть различными в норме

ного сечения 1 мм, ООО «Агат-Мед», Россия).

и при патологии [13]. Очевидно, что изменения

Для нормализации избыточного давления смеси

конформации Гб в клетке обусловлены различ-

Б в боксе применяли воздушный клапан с поро-

ным рО₂ (гипоксия). Однако исследований, сви-

гом срабатывания около 1 атм. В качестве контро-

детельствующих об изменениях конформации ге-

ля использовали суспензию эритроцитов и Гб,

ма и глобина непосредственно в нативном эрит-

приготовленные в тех же условиях, но вместо бес-

роците при разном парциальном давления

кислородной газовой смеси А использовали воз-

кислорода в среде инкубации (рО₂), явно недо-

дух. После заполнения капилляры герметично за-

статочно [4, 6, 14-17].

паивали и хранили при температуре 4°С не

Задачей данной работы было исследование из-

более 3 ч.

менений конформации Гб (гем и глобин) в эрит-

Используемые в работе параметры вытесне-

роците и Гб в растворе при различном рО₂.

ния кислорода позволяют получить пробы сус-

пензии эритроцитов и раствора гемоглобина в со-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

стоянии нормобарической гипоксии, поскольку

после вытеснения О₂в пробах увеличивалась до-

Объектом исследования служила кровь здоро-

ля дГб (определяли путем регистрации и анализа

вых доноров (n = 10, возраст 20-40 лет), которую

спектров КР, методику см. ниже).

отбирали из кубитальной вены в вакуумные про-

бирки Vacuette (Greiner Bio-One, Австрия) и хра-

Исследование конформации гема и глобина ге-

нили при 4°С. В качестве антикоагулянта исполь-

моглобина проводили методом спектроскопии

зовали гепарин (20-50 Ед/мл крови). Фракцию

комбинационного рассеяния. Спектры КР реги-

эритроцитов получали с помощью центрифуги-

стрировали с помощью конфокального микро-

рования при 1500 g в течение 10 мин при 4°С

скоп-спектрометра NTEGRA-SPECTRA (NT-

(Laborfuge 400R, Heraeus, Германия). Осадок три-

MDT, Россия) в диапазоне 1000-3000 см^-1 с ша-

жды отмывали в буфере (145 мМ NaCl, 5 мМ KCl,

4 мM Na₂HPO₄, 1 мM NaH₂PO₄, 1 мМ MgSO₄,

гом измерения 0.8 см^-1, регистратор — ССD-де-

тектор с Пельтье-охлаждением до температуры -

5 мМ глюкозы (Sigma, США), рН 7.4). Суспензию

50°С (объектив 5× с апертурой 0.15, решетка

эритроцитов (Ht = 40%) хранили при 4°С и ис-

600 штр/мм), мощность лазера на образце состав-

пользовали в эксперименте в течение трех часов

ляла не более 3 мВт, длина волны возбуждения -

после выделения. Гемоглобин выделяли из эрит-

532 нм, время регистрации одного спектра - 10 с,

роцитов при инкубации клеток в буфере (4 мM

количество накоплений сигнала - 3. Количество

Na₂HPO₄, 1 мM NaH₂PO₄, рН 7.4) в соотношении

повторов для каждого эксперимента (образец при

1:10 (гемолиз) с последующим удалением клеточ-

заданном парциальном давлении кислорода) -

ных мембран центрифугированием в течение

12. Обработка спектров включала в себя вычита-

10 мин при 6000 g и 4°С. Концентрацию гемогло-

ние базовой линии и сглаживание спектров в

бина (далее - раствор Гб) определяли спектрофо-

программе Origin2017 (OriginLab Corp., США).

тометрическим методом (длина волны 415 нм) с

помощью спектрофотометра Hitachi 557 (Япо-

Для оценки изменений конформации гема и

ния).

глобина молекулы Гб использовали величины со-

Изменение содержания кислорода в пробе про-

отношений интенсивностей характерных полос

водили с помощью продувки газовой смесью

спектра КР [18-23]:

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА

939

1. I₁₃₇₅/I₁₁₂₇ - вклад колебаний боковых -СН₃-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

групп полуколец пиррола в гемопорфирине, вы-

В ходе исследования установлено, что при из-

раженных при изменении конформации глобина

менении pO₂ в спектрах КР Гб в эритроците и в

в непосредственной близости от гема; соотноше-

растворе наблюдаются изменения ряда характер-

ние характеризует выраженность симметричных

и ассиметричных колебаний пиррольных полуко-

ных полос как в области 1000-1700 см^-1 (валент-

лец (изменение величины характеризует переход

ные колебания гема), так и в высокочастотной

конформации Гб из T-формы (дГб) в R-форму

области спектра 2800-3000 см^-1 (валентные ко-

(оксигемоглобин, оГб). Как правило, чем выше

лебания аминокислот глобина (рис. 1). При уве-

данное отношение, тем выше вероятность нахож-

личении pO₂ (в диапазоне от 5.0 до 159.6 мм

дения гема в R-форме;

рт. ст.) в гемопорфирине Гб (как в клетке, так и в

2. I₁₃₇₅/I₁₁₇₂ - вклад ассиметричных и симмет-

растворе) меняется амплитуда полос 1355 см^-1,

ричных колебаний пиррольных колец в гемопор-

1375 см^-1, 1552 см^-1и 1640 см^-1 КР спектра, а так-

фирине; величина отношения зависит от воздей-

же выявлено смещение полосы 1620 см^-1 КР-

ствия на гем белкового окружения глобина, а так-

спектра к 1585 см^-1. Этот результат свидетель-

же от изменений пирролов в геме;

ствует об изменениях конформации гема Гб при

3. (I₁₃₅₅/I₁₅₅₀)/(I₁₃₇₅/I₁₅₈₀) - вклад связей сим-

связывании О₂ (рис. 1а) [21, 22, 25]. В аналогич-

метричных колебаний пиррольных колец (связи

ных условиях эксперимента выявлены измене-

СаСb, СaN и СaNСa) в молекулах дГб (1355 и

ния интенсивности полос в высокочастотной об-

1580 см^-1) и Гб, связанного с лигандами (1375 см^-1

ласти КР-спектра 2800-3000 см^-1 (2850 см^-1,

и 1550 см^-1). Данное соотношение характеризует

2880 см^-1 и 2930 см^-1), свидетельствующие об из-

способность Гб выделять лиганды;

менениях конформации глобина Гб и сопровож-

дающие связывание О₂ (рис. 1б). Установлено,

4. I₁₆₄₀/I₁₃₇₅ - характеризует выраженность ко-

что зависимость степени оксигенации Гб (sO₂),

лебаний метиновых мостиков по отношению к

рассчитанной из параметров спектра КР (см. раз-

симметричным колебаниям пиррольных колец

дел «Материалы и методы»), характеризуется

гема;

S-образной кривой только для гемоглобина в

5. I₁₅₈₀/I₁₅₅₀ - вклад колебаний метиновых мо-

эритроците (рис. 1в).

стиков между пирролами в гемопорфирине, вы-

Как отмечалось выше, соотношения интен-

раженных при деформации макроцикла (характе-

сивности полос КР-спектра характеризуют вклад

ризует сродство Гб к лигандам, в частности к O₂);

различных связей молекулы в изменение кон-

формации Гб [13, 17, 19]. Из сравнения зависимо-

6. I₁₆₁₈/I₁₅₈₀

- вклад валентных колебаний

сти сатурации Гб О₂ от рО₂ в крови (рис. 2, точеч-

(C₁C₂) винильных групп к CaCmH, колебаниям

ная кривая [14]), с изменениями соотношения

метиновых мостиков, характеризующие относи-

интенсивностей полос КР-спектра, характеризу-

тельное число комплексов гемоглобина с NO

ющими конформацию гема (I₁₃₇₅/(I₁₃₅₅ + I₁₃₇₅),

(комплекс Гб-NO(I));

вклад боковых СН₃- групп колебаний полуколец

7. I₂₈₅₀/I₂₈₈₀ - вклад симметричных колебаний

пиррола гема (I₁₃₇₅/I₁₁₂₇) и связей полуколец пир-

метиленовых групп -СН аминокислот глобина;

рола в геме (I₁₃₇₅/I₁₁₇₂), а также вклад валентных

колебаний винильных групп гемопорфирина

8. I₂₉₃₀/I₂₈₅₀ - вклад колебаний симметричных

(I₁₅₅₀/I₁₅₈₀) следует, что конформация гема раз-

концевых метиленовых групп аминокислот гло-

лична в области 0-15 мм рт. ст. («лаг-период»), в

бина;

области 15-60 мм рт. ст. («линейная зависи-

мость») и в области 70-120 мм рт. ст. («насыще-

9. I₂₈₈₀/I₂₉₃₀ - вклад колебаний Н-метиновых

ние») (рис. 2а-г).

групп аминокислот глобина.

В области «линейной зависимости» конфор-

В качестве маркера, свидетельствующего о

мация гема (I₁₃₇₅/(I₁₃₅₅ + I₁₃₇₅) в эритроцитах и

полном вытеснении кислорода из пробы (увели-

растворе Гб различны (рис. 2а): связывание О₂ге-

чение доли дГб), использовали эффект отсут-

мом Гб в растворе происходит медленнее, чем

ствия в КР-спектре полосы 1375 см^-1 и появление

связывание О₂Гб в эритроците. Установлено, что

полосы 1355 см^-1. Степень оксигенации эритро-

в аналогичных условиях (в области 25-120 мм

цитов (sO₂) рассчитывали из спектров КР по фор-

рт.ст.) вклад в изменение конформации гема Гб

муле: sO₂= 203х - 38, где х - величина соотноше-

боковых -СН₃-групп колебаний полуколец пир-

ния I₁₅₈₅/(I₁₅₈₅ + I₁₅₅₂) [23, 24].

рола гема (рис. 2б) и групповых колебаний связей

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

940

СЛАТИНСКАЯ и др.

Рис. 1. Зависимости величины интенсивности КР эритроцитов (а) и раствора гемоглобина (б) от величины

парциального давления кислорода (величина давления указана на рисунке в подписях к спектрам). Пики 1585 и

1640 см^-1 характеризуют колебания метиновых мостиков, пики 1335 и 1375 см^-1 - симметричные колебания

пиррольных колец; пик 1127 см^-1 характеризует колебание метильных радикалов, пик 1172 см^-1 характеризует

асимметричные колебания пиррольных колец. Спектры нормированы на величину максимума полос 1500-1600 см^-1.

(в) - Зависимость sO₂ от величины парциального давления кислорода: квадраты - суспензия эритроцитов, кружки -

гемоглобин.

полуколец пиррола в геме более выражен для Гб в

при увеличении рО₂конформация гема, характе-

эритроците, чем для Гб в растворе (рис. 2в). При

ризующая сродство Гб к NO, меняется различно:

увеличении рО₂ до 60 мм рт. ст. вклад валентных

уменьшается вклада колебаний (C₁C₂) виниль-

колебаний винильных групп (I₁₅₅₀/I₁₅₈₀) в изме-

ных групп по сравнению с CaCmH колебаниями

нение конформации гема более выражен для Гб в

метиновых мостиков (I₁₆₁₈/I₁₅₈₀) у Гб в клетке, и

клетке (рис. 2г).

этот параметр увеличивается у Гб в растворе

(рис. 3б). Этот результат свидетельствует о том,

В спектре КР гема выявлены полосы, измене-

что различия в конформация гема при изменении

ние соотношения которых свидетельствует о раз-

рО₂ меняют его способность образовывать и ком-

личном сродстве к лигандам (в данном случае к

плексы с NO [26, 27].

О₂ (I₁₃₅₅/I₁₅₅₀)/(I₁₃₇₅/I₁₅₈₀)) и сродству к NO

(I₁₆₁₈/I₁₅₈₀). Установлено, что при увеличении

В следующей серии экспериментов исследова-

ли изменения конформации глобина (валентные

рО₂ сродство Гб к лигандам и к NO меняется раз-

колебания аминокислот глобина) при увеличе-

лично (рис. 3а,б). Так, конформация гема, харак-

нии рО₂. Регистрация КР в высокочастотной об-

теризующая сродство к лигандам, снижается и

меняется аналогично как для гема Гб в эритроци-

ласти спектра (2800-3000 см^-1) свидетельствует о

те, так и для Гб в растворе (рис. 3а). Отметим, что

том, что вклад симметричных колебаний СН-ме-

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА

941

Рис. 2. Изменения величин соотношений интенсивностей полос КР-спектра в зависимости от рО₂ для суспензии

эритроцитов (черные квадраты) и раствора Гб (Гб, серые квадраты): (а) - относительное число комплексов оГб, (б) -

вклад боковых -СН₃-групп колебаний полуколец пиррола гема, (в) - групповые колебания связей полуколец

пиррола в геме, (г) - вклад валентных колебаний винильных групп гема. Точечные кривые - зависимости сатурации

О₂ от рО₂ в крови [14]; * - статистически значимое различие от полностью дезоксигенированной формы Гб. Данные

представлены в виде среднего значения ± ошибка среднего.

тиленовых групп аминокислот (I₂₈₅₀/I₂₈₈₀) у Гб в

Итак, при изменении рО₂ конформация гема и

эритроците не меняется и обратимо снижается у

глобина меняется различно при локализации Гб в

Гб в растворе, свидетельствуя, вероятно, об обра-

растворе и в клетке. Известно, что у дГб двухва-

тимых изменениях плотности упаковки амино-

лентный атом железа находится в высокоспино-

вом, пятикоординированном состоянии и сме-

кислот (рис. 3в). В аналогичных условиях вклад

щен от плоскости порфиринового макроцикла

колебаний Н-метиновых групп аминокислот

(«куполообразная» форма). При связывании О₂

(I₂₈₈₀/I₂₉₃₀) Гб в растворе снижается, а в Гб эрит-

атом железа остается двухвалентным, но перехо-

роцитов выявлен максимум при 40-50 мм рт. ст.

дит в низкоспиновое, шестикоординированное

(рис. 3г). При увеличении рО₂вклад симметрич-

состояние, при этом длина связи Fe-N уменьша-

ных концевых метиленовых групп аминокислот

ется от 2.06 до 1.98 Å, а порфириновый макро-

(I₂₉₃₀/I₂₈₅₀) глобина Гб в растворе не меняется, но

цикл характеризуется «плоской» формой [28]. У

возрастает у Гб в эритроците (рис. 3д). Возможно,

оГб проксимальные гистидины смещены на 0.5-

в этих условиях (область «линейной зависимо-

0.6 Å ближе к плоскостям макроцикла, чем в дГб.

сти») у глобина эритроцита происходит конфор-

При потере связанного с атомом железа H₂O и

мационный переход как за счет изменения упоря-

восстановлении атома железа Гб до трехвалент-

доченности, так и полярного окружения амино-

ного железа в R-форме Гб атом железа смещается

кислот белка (рис. 3г,д).

от плоскости порфиринового макроцикла на

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

942

СЛАТИНСКАЯ и др.

Рис. 3. (а) - Сродство Гб к лигандам (в первую очередь, к О₂); (б) - относительное число комплексов гемоглобина с

NO(I); (в) - отношение симметричных колебаний -СН метиленовых групп аминокислот к несимметричным колеба-

ниям; (г) - вклад колебаний Н метиновых групп аминокислот, определяется конформационной подвижностью; (д) -

отношение вклада колебаний симметричных концевых метиленовых групп к симметричным колебаниям метилено-

вых групп аминокислот; (е) - колебания метиновых мостиков гема, соотношение интенсивности полос спектра КР

I₁₆₄₀/I₁₃₇₅ обратно пропорционально степени скручивания гема. * - Статистически значимое различие от полностью

дезоксигенированной формы Гб. Данные представлены в виде среднего значения ± ошибка среднего.

0.2 Å, и порфирины приобретают «куполообраз-

вклад боковых -СН₃-групп колебаний полуколец

ную» форму. Нами установлено, что при связыва-

пиррола гема (рис. 2б) и групповые колебания свя-

нии О₂ (область «линейной зависимости») кон-

зей полуколец пиррола в геме (рис. 2в) в изменении

формация гема (I₁₃₇₅/(I₁₃₅₅ + I₁₃₇₅) в эритроцитах

конформации гема Гб более выражены для Гб в

эритроците, чем Гб в растворе.

и растворе Гб различны: связывание О2 гемом Гб в

растворе происходит менее выражено, чем связыва-

Известно, что в цитохроме с гемы могут нахо-

ние О₂Гб в эритроците (рис. 2а). Установлено, что диться в разных конформациях: «плоской, скру-

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА

943

ченной, куполообразной, седловидной» и т.д. В

ре), другая, что и способствует более эффектив-

цитохроме с «скрученная» конформация гема

ному перераспределению О₂ в «высококонцен-

снижает эффективность переноса электронов

трированном гемоглобиновом окружении» в

[29]. Вероятно, гем находится в «скрученной»

цитоплазме [33-35]. Вероятно, изменение кон-

конформации, когда пиррольные кольца повер-

формация гема является важным фактором эф-

нуты в разные стороны относительно оси Fe-N.

фективного переноса О₂ как между молекулами

Известно, что полоса 1640 см^-1 спектра КР гема

оГб и дГб при связывании Гб с БПЗ в плазматиче-

характеризует колебания метиновых мостиков

ской мембране, так и при формировании олиго-

гема: в «плоской» конформации вероятность ко-

мерных структур («кластеров») Гб в цитоплазме

лебаний метиновых мостиков велика, тогда как в

клетки, способствующих изменению конформа-

«скрученной» конформации эти колебания за-

ции гема дГб и «эстафетной» передаче О₂ от оГб.

труднены; чем более выражен пик 1640 см^-1, тем

в более «плоской» конформации находится гем

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

[30]. В связи с этим соотношения интенсивности

полос спектра КР I₁₆₄₀/I₁₃₇₅ и I₁₁₇₂/I₁₃₇₅ гема ци-

Исследование выполнено при финансовой

тохрома с должны быть обратно пропорциональ-

поддержке Российского фонда фундаментальных

ны степени «скручивания» гема и чем больше ве-

исследований (грант № 20-34-90073, для С.О.В.)

личина этих соотношений, тем в более «плоской»

и Российского научного фонда (грант № 19-79-

конформации находится гем. В наших экспери-

30062, для М.Г.В.), а также Междисциплинарной

ментах установлено, что при увеличении рО₂ пе-

научно-образовательной школы Московского

реход от «плоской» конформации гема к «скру-

университета «Молекулярные технологии живых

ченной» конформации более выражен для Гб в

систем и синтетическая биология».

растворе, чем для Гб в клетке (рис. 3е).

Отметим, что обнаруженные изменения кон-

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

формации гема сопровождаются различиями в

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

конформации глобина Гб как в клетке, так и рас-

интересов.

творе. Известно, что при переходе из дГб в оГб

конформационные изменения передаются гло-

бину как за счет проксимальных гистидинов бел-

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

ка, так и прилегающих к ним аминокислотных

остатках молекулы белка (Gl-4, H18-21 и HCl-3)

Исследование проведено в соответствии с эти-

[31]. При связывании О₂с атомом железа порфи-

ческим кодексом Всемирной медицинской ассо-

циации для экспериментов с участием человека и

риновый макроцикл гема принимает плоскую

одобрено этическим комитетом биологического

форму и поворачивается по часовой стрелке на

факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.

10°, что меняет конформацию глобина за счет

расположения ряда аминокислот (например, Leu

FG3 и Val FG5). В Т-форме аминокислоты (на-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

пример, Val) блокируют сайт связывания О₂ с

1. P. Hilpert, R. G. Fleischmann, D. Kempe, et al., Am.

атомом железа, а в R-форме это препятствие

J. Physiol. 205 (2), 337 (1963).

устраняется за счет сдвига спиралей D и E и сег-

мента CD. В Т-форме N- и С-концы глобина об-

2. M. Berenbrink, Respiratory Physiol. Neurobiol. 154

разуют водородные связи, а в R-форме эти водо-

(1-2), 165 (2006).

родные связи разорваны, концевые остатки более

3. B. F. Verigo, Archiv für die gesammte Physiologie des

подвижны и их pK_as падает при увеличении рО₂

Menschen und der Thiere 51, 321 (1892).

[28]. Нами установлено, что в клетке при увеличе-

4. Ch. Bohr, K. Hasselbalch, and A. Krog, Skand. Arch.

нии рО₂ изменения конформации глобина Гб

Physiol. 16, 401 (1904).

обусловлены увеличением вклада колебаний

5. M. F. Perutz, Annu. Rev. Biochem. 48, 327 (1979).

Н-метиновых групп аминокислот (рис. 3г) и сим-

метричных концевых метиленовых групп

6. F. B. Jensen, Acta Physiol. Scand. 182 (3), 215 (2004).

(рис. 3д). В растворе при увеличении рО₂ измене-

7. M. I. Nikinmaa, Physiol. Rev. 72 (2), 301 (1992).

ния конформации глобина Гб обусловлены обра-

8. B. Berenbrink, M. Berenbrink, and Ch. Bridges, J. Exp.

тимым снижением вклада симметричных колеба-

Biol. 192 (1), 253 (1994).

ний СН-метиленовых групп аминокислот

(рис. 3в) и колебаниям Н-метиновых групп ами-

9. M. Berenbrink, P. Koldkjær, O. Kepp, et al., Science

нокислот Гб (рис. 3г).

307 (5716), 1752 (2005).

По-видимому, конформация гема Гб, локали-

10. R. Motais, F. Garcia-Romeu, and F. Borgese, J. Gen.

зованного в цитоплазме (в отличие от Гб в раство-

Physiol. 90 (2), 197 (1987).

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

944

СЛАТИНСКАЯ и др.

11. P. Giardina, V. Aurilia, R. Cannio, et al., Eur. J. Bio-

24. B. R. Wood, P. Caspers, G. J. Puppels, et al., Anal.

chem. 235 (3), 508 (1996).

Bioanal. Chem. 387 (5), 1691 (2007).

12. N. Barvitenko, N. Adragna, and R. Weber, Cell. Physi-

25. I. P. Torres Filho, J. Terner, R. N. Pittman, et al., Am.

ol. Biochem. 15 (1-4), 1 (2005).

J. Physiol. - Heart Circ. Physiol. 289, 488 (2005).

13. O. V. Slatinskaya, O. G. Luneva, and L. I. Deev, Bio-

26. G. Chottard and D. Mansuy, Biochem. Biophys. Res.

physics 65 (2), 213 (2020).

Commun. 77 (4), 1333 (1977).

14. 14. J. T. Edsall, J. Hist. Biol. 5 (2), 205 (1972).

27. A. Szabo and L. D. Barron, J. Am. Chem. Soc. 97 (3),

15. B. Wranne, R. D. Woodson, and J. C. Detter, J. Appl.

660 (1975).

Physiol. 32 (6), 749 (1972).

28. G. Louie, T. Tran, J. I. Englander, and S. W. En-

16. J. B. West, Am. J. Physiol. - Lung Cell. Mol. Physiol.

glander, Mol. BioI. 201, 755 (1988).

316 (4), 585, (2019).

29. Y. Sun, A. Benabbas, W. Zeng, et al. Proc. Natl Acad.

17. C. Bohr and K. Hasselbalch, Skand. Arch. Physiol. 16,

Sci. USA 111 (18), 6570 (2014).

402 (1904).

30. R. V. Chertkova, N. A. Brazhe, T. V. Bryantseva, et al.,

18. S. V. Sidorenko, R. H. Ziganshin, O. G. Luneva, et al.,

PLoS One 12 (5), e0178280 (2017).

J. Proteomics 184, 25 (2018).

31. R. Liddington, Z. Derewenda, G. Dodson, and

19. N. A. Brazhe, S. Abdali, A. R. Brazhe, et al., Biophys.

D. Harris Nature 331, 725 (1988).

J. 97 (12), 3206 (2009).

32. A. Klug, F. Kreuzer, and F. J. W. Roughton, Physiol.

20. S. C. Goheen, L. J. Lis, O. Kucuk, et al., J. Raman

Acta 14, 121 (1956).

Spectroscopy 24 (9), 275 (1993).

33. R. Zander and H. Schmid-Schoenbien, Respir. Physi-

21. I. P. Torres Filho, J. Terner, R. N. Pittman, et al., J,

ol. 19, 279 (1973).

Appl. Physiol. 104 (6), 1809 (2008).

22. B. R. Wood, L. Hammer, and D. McNaughton, Vibra-

34. K. D. Vandegriff and J. S. Olson, J. Biol. Chem. 259,

tional Spectroscopy 38 (1-2), 78 (2005).

12609 (1984).

23. O. G. Luneva, S. V. Sidorenko, O. O. Ponomarchuk,

35. S. T. Bouwer, L. Hoofd, and F. Kreuzer, Biochim. Bio-

et al., Cell. Physiol. Biochem. 39 (1), 81 (2016).

phys. Acta 1338, 127 (1997).

Investigation of Hemoglobin Conformation within Erythrocytes under Different Levels

of the Partial Pressure of Oxygen

O.V. Slatinskaya*, O.G. Luneva*, L.I. Deev*, P.I. Zaripov*, and G.V. Maksimov*^, **

*Department of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskie Gory 1/12, Moscow, 119892 Russia

**National University of Science and Technology "MISiS", Leninskiy prosp. 4, Moscow, 119049 Russia

Through the use of Raman spectroscopy, changes in the conformation of heme and globin in hemoglobin in

response to a change in the partial pressure of oxygen (pO2) have been investigated in the incubation medium

for erythrocytes and hemoglobin. Raman spectra of hemoglobin within erythrocytes in a solution showed

that a number of characteristic bands in the range of 1000 to 1700 cm^-1 (stretching vibrations from the heme

group) and in the high frequency range of 2800 to 3000 cm^-1 (stretching vibrations from globin amino acids)

also change under different pO₂ levels. It was found that the hemoglobin-oxygen saturation (sO₂) curve ob-

tained from Raman scattering data displays sigmoidal behavior only for hemoglobin within erythrocytes. It

was shown that differences in the conformation of heme under different pO₂ levels affect the ability of hemo-

globin to form complexes with NO. As pO₂ level increases, the conformational changes of hemoglobin heme

in the cell are accompanied by increased contribution of lateral-CH₃-group vibrations of semirings of pyrrole

and group vibrations of bonds of semirings of pyrrole, while the conformation of hemoglobin globin is asso-

ciated with increased contribution of vibrations from H-methime groups and symmetric terminal methylene

groups of amino acids.

Keywords: Raman spectroscopy, hemoglobin, erythrocyte, partial pressure of oxygen

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021