БИОФИЗИКА, 2021, том 66, № 5, с. 945-953

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 576.52

НЕПРОНИКАЮЩИЕ В КЛЕТКИ ПЕПТИДНЫЕ ФРАГМЕНТЫ

СУРВИВИНА И HSP70/HSP90-ОРГАНИЗУЮЩЕГО БЕЛКА

ИНГИБИРУЮТ HSP90-ЗАВИСИМУЮ МИГРАЦИЮ И ИНВАЗИЮ

ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

Ю.Ю. Скарга, О.С. Моренков

Институт биофизики клетки РАН - обособленное подразделение ФИЦ «Пущинский научный центр биологических

исследований РАН», 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3

E-mail: morenkov_o@mail.ru

Поступила в редакцию 12.07.2021 г.

После доработки 19.07.2021 г.

Принята к публикации 21.07.2021 г.

Мембрано-ассоциированные и секретированные экстраклеточные белки теплового шока 90

(Hsp90) играют важную роль в миграции, инвазии и метастазировании опухолевых клеток и счита-

ются перспективной терапевтической мишенью для создания противоопухолевых препаратов ан-

тиметастатического действия. Ранее были идентифицированы пептидные фрагменты сурвивина

(KHSSGCAFL) и Hsp70/Hsp90-организующего белка (KAYARIGNSYFK), которые обеспечивают

связывание этих белков с внутриклеточным Hsp90. Мы исследовали влияние этих Hsp90-связыва-

ющих пептидов на миграцию и инвазию клеток фибросаркомы человека HT1080 и глиобластомы

человека A-172. Hепроникающие в клетки Hsp90-связывающие пептидные фрагменты сурвивина и

Hsp70/Hsp90-организующего белка не проявляли цитотоксичности и антипролиферативной актив-

ности, в то время как проникающие в клетки Hsp90-связывающие пептиды, дополнительно содер-

жащие последовательность гомеодомена Antennapedia, были токсичны для клеток HT1080 и A-172.

Непроникающие в клетки Hsp90-связывающие пептиды незначительно снижали базальную (не-

стимулированную) миграцию и инвазию клеток, однако выраженно ингибировали миграцию/ин-

вазию клеток, стимулированную экстраклеточным Hsp90. Полученные результаты свидетельству-

ют, что непроникающие в клетки Hsp90-связывающие пептиды способны ингибировать актив-

ность экстраклеточного Hsp90, что приводит к подавлению миграции и инвазии клеток. Такие

пептиды обладают потенциалом для создания на их основе противоопухолевых препаратов антиме-

тастатического действия.

Ключевые слова: экстраклеточный Hsp90, сурвивин, Hsp70/Hsp90-организующий белок, пептиды,

миграция и инвазия клеток in vitro, метастазирование.

DOI: 10.31857/S0006302921050124

цию его белков-клиентов, нарушение различных

Белок теплового шока 90 (Hsp90) является мо-

сигнальных путей и, как следствие, подавление

лекулярным шапероном, выполняющим важные

роста раковых клеток и их гибель [2, 3]. В этой

внутриклеточные функции, связанные с контро-

лем фолдинга, стабильности, активации и дегра-

связи проникающие в клетки ингибиторы Hsp90

дации белков-клиентов Hsp90 [1]. На сегодняш-

считаются перспективными препаратами для ле-

ний день идентифицировано около 700 белков-

чения рака и некоторые из них в настоящее время

клиентов Hsp90, многие из которых являются он-

проходят клинические испытания [4].

когенами [2, 3]. Ингибирование внутриклеточно-

Помимо внутриклеточной локализации Hsp90

го Hsp90 в опухолевых клетках вызывает деграда-

также обнаруживается на поверхности нормаль-

ных и опухолевых клеток и секретируется опухо-

Сокращения: Hsp90 - белок теплового шока 90, eHsp90 -

левыми клетками [5-10]. В опухолевых клетках

экстраклеточный белок теплового шока 90, Shp - пептид-

ный фрагмент 79-87 аа сурвивина, TPR - пептидный фраг- секреция Hsp90 и его уровень на плазматической

мент 301-312 аа Hsp70/Hsp90-организующего белка, Ant - клеточной мембране повышены, что коррелирует

пептид гомеодомена Antennapedia, ДМЕМ - среда Игла в

со способностью клеток к диссеминации из пер-

модификации Дальбекко, ЭБС - эмбриональная бычья

сыворотка.

вичной опухоли [5]. Установлено, что экстракле-

945

946

ПЕТРЕНКО и др.

точный Hsp90 (eHsp90) стимулирует миграцию,

бированию взаимодействия Hsp90 с ко-шаперо-

инвазию и метастазирование опухолевых клеток

нами и/или белками-клиентами, последующей

[5-12]. Он связывается с рецепторами клеточной

дестабилизации и деградации белков-клиентов

поверхности (LRP1, HER2), что приводит к акти-

Hsp90. Как следствие, такие проникающие в

вации сигнальных путей, участвующих в мигра-

клетки Hsp90-связывающие пептиды подавляют

ции и инвазии клеток [7, 11, 12]. Кроме этого,

рост опухолевых клеток и индуцируют клеточную

eHsp90 способен функционировать как шаперон,

гибель. Например, в последовательности белка

связываясь с экстраклеточными мембрано-ассо-

сурвивина, который активно экспрессируется во

циированными рецепторами, растворенными

многих типах раковых клеток и участвует в регу-

белками клеточного микроокружения (напри-

ляции митоза и подавлении запрограммирован-

мер, матриксными металлопротеиназами) и бел-

ной гибели клеток [20], идентифицирован пеп-

ками внеклеточного матрикса, тем самым регули-

тидный фрагмент KHSSGCAFL, названный

руя их активность [6, 13, 14]. eHsp90 регулирует

Shepherdin [21]. Проницаемый для клеток вари-

экспрессию белков, связанных с процессами ми-

ант этого пептида связывается с внутриклеточ-

грации и инвазии клеток, например, матриксных

ным Hsp90 с высокой аффинностью и ингибиру-

металлопротеиназ и интегринов [15, 16], а также

ет его функционирование, что приводит к деста-

стимулирует образование миофибробластов (или

билизации ряда внутриклеточных белков-

миофибробласто-подобных опухолеассоцииро-

клиентов Hsp90 и гибели клеток [21, 22].

ванных фибробластов), участвующих в процессах

Другим примером пептидомиметиков, подав-

ремоделирования внеклеточного матрикса и ин-

ляющих функционирование внутриклеточного

вазии [16, 17].

Hsp90, является пептидный фрагмент KAYARI-

Было показано, что непроницаемые для кле-

GNSYFK Hsp70/Hsp90-организующего белка,

ток ингибиторы Hsp90 - низкомолекулярные со-

адаптерного белка, который обеспечивает сайты

единения, такие как DMAG-N-оксид (производ-

специфического связывания для Hsp90 и Hsp70,

ное гелданамицина - ингибитора Hsp90) и STA-

что критически необходимо для сборки шаперон-

12-7191 (производное ганетеспиба - ингибитора

ной машины Hsp70/Hsp90 [23-25]. Hsp70/Hsp90-

Hsp90), иммобилизованный на гранулах агарозы

организующий белок содержит специфические

гелданамицин, а также Hsp90-специфические ан-

TPR домены, состоящие из повторяющихся ами-

титела - связываются с экстраклеточным Hsp90 и

нокислотных последовательностей; из них домен

замедляют миграцию клеток, инвазию и диссе-

TPR2A распознает пять остатков на С-конце

минацию опухоли в организме животных [6-10,

Hsp90 [23]. Проницаемый для клеток пептидный

13]. Гепарин, ингибирующий взаимодействие

фрагмент домена TPR2A Hsp70/Hsp90-организу-

eHsp90 с гепарансульфат протеогликанами, рас-

ющего белка препятствует ассоциации между

положенными на плазматической мембране, так-

Hsp90 и Hsp70/Hsp90-организующим белком,

же снижает миграцию и инвазию опухолевых

что приводит к гибели раковых клеток in vitro и в

клеток [18, 19]. Поскольку миграция и инвазия

опухолях мышей [24, 25]. Мы предположили, что

опухолевых клеток являются ключевыми процес-

непроницаемые для клеток Hsp90-связывающие

сами метастазирования, подавление подвижно-

пептиды могут подавлять Hsp90-зависимую ми-

сти опухолевых клеток представляется перспек-

грацию и инвазию клеток за счет связывания с

тивным подходом в борьбе с метастазированием.

мембрана-ассоциированным eHsp90 и/или сво-

В этом контексте eHsp90 рассматривается как но-

бодным eHsp90 из межклеточного пространства и

вая привлекательная химиотерапевтическая ми-

ингибирования их экстраклеточных функций.

шень для препаратов антиметастатического дей-

При этом ингибирование eHsp90 не будет сопро-

ствия, подавляющих миграцию и инвазию рако-

вождаться подавлением функционирования

вых клеток.

внутриклеточного Hsp90. В данной работе мы

Функционирование внутриклеточного Hsp90

продемонстрировали, что непроницаемые для

осуществляется посредством взаимодействия с

клеток Hsp90-связывающие пептидные фрагмен-

ты сурвивина и Hsp70/Hsp90-организующего

белками-клиентами, различными шаперонами и

ко-шаперонами [1-3]. К настоящему времени

белка ингибируют миграцию и инвазию клеток

идентифицированы пептидные фрагменты от-

фибросаркомы HT1080 и глиобластомы A-172 че-

дельных белков-клиентов Hsp90, шаперонов и

ловека, зависимую от экстраклеточного Hsp90.

ко-шаперонов, обеспечивающие взаимодействие

этих белков с внутриклеточным Hsp90. Присо-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

единение к таким пептидным фрагментам после-

довательностей CPP (cell-penetrating peptides), та-

Материалы и реактивы. Общелабораторная

ких как ТАТ-пептид (фрагмент TAT HIV-1) или

пластиковая посуда и пластиковая посуда для

пенетратин (фрагмент гомеодомена Antennape-

культивирования клеток были производства ком-

dia), обеспечивает проникновение Hsp90-связы-

паний Greiner (Австрия) и Corning Life Sciences

вающих пептидов в клетки, что приводит к инги-

(США). Вставки в 24-луночные планшеты с по-

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

НЕПРОНИКАЮЩИЕ В КЛЕТКИ ПЕПТИДНЫЕ ФРАГМЕНТЫ

947

лиэтилентерефталатной мембраной (размер пор 8

ние цитотоксичности и антипролиферативной

мкм) были производства компании Greiner (Ав-

активности проводили на клетках A-172 и HT1080

стрия). В работе использовали среду Игла в моди-

с использованием МТТ метода, как описано ра-

фикации Дальбекко (среду ДМЕМ) и эмбрио-

нее [27]. IC₅₀ рассчитывали как концентрацию

нальную бычью сыворотку (ЭБС) производства

пептида, вызывающую гибель 50% клеток за 72 ч.

HyClone (США). Растворы версена и трипсина

Определение миграции и инвазии клеток in vitro.

были производства ООО «БиолоТ» (Санкт-Пе-

Эксперименты проводили с использованием

тербург, Россия). Остальные химические реакти-

вкладышей в 24-луночные планшеты с полиэти-

вы приобретали в компании Sigma-Aldrich

(США).

лентерефталатной мембраной (размер пор

мкм); для оценки инвазии клеток вкладыши с по-

Клеточные линии. В работе использовали кле-

лиэтилентерефталатной мембраной обрабатыва-

точные линии фибросаркомы (HT1080) и глиоб-

ли коллагеном VI (Trevigen, США). Для анализа

ластомы (А-172) человека из коллекции клеточ-

базальной (нестимулированной) миграции/инва-

ных культур Института цитологии РАН (Санкт-

зии клетки помещали во вкладыши в среде

Петербург). Клетки выращивали в среде ДМЕМ,

ДМЕМ с бычьим сывороточным альбумином в

содержащей 10% ЭБС и антибиотики (по 40 Ед.

присутствии пептидов в разных концентрациях.

пенициллина, стрептомицина и гентамицина)

В качестве хемоаттрактанта в нижнем резервуаре

(ДМЕМ-10% ЭБС).

использовали ДМЕМ-5% ЭБС. Миграцию и ин-

Синтез пептидов и очистка белков. Пептиды син-

вазию клеток оценивали через 6 и 24 ч соответ-

тезировали методом твердофазной химии, очищали

ственно. Прошедшие через полиэтилентерефта-

с помощью высокоэффективной жидкостной хро-

латную мембрану клетки фиксировали метило-

матографии с обращенной фазой (чистота > 98%) и

вым спиртом, окрашивали красителем

анализировали с помощью масс-спектрометрии. В

кристаллическим фиолетовым, лизировали и из-

работе использовали следующие пептиды: пептид,

меряли оптическую плотность при длине волны

соответствующий последовательности сурвивина

595 нм (ОП₅₉₅) с использованием планшетного

между Lys-79 и Leu-87 (KHSSGCAFL, Shepherdin

ридера iMark (Bio-Rad, США). Базальную мигра-

(Shp)), и его скремблированный вариант (SKLACF-

цию/инвазию оценивали по ОП₅₉₅ клеток, ми-

SHG, scr-Shp); пептид, соответствующий последо-

грировавших через мембрану, за вычетом ОП₅₉₅

вательности TPR2A Hsp70/Hsp90-организующего

клеток, прошедших через мембрану в отсутствие

белка между Lys-301 и Lys-312 (KAYARIGNSYFK,

хемотаксического градиента (спонтанная мигра-

TPR) и его скремблированный вариант (SYKARN-

ция/инвазия). Величину миграции контрольных

GAFIYK, scr-TPR). Для получения проницаемых

клеток без пептидов принимали за 100%.

для клеток пептидов к ним на N-конце добавляли

фрагмент последовательности гомеодомена Anten-

Оценку Hsp90-стимулированной мигра-

napedia (RQIKIWFQNRRMKWKK) и получали

ции/инвазии проводили как описано выше, за

проникающие в клетки пептиды: RQIKIWFQNR-

исключением того, что в среду с клетками добав-

RMKWKKKHSSGCAFL (Ant-Shp), RQIKIWFQN-

ляли очищенный Hsp90 (50 мкг/мл) для стимуля-

RRMKWKKSKLACFSHG (Ant-scr-Shp), RQIKIW-

ции миграции. ОП₅₉₅ клеток, прошедших через

FQNRRMKWKKKAYARIGNSYFK (Ant-TPR) и

мембрану, определяли, как описано выше. Для

RQIKIWFQNRRMKWKKSYKARNGAFIYK (Ant-

расчета Hsp90-индуцированной стимуляции ми-

scr-TPR).

грации/инвазии ОП₅₉₅ спонтанно-мигрировав-

Очистка Hsp90 из мозга коров. Очистку натив-

ших клеток вычитали из значений ОП₅₉₅ клеток,

ного Hsp90 из мозга коров проводили, как описа-

прошедших через мембрану по хемотаксическо-

но ранее [26]. Мозг коров получали с местной

му градиенту. После этого ОП₅₉₅ нестимулиро-

бойни. Чистота очищенного нативного Hsp90 со-

ванных клеток вычитали из ОП₅₉₅ Hsp90-стиму-

ставляла 95-98%. В очищенном Hsp90 содержа-

лированных клеток и разницу выражали в про-

лись две изоформы Hsp90 - Hsp90a и Hsp90b, в

центах относительно ОП₅₉₅ нестимулированных

соотношении 9:1. Для экспериментов с культура-

ми клеток очищенный нативный Hsp90 диализо-

клеток. Hsp90-зависимую стимуляцию мигра-

вали против среды ДМЕМ. Очищенный Hsp90 не

ции/инвазии контрольных клеток без пептидов

проявлял цитотоксичности и антипролифератив-

принимали за 100%.

ной активности для клеток A-172 и HT1080 при

Статистическая обработка. Каждый экспери-

концентрациях до 1.0 мг/мл.

мент проводили не менее трех раз. Каждая точка

Определение цитотоксичности и антипролифе-

представляет собой среднее арифметическое зна-

ративной активности пептидов. Синтетические

чение трех-пяти повторов ± стандартное откло-

пептиды растворяли в диметилсульфоксиде. Пре-

нение. Статистическую обработку полученных

параты пептидов разводили до необходимых кон-

результатов проводили с использованием t-теста

центраций в среде культивирования. Определе-

Стьюдента.

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

948

ПЕТРЕНКО и др.

Рис. 1. Цитотоксическая (а, в) и антипролиферативная (б, г) активность Hsp90-связывающих пептидов. Клетки

HT1080 и A-172 в состоянии полного монослоя (анализ цитотоксичности) или пролиферирующие клетки НТ1080 и

А-172 (антипролиферативный анализ) инкубировали в течение 72 ч в присутствии различных пептидов, разведенных

в разных концентрациях в среде ДМЕМ-ЭБС. Относительное количество живых клеток определяли с использованием

МТТ-метода, оптическую плотность при 550 нм (ОП₅₅₀) выражали в процентах. ОП₅₅₀ в контрольных лунках без

пептидов принимали за 100%. Каждая точка представляет собой среднее значение ± SD (n = 4-5). Звездочки

указывают статистически достоверное отличие от контрольных клеток: * - p < 0.05, ** - p < 0.01.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Shp и Ant-TPR. Непроницаемые для клеток пеп-

тиды Shp и TPR и их скремблированные вариан-

Проницаемые для клеток пептиды Ant-Shp и

ты (scr-Shp и scr-TPR) были не токсичны для кле-

Ant-TPR дозозависимым образом ингибировали

ток и не снижали пролиферацию клеток при кон-

рост клеток HT1080 и A-172 и оказывали цитоток-

центрациях до 1000 мкМ (рис. 1). Полученные

сическое действие на клетки. Ant-Shp проявлял

результаты согласуются с ранее опубликованны-

цитотоксическую (рис. 1а,в) и антипролифера-

ми данными о цитотоксичности проникающих в

тивную (рис. 1б,г) активности против обеих кле-

клетки пептидных фрагментов сурвивина и

точных линий с IC₅₀ 80-130 мкM и 30-50 мкM

Hsp70/Hsp90-организующего белка в отношении

соответственно. Ant-TPR также обнаруживал ци-

различных линий раковых клеток и об отсутствии

тотоксическую (рис. 1а,в) и антипролифератив-

цитотоксической активности непроникающих в

ную (рис. 1б,г) активности против обеих клеточ-

клетки вариантов этих пептидов [21, 22, 24, 25].

ных линий с IC₅₀ 90-110 мкM и 40-70 мкM со-

ответственно. Проницаемые для клеток

Мы предположили, что непроницаемые для

скремблированные пептиды Аnt-scr-Shp и Ant-

клеток пептиды Shp и TPR могут связываться с

scr-TPR практически не влияли на жизнеспособ-

Hsp90, ассоциированным с клеточной поверхно-

ность и пролиферацию клеток, что указывает на

стью, и с Hsp90 в культуральной среде, что может

специфичность цитотоксического и антипроли-

привести к снижению миграции и/или инвазии

феративного действия проникающих в клетки

клеток in vitro, поскольку оба пула экстраклеточно-

Hsp90-связывающих пептидных фрагментов Ant-

го Hsp90 участвуют в клеточной подвижности [6-

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

НЕПРОНИКАЮЩИЕ В КЛЕТКИ ПЕПТИДНЫЕ ФРАГМЕНТЫ

949

Рис. 2. Влияние непроницаемых для клеток Hsp90-связывающих пептидов на базальную миграцию и инвазию клеток

HT1080 и A-172. Миграцию и инвазию клеток определяли в среде ДМЕМ с бычьим сывороточным альбумином,

содержащей пептиды в разных концентрациях (а-г) или поликлональные антитела против Hsp90 (100 мкг/мл) (д).

Миграцию и инвазию контрольных клеток (без пептидов) принимали за 100%. Каждая точка представляет собой

среднее значение SD (n = 4-5). Звездочки указывают на статистически достоверное отличие от контрольных клеток:

* - p < 0.05.

15]. Принимая это во внимание, мы исследовали

роточным альбумином, которая практически не

влияние непроницаемых для клеток Hsp90-связы-

содержит факторов роста, оба непроницаемых для

вающих пептидов на базальную (нестимулирован-

клеток пептида Shp и TPR в концентрациях 1-

ную) миграцию и инвазию клеток (в отсутствие

100 мкМ незначительно, но воспроизводимо сни-

Hsp90 в культуральной среде) и на миграцию/ин-

жали базальную миграцию обеих клеточных линий

вазию клеток, стимулированную экстраклеточным

(рис. 2а,в), не более чем на 10-15%. Оба пептида

нативным Hsp90. В среде ДМЕМ с бычьим сыво-

вызывали более выраженное ингибирование ба-

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

950

ПЕТРЕНКО и др.

Рис. 3. Влияние непроницаемых для клеток Hsp90-связывающих пептидов на Hsp90-индуцированную миграцию и

инвазию клеток HT1080 и A-172. Пептиды в разных концентрациях (а-г) и поликлональные антитела против Hsp90

(100 мкг/мл) (д) добавляли в среду вместе с нативным Hsp90 (50 мкг/мл) и оценивали миграцию/инвазию клеток,

стимулированную Hsp90. Hsp90-зависимую стимуляцию миграции и инвазии контрольных клеток (без пептидов)

принимали за 100%. Каждая точка представляет собой среднее значение ± SD (n = 4-5). Звездочки указывают на

статистически достоверное отличие от контрольных клеток: * - p < 0.05, ** - p < 0.01.

зальной инвазии клеток: в концентрации 100 мкМ

точных линий, что указывает на специфичность

пептиды Shp и TPR снижали базальную инвазию

эффектов пептидов на базальную (нестимулиро-

клеток HT1080 и A-172 на 20-30% (рис. 2б,г). Эф-

ванную) инвазию клеток. В качестве контроля мы

фекты пептида Shp были более выражены, чем

проанализировали ингибирование базальной ми-

пептида TPR. Скремблированные непроницаемые

грации/инвазии клеток Hsp90-специфическими

для клеток аналоги пептидов не ингибировали ба-

поликлональными антителами, полученными пу-

зальную миграцию и инвазию клеток обеих кле-

тем многократной иммунизации кроликов очи-

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

НЕПРОНИКАЮЩИЕ В КЛЕТКИ ПЕПТИДНЫЕ ФРАГМЕНТЫ

951

щенным нативным бычьим Hsp90. Уровень сни-

ность непроницаемых для клеток пептидов Hsp90

жения базальной миграции/инвазии клеток

в ингибировании Hsp90-зависимой стимуляции

Hsp90-специфическими поликлональными анти-

подвижности клеток экстраклеточным Hsp90.

телами (100 мкг/мл) также был не очень высок и

Таким образом, мы продемонстрировали, что

составлял 20-30% (рис. 2д). Полученные данные

два Hsp90-связывающих непроницаемых для

свидетельствовали, что непроницаемые для клеток

клеток пептидных фрагмента сурвивина и

Hsp90-связывающие пептиды Shp и TPR оказыва-

Hsp70/Hsp90-организующего белка не обладают

ли определенное ингибирующее влияние на ми-

цитотоксичностью и антипролиферативной ак-

грацию/инвазию клеток, зависящую от мембрано-

тивностью в отношении клеток HT1080 и A-172,

ассоциированного экстраклеточного Hsp90.

но подавляют миграцию и инвазию клеток in vitro:

базальную миграцию/инвазию клеток, зависи-

Далее мы исследовали влияние непроникаю-

мую от мембрано-ассоциированного Hsp90, и

щих в клетки Hsp90-связывающих пептидов Shp

миграцию/инвазию клеток, стимулированную

и TPR на миграцию и инвазию клеток, стимули-

свободным Hsp90. Механизмы, посредством ко-

рованную Hsp90. Для стимуляции миграции/ин-

торых пептиды ингибируют функционирование

вазии клеток использовали очищенный натив-

экстраклеточного Hsp90, неясны и требуют даль-

ный бычий Hsp90. Добавление нативного Hsp90 в

нейшего изучения. Гипотетическая модель дей-

среду стимулировало миграцию клеток глиобла-

ствия непроницаемых и проницаемых для клеток

стомы A-172 и фибросаркомы HT1080 на 30-60%

Hsp90-связывающих пептидов на Hsp90-зависи-

и инвазию обеих клеточных линий на 80-140%

мую миграцию и инвазию клеток представлена на

соответственно (данные не приведены), подтвер-

рис. 4. Связывание таких пептидов с мембрано-

ждая заметную промотирующую активность на-

ассоциированным или свободным Hsp90 может

тивного Hsp90 для опухолевых клеток, показан-

нарушать взаимодействие Hsp90 с клеточными

ную нами ранее [9]. Hsp90-индуцированная сти-

рецепторами (LRP1 и др.) и, следовательно, акти-

муляция миграции/инвазии обеих клеточных

вацию сигнальных путей, определяющих клеточ-

линий дозо-зависимо снижалась в присутствии

ную подвижность [7-12, 15]. Взаимодействие

обоих непроницаемых для клеток пептидов Shp и

пептидов с Hsp90 может приводить к стерическо-

TPR. Пептид Shp ингибировал индуцированную

му ингибированию связывания свободного

Hsp90 стимуляцию миграции и инвазии клеток с

Hsp90 с рецепторами (например, LRP1) и/или

IC₅₀ 3-8 мкМ для обеих клеточных линий; при

клеточными гепарансульфатами, к диссоциации

этом пептид практически полностью подавлял

(десорбции) Hsp90, ассоциированных с рецепто-

стимуляцию миграции и инвазии клеток HT1080

рами/гепарансульфатами на плазматической

и A-172 в концентрации 100 мкМ (рис. 3). Более

мембране. Нельзя также исключать, что присо-

того, миграция и инвазия клеток иногда снижа-

единение пептидов к Hsp90 может нарушить его

лись ниже нестимулированного контроля на 10-

способность активировать клеточные рецепторы

25%, что указывает на то, что пептиды ингибиру-

по неизвестному механизму, например, посред-

ют оба пула внеклеточного Hsp90 - мембрано-ас-

ством изменения конформации Hsp90.

социированный Hsp90 и растворенный в культу-

Полученные нами результаты согласуются с

ральной среде. Пептид TPR был менее эффекти-

данными других исследователей, показавших,

вен в ингибировании Hsp90-индуцированной

что различные типы непроницаемых для клеток

стимуляции миграции клеток HT1080 и A-172

ингибиторов Hsp90 (Hsp90-специфичные анти-

(IC₅₀ 10-12 мкМ) (рис. 3), однако в концентрации

тела, DMAG-N-оксид, STA-12-7191, иммобили-

100 мкМ пептид TPR также практически полно-

зованный на агарозных гранулах гелданамицин)

стью ингибировал Hsp90-индуцированную сти-

снижают миграцию и инвазию клеток in vitro и

муляцию миграции клеток обеих культур клеток.

диссеменацию опухолевых клеток у мышей [6-

Пептид TPR был менее эффективен в подавлении

10, 13]. Результаты свидетельствуют, что непро-

Hsp90-индуцированной стимуляции инвазии

ницаемые для клеток пептиды, связывающиеся с

клеток HT1080 и A-172 по сравнению с миграцией

Hsp90, обладают потенциалом для создания про-

клеток (рис. 3). Скремблированные пептиды scr-

тивоопухолевых препаратов антиметастатическо-

Shp и scr-TPR не влияли на миграцию и инвазию

го действия. Результаты также позволяют предпо-

клеток в присутствии нативного Hsp90 в среде,

ложить, что проницаемые для клеток формы та-

что указывает на специфичность эффектов не-

ких пептидов, дополнительно содержащие

проницаемых для клеток пептидов Shp и TPR на

проникающие в клетки пептиды (пенетратин,

подвижность клеток. Hsp90-специфические по-

ТАТ-пептид), которые обеспечивают проникно-

ликлональные антитела, используемые в качестве

вение Hsp90-связывающих пептидов в клетки,

контроля, ингибировали стимулированную

могут обладать двойной противоопухолевой ак-

Hsp90 миграцию/инвазию обеих клеточных ли-

тивностью - прямым цитотоксическим действи-

ний на 60-90% при концентрации 100 мкг/мл

ем за счет ингибирования функционирования

(рис. 3д), что указывает на высокую эффектив-

внутриклеточного Hsp90 и подавлением мигра-

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

952

ПЕТРЕНКО и др.

Рис. 4. Гипотетическая модель действия проницаемых и непроницаемых для клеток Hsp90-связывающих пептидов

на миграцию и инвазию опухолевых клеток. Непроницаемые для клеток пептиды и проницаемые для клеток

пептиды, содержащие проникающий в клетки пептид (CPP), связываются со свободным и/или мембрана-

ассоциированным экстраклеточным Hsp90 и нарушают дальнейшую передачу сигналов, связанных с Hsp90-

зависимой подвижностью клеток, что приводит к ингибированию их миграции и инвазии. В дополнение к этому

проницаемые для клеток Hsp90-связывающие пептиды ингибируют взаимодействие внутриклеточного Hsp90 с

белками-клиентами или ко-шаперонами, что приводит к торможению роста и гибели опухолевых клеток.

ции/инвазии опухолевых клеток через наруше-

опухолевых препаратов антиметастатического

ние функционирования экстраклеточного Hsp90,

действия.

ассоциированного с клеточной мембраной или

находящегося в межклеточном пространстве в

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

свободном виде.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

интересов.

ВЫВОДЫ

Пептидные фрагменты сурвивина (KHSS-

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

GCAFL) и Hsp70/Hsp90-организующего белка

Настоящая работа не содержит описания ис-

(SYKARNGAFIYK) не проникают внутрь клеток

следований с использованием людей и животных

и не обладают цитотоксической и антипролифе-

в качестве объектов.

ративной активностью. Пептиды незначительно

снижали базальную (нестимулированную) ми-

грацию и инвазию клеток фибросаркомы HT1080

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

и глиобластомы А-172 человека in vitro, но выра-

женно ингибировали миграцию/инвазию клеток,

1. J. Li and J. Buchner, Biomed. J. 36, 106 (2013).

стимулированную экстраклеточным Hsp90. Ре-

2. P. C. Echeverria, A. Bernthaler, P. Dupuis, et al., PLoS

зультаты свидетельствуют о потенциале Hsp90-

One 6, 26044 (2011).

связывающих пептидов для разработки противо-

3. P. Workman, Cancer Lett. 206, 149 (2004).

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021

НЕПРОНИКАЮЩИЕ В КЛЕТКИ ПЕПТИДНЫЕ ФРАГМЕНТЫ

953

4. J. Sanchez, T. R. Carter, M. S. Cohen, et al., Curr.

16. J. Bohonowych, M. Hance, K. Nolan, et al., Prostate

Cancer Drug Targets 20 (4), 253 (2020).

74, 395 (2014).

5. B. Becker, G. Multhoff, B. Farkas, et al., Experim.

17. M. Schafer and S. Werner, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9,

Dermatol. 13, 27 (2004).

628 (2008).

6. B. K. Eustace, T. Sakurai, J. K. Stewart, et al., Nat. Cell

18. A. Snigireva, V. Vrublevskaya, V. Afanasyev, et al., Cell.

Biol. 6, 507 (2004).

Adh. Migr. 9, 460 (2015).

7. M. Shevtsov M., Z. Balogi, W. Khachatryan, et al.,

19. A. Snigireva, V. Vrublevskaya, Y. Skarga, et al., Cell

Cells 9 (5), 1263 (2020).

Stress Chaperones 24, 309 (2019).

8. K. Sidera, M. Gaitanou, D. Stellas, et al., J. Biol.

20. S. P. Wheatley and D. C. Altieri, J. Cell Sci. 132 (7),

Chem. 283, 2031 (2008).

jcs223826 (2019).

9. D. Stellas, A. El Hamidieh, and E. Patsavoudi, BMC

21. J. Plescia, W. Salz, F. Xia, et al., Cancer Cell. 17, 457

Cell Biol. 11, 51 (2010).

(2005).

10. S. Tsutsumi, B. Scroggins, F. Koga, et al., Oncogene

22. B. Gyurkocza, J. Plescia, C. M. Raskett, et al., J. Natl.

27, 2478 (2008).

Cancer Inst. 98, 1068 (2006).

11. J. McCready, D. S. Wong, J. A. Burlison, et al., Can-

23. J. Li, J. Soroka, and J. Buchner, Biochim. Biophys. Ac-

cers (Basel) 6, 1031 (2014).

ta 3, 624 (2012).

12. C. F. Cheng, J. Fan, M. Fedesco, et al., Mol. Cell. Biol.

24. T. Horibe, M. Kohno, M. Haramoto, et al., J. Transl.

28, 3344 (2008).

Med. 9, 8 (2011).

13. A. L. Correia, H. Mori, E. I. Chen, et al., Genes Dev.

25. A. Ahsan, D. Ray, S. G. Ramanand, et al., J. Biol.

27, 805 (2013).

Chem. 288, 26879 (2013).

14. M. C. Hunter, K. L. O'Hagan, A. Kenyon, et al., PLoS

26. Y. Skarga, V. Vrublevskaya, Y. Evdokimovskaya, et al.,

One 9, e86842 (2014).

Biomed. Chromatogr. 23, 1208 (2009).

15. J. S. Chen, Y. M. Hsu, C. C. Chen, et al., J. Biol.

27. A. Lisov, V. Vrublevskaya, Z. Lisova, et al., Viruses 7

Chem. 285, 25458 (2010).

(10), 5343 (2015).

Cell-Impermeable Peptide Fragments of Survivin and Hsp70/Hsp90-Organizing

Protein Inhibit the Hsp90-Dependent Migration and Invasion of Tumor Cells

V.S. Petrenko, A.V. Snigireva, V.V. Vrublevskaya, M.A. Zhmurina, Y.Y. Skarga, and O.S. Morenkov

Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

Membrane-associated and secreted extracellular heat shock proteins 90 (Hsp90) have important role in the

migration, invasion, and metastasis of tumor cells and are proposed as promising therapeutic target for the

development of antimetastatic agents. In previous studies, peptide fragments of survivin (KHSSGCAFL) and

Hsp70/Hsp90-organizing protein (KAYARIGNSYFK), that bind these proteins to the intracellular form of

Hsp90 have been identified. In this study, we investigated the effects of the Hsp90-binding peptides on the

migration and invasion of human fibrosarcoma HT1080 and glioblastoma A-172 cells. Cell-impermeable

Hsp90-binding peptide fragments of survivin and Hsp70/Hsp90-organizing protein did not exert cytotoxic

and antiproliferative activity against cells, while cell-permeable Hsp90-binding peptides which contain the

Antennapedia homeodomain sequence were toxic for HT1080 and A-172 cells. Cell-impermeable Hsp90-

binding peptides slightly decreased the basal (unstimulated) cell migration and invasion, although they

strongly inhibited the migration/invasion of cells stimulated by extracellular Hsp90. The results demonstrated

that cell-impermeable Hsp90-binding peptides are able to inhibit the activity of extracellular Hsp90, thereby

leading to the suppression of the migration and invasion of cells. Such peptides have a potential for the devel-

opment of antimetastatic drugs.

Keywords: extracellular Hsp90, survivin, Hsp70/Hsp90-organizing protein, peptides, cell migration and invasion

in vitro, metastasis

БИОФИЗИКА том 66

№ 5

2021