БИОФИЗИКА, 2021, том 66, № 6, с. 1116-1122

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 577.3, 579.61

НАНОВИБРАЦИИ КАНТИЛЕВЕРА АТОМНО-СИЛОВОГО МИКРОСКОПА

КАК СИСТЕМА ДЕТЕКЦИИ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ

БАКТЕРИЙ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

*Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского,

603950, Нижний Новгород, просп. Гагарина, 23/3

**Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева,

603950, Нижний Новгород, ул. Минина, 24/1

E-mail: pleskova@mail.ru

Поступила в редакцию 20.05.2021 г.

После доработки 02.07.2021 г.

Принята к публикации 16.09.2021 г.

Атомно-силовая микроскопия была использована для детекции нановибраций кантилевера, возни-

кающих в результате метаболической активности Escherichia coli. Показано, что использование по-

ли-L-лизина эффективно для закрепления бактерий на кантилевере с сохранением их метаболиче-

ской активности. Варианса амплитуды колебаний кантилевера статистически значимо отличается

между контролем (кантилевер, функционализированный поли-L-лизином) и опытом (кантилевер

с фиксированными на нем бактериями). Продемонстрировано, что использование атомно-силовой

микроскопии дает возможность определять антибиотикорезистентность штамма в течение часа, в

отличие от методов, используемых в клинической практике и предоставляющих ответ об антибио-

тикорезистентности за несколько суток.

Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия, антибиотикорезистентность, нановибрации, кантиле-

вер, бактерии, антибиотики.

DOI: 10.31857/S0006302921060065

вирусов (например, большинство штаммов грип-

Антибиотикорезистентность является одним

из глобальных медицинских кризисов, поскольку

па резистентны к амантадину [4], некоторые

штаммы вирусов герпеса устойчивы к ациклови-

антибиотики теряют свою эффективность в отно-

шении стремительно растущего числа бактери-

ру [5]), грибов (например, резистентность Candi-

альных патогенов [1]. Вместе с тем инфекцион-

da albicans к азольным препаратам [6]), простей-

ные заболевания по данным Всемирной органи-

шим (например, Plasmodium vivax резистентна к

зации здравоохранения ежегодно являются

хлорохину [7]). Одной из причин формирования

этиологической причиной заболеваний у 2 млрд

антибиотикорезистентности является достаточно

человек и для 17 млн. они заканчиваются леталь-

длительное проведение анализа «на флору и чув-

ным исходом [2]. Не менее проблемными явля-

ствительность к антибиотикам». За время ответа

ются нозокомиальные инфекции в стационарах

на вопрос о чувствительности/резистентности

как хирургического, так и терапевтического про-

выделенной микрофлоры к антибиотикам паци-

филя. В частности, в работе [3] показано, что ан-

ентам назначается этиотропная терапия - в ос-

тибиотикорезистентные Escherichia coli в услови-

новном антибиотики широкого спектра

ях многопрофильного стационара в отделении

действия, что способствует выработке резистент-

травматологии и ортопедии выявляются в 74%

ности и внутрибольничной персистенции нозо-

случаев. Проблема формирования множествен-

комиальных штаммов. Диско-диффузионный

ной лекарственной устойчивости является обще-

метод, традиционно используемый в клиниче-

медицинской и общебиологической, поскольку

ской лабораторной диагностике, дает ответ на во-

резистентность сформирована у многих штаммов

прос об антибиотиках, к которым чувствителен

выделенный штамм, только спустя пять-семь су-

Сокращения: АЧХ - амплитудно-частотная характеристи- ток после забора материала. В 2017 г. группа

ка, DFL - разностный сигнал между верхним и нижним

участками фотодиода (difference signal between top and bot-

проф. С. Казаса [8] предложила принципиально

tom halves of the photodiode)..

новую методику быстрого определения чувстви-

1116

НАНОВИБРАЦИИ КАНТИЛЕВЕРА АТОМНО-СИЛОВОГО МИКРОСКОПА

1117

тельности бактерий к антибиотикам. Она основа-

на на использовании принципов работы атомно-

силового микроскопа, когда наномеханический

сенсор (кантилевер) колеблется в том случае, ес-

ли прикрепленные на нем бактерии метаболиче-

ски активны [9, 10]. Эта система имеет следую-

щие преимущества по сравнению с традиционно

используемыми: 1) она не зависима от бактери-

ального роста, поэтому результат выдается через

один-полтора часа по сравнению с сутками, не-

обходимыми при использовании диско-диффу-

Рис. 1. (а) - Схема установки детектора нановибра-

зионного метода; 2) чтобы достичь распознавае-

ций: луч лазера фокусируется на кончике кантилеве-

мого сигнала, необходимо 10² бактерий [11]. Та-

ра и отражается от него в центр четырехсекционного

ким образом, предложенная система имеет

фотодиода, смещения отражения на фотодиоде ис-

высокую чувствительность и скорость, что позво-

пользуются для детектирования нановибраций как

сигнала DFL. (б) - Схема эксперимента: 1 - когда

ляет рассматривать ее как чрезвычайно перспек-

бактерии не прикреплены к датчику, нановибрации

тивную для определения резистентности бак-

возникают под действием только теплового движе-

терий к антибиотикам. Нужно отметить, что

ния и малы; 2 - после прикрепления живых бактерий

атомно-силовая микроскопия прекрасно зареко-

нановибрации связаны с их метаболической актив-

мендовала себя не только как метод высокоразре-

ностью и высоки; 3 - после воздействия антибиотика

шающей микроскопии. Она используется для ди-

бактерии нежизнеспособны и колебания возвраща-

намического мониторинга за состоянием клеток

ются к низким уровням.

и отдельных молекул, определения наномехани-

ческих свойств биологических объектов, внутри-

клеточного фишинга отдельных молекул, иссле-

на спектрофотометре СПЕКС-ССП («Спектро-

дования межклеточных адгезионных контактов

скопические системы», Россия) при длине

[12].

волны λ = 670 нм, что соответствовало 10 МЕ.

В связи с вышесказанным целью данного ис-

Общая схема эксперимента представлена на

следования была разработка собственной методи-

рис. 1.

ки определения резистентности бактерий к анти-

биотикам. Для достижения цели ставились следу-

Апробировали три вида Si₃N₄-кантилеверов:

ющие задачи:

1) отработка метода фиксации

D-DNP (f₀ - 12-24 кГц, k - 0.06 Н/м), С-MLCT

бактерий на кантилевере, который, с одной сторо-

(f₀ - 4-10 кГц, k - 0.010 Н/м) и А-MLCT (f₀ -

ны, не давал бы возможности бактериям десорби-

22 кГц, k - 0.07 Н/м) (Bruker, США) и фиксацию

роваться с поверхности кантилевера, а с другой -

0.01%-м поли-L-лизином (Merck, США). Для

не ограничивал метаболическую активность бакте-

фиксации бактерий кантилеверы предварительно

рий, что могло бы отразиться на нановибрациях

обрабатывали поли-L-лизином (24°С, 10 мин),

кантилевера; 2) отработать систему детекции сиг-

после чего трехкратно аккуратно отмывали ди-

нала, для чего выбрать оптимальные по физико-

стиллированной водой. Кантилеверы оставляли

химическим параметрам кантилеверы и режим ра-

сушиться (24°С, 5 мин), после чего наносили на

боты атомно-силового микроскопа; 3) протести-

них суспензию бактерий и инкубировали (37°С,

ровать на одном бактериальном штамме два раз-

30 мин).

ных антибиотика, к одному из которых он чувстви-

телен, а к другому - резистентен; 4) выбрать

По окончании инкубации кантилевер устанав-

надежные физические параметры, корректно опи-

ливали в холдер атомно-силового микроскопа

сывающие наблюдаемый эффект антибиотикоре-

NTegra («NT-MDT», Россия) и погружали в ана-

зистентности.

литическую камеру с 5 мл LB-бульона. Для кон-

троля использовали кантилевер, покрытый поли-

L-лизином, но без бактерий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Устанавливали лазер в центр четырехсекцион-

Чувствительный к гентамицину и резистент-

ного фотодиода, переводили микроскоп в режим

ный к цефтриаксону штамм E. coli 321 взяли из

регистрации осцилляций (Nova, версия Px.3.4.0

музейной культуры Научно-образовательного

rev 17188, режим «Oscilloscope») и снимали анали-

центра «Физика твердотельных наноструктур»

тический сигнал DFL (difference signal between top

ННГУ им. Н.И. Лобачевского. Штамм выращи-

and bottom halves of the photodiode - разностный

вали на LB-бульоне (Invitrogen, 37°С, 18 ч), после

сигнал между верхним и нижним участками фо-

чего трижды отмывали LB-бульоном

(450 g,

тодиода). Нановибрации в контроле и в опыте с

5 мин) и взвешивали в концентрации 10⁹ кл/мл

бактериями снимали в течение 60 мин.

БИОФИЗИКА том 66

№ 6

2021

1118

ПЛЕСКОВА и др.

Затем из аналитической камеры отбирали 2 мл

кантилеверы А-MLCT, поскольку, по всей веро-

LB-бульона и вносили в нее 4%-й раствор гента-

ятности, их физико-химические характеристики,

мицина сульфата («Микроген», Россия) в количе-

прежде всего жесткость и резонансная частота,

стве 2 мл (конечная концентрация гентамицина

наилучшим образом соответствуют задачам реги-

сульфата 16 мг/мл), либо 1%-й раствор цефтриак-

страции нановибраций.

сона (ПАО «Биосинтез», Россия) в количестве

Фурье-преобразование полного спектра запи-

2 мл (конечная концентрация 36 мг/мл). Опуска-

санных результатов не дало существенных пре-

ли кантилевер с бактериями в раствор гентамици-

имуществ при последующей обработке результа-

на либо цефтриаксона, инкубировали

(24°С,

тов. Однако весьма показательным было исполь-

60 мин), после чего переводили микроскоп в ре-

зование вариансы (квадрата стандартного

жим регистрации сигнала DFL. Полученный мас-

отклонения), характеризующей изменения ам-

сив данных обрабатывали в программе Origin Pro

плитудно-частотных характеристик колебаний

8 SR4 v8.0951. С помощью Фурье-фильтра из ана-

(АЧХ) кантилевера во всем спектре записи нано-

литического сигнала удаляли колебания с часто-

вибраций.

тами выше 1 Гц (колебания электросети и другие

На рис. 2б очевидно изменение АЧХ кантиле-

внешние колебания). Проводили определение

вера в случае фиксации на кантилевере А-MLCT

квадрата стандартного отклонения (вариансы) в

поли-L-лизином бактерий E. coli по сравнению с

каждом из опытов для характеристики амплиту-

чистым кантилевером, функционализированным

ды сигнала кантилевера.

поли-L-лизином (рис. 2а).

При анализе данных для учета вариаций ха-

Часовая экспозиция в растворе гентамицина

рактеристик кантилевера (поскольку, несмотря

сульфата (16 мг/мл) кантилевера с фиксирован-

на принадлежность к одной партии, для них за-

ными на нем бактериями вновь вызывает суще-

фиксированы незначительные различия в резо-

ственное изменение АЧХ (рис. 2в). В этом случае

нансной частоте колебаний и отражающей спо-

АЧХ больше соответствовала нановибрациям пу-

собности покрытий, что сказывалось на учете и

стого кантилевера, функционализированного

записи нановибраций) и различий в количестве

0.01%-м поли-L-лизином. При этом часовая экс-

фиксированных бактерий проводили нормиров-

позиция кантилевера с тем же штаммом E. coli, но

ку данных, принимая за единицу сигнал DFL от

в растворе цефтриаксона (36 мг/мл), к которому

кантилевера с бактериями с последующим при-

предварительно у данного штамма была выявлена

нятием за нуль сигнала DFL от пустого кантиле-

резистентность, показала, что АЧХ кантилевера в

вера, функционализированного поли-L-лизи-

контроле (кантилевер,с фиксированным на нем

ном.

бактериями) и в опыте (кантилевер с бактериями,

Статистическую обработку проводили в про-

проинкубированный в растворе цефтриаксона)

грамме Origin 8.0 (OriginLab Cor., США). Опреде-

была одинакова (рис. 3). Таким образом, в случае

ляли границы нормального распределения коли-

использования антибиотика, к которому бакте-

чественных показателей выборок с использова-

рии резистентны, в качестве отрицательного кон-

нием критерия Шапиро-Уилка. Поскольку

троля, показано, что бактерии в течение часа не

распределения не соответствовали критериям

утрачивают своей метаболической активности.

нормальности, определяли медиану и 25-й про-

Была проведена серия экспериментов по изу-

центиль. Для сравнения двух выборок использо-

чению изменений АЧХ кантилевера под влияни-

вали непараметрический критерий Вилкоксона.

ем фиксированных на нем бактерий и воздей-

ствующего на бактерии гентамицина сульфата.

Результаты статистической обработки DFL в се-

РЕЗУЛЬТАТЫ

рии из девяти экспериментов представлены на

Для решения первой задачи была апробирова-

рис. 4.

на фиксация 0.01%-м поли-L-лизином. В случае

использования поли-L-лизина различия в нано-

вибрациях кантилевера в контроле и в опыте бы-

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ли существенными, что говорило о надежной

Механизм действия поли-L-лизина как фик-

фиксации бактерий на кантилевере при сохране-

сирующего агента следующий: имеющий поло-

нии их метаболической активности, поэтому

жительный заряд поли-L-лизин опосредует взаи-

дальнейшие измерения проводили с поли-L-ли-

модействие отрицательно заряженного верхнего

зином.

слоя клеточной стенки бактерий - липополиса-

Были апробированы три вида кантилеверов.

харида с кантилевером через электростатические

Изначально были выбраны нитрид кремниевые

«слабые» взаимодействия [13]. Судя по кривым

кантилеверы, поскольку их жесткость ниже, чем у

нановибрации, такое взаимодействие не оказы-

кремниевых. Из трех апробированных вариантов

вает существенного влияния на метаболизм бак-

кантилеверов наилучшим образом подходили

терий. Существенное усиление нановибраций

БИОФИЗИКА том 66

№ 6

2021

НАНОВИБРАЦИИ КАНТИЛЕВЕРА АТОМНО-СИЛОВОГО МИКРОСКОПА

1119

Рис. 2. Кривые нановибраций кантилевера: (а) - кантилевер без бактерий, функционализированный поли-L-лизи-

ном, (б) - кантилевер с фиксированными на нем поли-L-лизином E. coli, (в) - кантилевер с фиксированными на нем

поли-L-лизином E. coli после обработки гентамицином (16 мг/мл).

кантилевера в случае использования поли-L-ли-

ные физико-химические характеристики, по-

зина говорило о том, что бактерии успешно адге-

скольку у этого типа кантилеверов наибольшая,

зируются на поверхности кантилевера, а их мета-

хотя все равно низкая ригидность, и наибольшая

болическая активность при этом не нарушается.

среди используемых кантилеверов резонансная

частота. Однако, вероятнее всего, основная при-

Исследование разных кантилеверов для реше-

чина максимальных «метаболических» нановиб-

ния задачи регистрации нановибраций показало,

раций с наименьшим уровнем шума заключалась

что наилучшие показатели с наименьшим уров-

в присутствии только одного кантилевера, тогда

нем шума дает использование кантилеверов

как на двух других протестированных чипах

А-MLCT со следующими характеристиками: f₀ -

сформирована «гребенка»: из двух кантилеверов в

22 кГц, k - 0.07 Н/м. Одной из причин хороших

случае D-DNP (f₀ - 12-24 кГц, k - 0.06 Н/м) и пя-

результатов, получаемых с использованием дан-

ного типа кантилевера, могли являться оптималь-

ти кантилеверов - в случае С-MLCT (f₀ - 4-

БИОФИЗИКА том 66

№ 6

2021

НАНОВИБРАЦИИ КАНТИЛЕВЕРА АТОМНО-СИЛОВОГО МИКРОСКОПА

1121

усиление нановибраций, связанное с собствен-

БЛАГОДАРНОСТИ

ной метаболической активностью бактериальных

Авторы выражают искреннюю признатель-

клеток. Первоначально высказанная гипотеза о

ность проф. Sandor Kasas - автору первичной

том, что усиление нановибраций кантилевера

идеи использования кантилеверов для регистра-

обусловлено двигательной активностью за счет

ции антибиотикорезистентности бактерий.

жгутиков бактерий, оказалась несостоятельной,

поскольку существенные изменения АЧХ зафик-

сированы и у безжгутиковых форм, например, у

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

грамположительных бактерий - Staphylococcus

Работа выполнена при финансовой поддержке

aureus, дрожжеподобных грибов - Candida albi-

Российского научного фонда (проект № 16-14-

cans, дрожжей - Saccharomyces cerevisiae [14]. В на-

10179).

стоящее время доказанным считается факт, что

усиление нановибраций кантилевера в присут-

ствии всех видов микроорганизмов обусловлено

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

именно метаболической активностью живых кле-

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

ток. В случае гибели клеток и в отсутствие мета-

интересов.

болических реакций нановибрации кантилевера

возвращаются к исходному уровню. Именно это

наблюдалось нами в случае воздействия на E. coli

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

бактерицидных концентраций гентамицина

Настоящая статья не содержит каких-либо ис-

сульфата, механизм действия которого обуслов-

следований с участием людей или животных в ка-

лен необратимым связыванием с 30S-субъедини-

честве объектов исследований.

цей бактериальной рибосомы и блокадой синтеза

бактериального белка. В то же время под воздей-

ствием цефтриаксона, механизм действия кото-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

рого связан с нарушением синтеза пептидоглика-

1. N. A. Lerminiaux and A. D. S. Cameron, Can. J. Mi-

на клеточной стенки и аутолизом бактерий и для

crobiol. 65 (1), 34 (2019).

которого у данного штамма предварительно была

2. Р. В. Полибин, А. Я. Миндлина, А. А. Герасимов и

определена резистентность, в ходе часовой инку-

др., Эпидемиология и вакцинопрофилактика 3

бации не выявлено подавление жизнедеятельно-

(94), 4 (2017).

сти бактерий.

3. Е. В. Наумкина, Е. В. Матущенко, О. А. Аброси-

Статистическая обработка вариансы DFL у

мова и др,, Клинич. лабораторная диагностика 63

кантилеверов разных партий (но всегда кантиле-

(2), 113 (2018).

веров А-MLCT) показала, что часовая экспози-

4. Ю. Б. Белан и М. Б. Старикович, Педиатрическая

ция в растворе гентамицина сульфата вызывает

фармакология 4 (4), 42 (2007).

статистически значимое падение в сравнении с

5. J. Piret and G. Boivin, Curr. Opin. Infect. Dis. 29 (6),

вариансами DFL кантилеверов, на которых фик-

654 (2016).

сированы бактерии без воздействия. Таким обра-

6. Л. М. Иванова, Е. П. Баранцевич и Е. В. Шляхто,

зом, выбранный критерий - варианса DFL - яв-

Проблемы мед. микологии 13 (1), 14 (2011).

ляется информативным критерием, позволяю-

7. M. R. Hassett, B. E. Riegel, P. S. Callaghan, et al., Bio-

щим оценивать чувствительность бактерий к

chemistry 56 (41), 5615 (2017).

антибиотикам.

8. P. Stupar, O. Opota, G. Longo, et al., Clin. Microbiol.

Infection 23, 400 (2017).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

9. A. Boisen, S. Dohn, S. S. Keller, et al., Rep. Prog. Phys.

74 (3), 1 (2011).

Проведенное исследование показало, что ис-

10. J. Tamayo, P. M. Kosaka, J. J. Ruz, et al., Chem. Soc.

пользование нановибраций кантилевера для де-

Rev. 3, 1 (2013).

текции резистентности/чувствительности бакте-

11. S. Aghayee, C. Benadiba, J. Notz, et al., J. Mol. Recog-

рий к антибиотикам является высокоэффектив-

nit. JMR 26 (11), 590 (2013).

ным, поскольку позволяет дать ответ о наличие

12. С. Н. Плескова, Р. Н. Крюков, С. З. Бобык и др.,

антибиотикорезистентности в течение часа, в от-

Биофизика 65 (1), 80 (2020).

личие от имеющихся в настоящее время в распо-

ряжении бактериологических лабораторий мето-

13. S. N. Pleskova, E. R. Mikheeva, and E. E. Gornostae-

дов определения чувствительности бактерий к

va, Micron 105, 82 (2018).

антибиотикам, которые предоставляют инфор-

14. R. G. Willaert, P. V. Boer, A. Malovichko, et al., Sci.

мацию через несколько суток.

Advances 6 (26), 1 (2020).

БИОФИЗИКА том 66

№ 6

2021