БИОФИЗИКА, 2021, том 66, № 6, с. 1137-1143

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 547.42: 612.111

РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ НЕКОТОРЫХ ЧЕРНОМОРСКИХ

РЫБ ПРИ ГИПООСМИИ И ВОЗДЕЙСТВИИ НЕИОННЫХ ДЕТЕРГЕНТОВ

ТРИТОНА Х-100 И ТВИНА-20

Карадагская научная станция им. Т. И. Вяземского - природный заповедник РАН,

298188, Крым, Феодосия, п/о Курортное, ул. Науки, 24

E-mail: ysilkin@mail.ru

Поступила в редакцию 02.09.2020 г.

После доработки 24.02.2021 г.

Принята к публикации 20.09.2021 г.

У четырех видов черноморских рыб - ставриды (Trachurus mediterraneus ponticus Aleev), ласкиря (Di-

plodus annularis L.), скорпены (Scorpaena porcus L.) и морской лисицы (Raja clavata L.) - исследованы

осмотическая резистентность эритроцитов и влияние на гемолитическую активность красных кле-

ток крови при гипоосмии неионных детергентов тритона Х-100 и твина-20. Показано, что в физио-

логических растворах при гипоосмии эритроциты морской лисицы и скорпены проявляли высокую

резистентность к действию гипотонической среды. Определение концентрации физиологического

раствора, в котором за время инкубации гемолизировалось 50% эритроцитов рыб (С_50%) позволило

ранжировать эритроциты рыб по степени осмотической устойчивости в следующем порядке: скор-

пена > морская лисица > ласкирь > ставрида. Эритроциты исследованных костистых рыб демон-

стрировали по С_50% четкую зависимость от подвижности, которая возрастала в ряду рыб с уменьше-

нием их двигательной активности. Тритон Х-100 не вызывал повышение резистентности или даже

слабо стимулировал повышение гемолитической активности эритроцитов ласкиря и морской лиси-

цы. В эритроцитах ставриды в присутствии тритона Х-100 резистентность клеток возрастала в

4.7 раза в инкубационной среде с 50%-м разведением. Протекторные свойства тритона Х-100 отме-

чены при инкубации эритроцитов скорпены в средах с 70%-м разведением. Твин-20 также увеличи-

вал резистентность эритроцитов рыб к гемолизу. Результаты работы показали, что твин-20 и в не-

которых случаях тритон Х-100 могут быть использованы для поддержания стабильности суспензий

эритроцитов рыб при проведении экспериментальных исследований.

Ключевые слова: резистентность, эритроциты, плазматическая мембрана, гипоосмия, детергенты,

рыбы.

DOI: 10.31857/S0006302921060090

Одной из важнейших характеристик эритро-

циям. Действительно, рыбы функционируют в

цитов, которая обеспечивает их устойчивость к

стрессовых условиях, связанных с гипоксией, го-

деформационным нагрузкам при движении в

лоданием, перепадами температуры, интоксика-

кровотоке и другим стрессовым воздействиям,

циями, болезнями и так далее. Все это отражается

является резистентность их плазматической мем-

на морфофункциональных свойствах плазмати-

браны. Резистентность мембраны - это инте-

ческой мембраны эритроцитов, очень важной ор-

гральная характеристика, которая позволяет оце-

ганелле этих клеток, без нормального функцио-

нить способность эритроцита противостоять

нирования которой невозможна полноценная

стрессовым воздействиям, возникающим в плаз-

газотранспортная функция. Одним из экспери-

ме крови в ответ на воздействия факторов среды.

ментальных приемов, позволяющим изучать рас-

Эритроциты млекопитающих функционируют в

тяжение плазматической мембраны эритроци-

кровяном русле с достаточно постоянными пара-

тов, является помещение их в гипоосмотические

метрами, такими как температура, уровень глике-

среды. Резистентность к подобному воздействию

мии, ионов, рН и др. Эритроциты низших позво-

позволяет выяснить такую важную характеристи-

ночных и, в частности, рыб, функционируют в

ку, как наличие или отсутствие мембранного «ре-

менее упорядоченных условиях, поэтому имеют

зерва», или складчатости мембраны. Дело в том,

большую автономность и должны быть наделены

что плазматическая мембрана эритроцитов край-

особой резистентностью к стрессовым флуктуа-

не слабо приспособлена к растяжению на разрыв

1137

1138

CИЛКИН и др.

[1]. Ее способность противостоять гипоосмотиче-

пункции сердца и сосудов рыб. Гепарин также до-

скому набуханию обусловлена прежде всего на-

бавляли в отмывающий физиологический рас-

личию складок в ее структуре. Известно, что у

твор рыб из расчета 1 мл на 10 мл омывающей

низших позвоночных эритроциты обладают

среды. Полученную кровь помещали в физиоло-

бóльшей складчатостью по сравнению с эритро-

гический раствор в соотношении 1 : 10, центри-

цитами млекопитающих. По этой причине эрит-

фугировали на рефрижераторной центрифуге

роциты низших животных обладают меньшей ос-

К-23 (MLW, Германия) и осуществляли осажде-

мотической хрупкостью в гипоосмотических сре-

ние форменных элементов крови центрифугиро-

дах [2]. Осмотическая хрупкость эритроцитов

ванием в течение 5 мин при 1000-1500 об/мин.

определяется не только свойствами мембраны

После центрифугирования эритроциты отделяли

эритроцитов, но также модифицирующим влия-

от лейкоцитов и плазмы (процедуру проводили

нием некоторых веществ, способных встраивать-

дважды). Полученные эритроциты разводили до

ся в мембранный бислой и изменять соотноше-

определенного гематокрита (Ht = 25%) и исполь-

ние площади поверхности клетки к ее объему. К

зовали клетки для определения их устойчивости в

таким веществам относятся детергенты и мембра-

различных гипоосмотических условиях. Для это-

нотропные вещества [3].

го в стеклянные центрифужные пробирки поме-

В настоящем исследовании проводили сравне-

щали по 2 мл гипоосмотического раствора 30, 50

ние резистентности эритроцитов рыб разной эко-

и 70%-го разведения, а также дистиллированную

логии в различных гипотоничных средах и влия-

воду. Затем в гипоосмотическую среду добавляли

ние слабых неионных детергентов Тритон Х-100 и

по 20 мкл суспензии эритроцитов, перемешива-

Твин-20 на устойчивость эритроцитов рыб в этих

ли, через 5 мин проводили центрифугирование

средах.

(5 мин, 1000-1500 об/мин). Надосадочную жид-

кость отбирали и определяли ее оптическую

плотность на спектрофотометре с использовани-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ем светофильтра с длиной волны в 550 нм.

Для изучения влияния детергентов на осмотиче-

Объектами исследования служили эритроци-

ты хрящевой рыбы - ската, морской лисицы

скую хрупкость эритроцитов использовали три-

(Raja clvata L.) и костистых рыб - ставриды (Tra-

тон Х-100 и твин-20, которые добавляли в пробы

churus mediterraneus ponticus Aleev), ласкиря (Diplo-

в количестве 20 мкл до конечной концентрации в

dus annularis L.), скорпены (Scorpaena porcus L.).

инкубационной среде, равной 0.01%.

Костистые рыбы, осмотическая резистент-

Результаты выражали в процентах, за 100%

ность эритроцитов которых исследована в насто-

брали самый высокий показатель распада клеток,

ящей работе, различались по уровню естествен-

когда гемоглобин выходил из эритроцита и окра-

ной подвижности. Ставрида - быстроплавающий

шивал раствор в красный цвет. По отношению к

вид, осуществляющий значительные миграции.

нему рассчитывали процентную долю распада

Ласкирь - оседлый, прибрежный вид, характери-

клеток в других гипотоничных средах по фор-

зуется умеренной подвижностью с хорошими ма-

муле:

невренными свойствами. Скорпена - оседлый

вид, донная, малоподвижная, рыба - хищник-за-

% Hem = (E_о/E_max) × 100,

садчик. Исследуемый скат - морская лисица -

холодолюбивый вид, не отличается значительной

где E_о - экстинкция пробы, E_max - экстинкция,

активностью движения, однако для него харак-

соответствующая 100%-му гемолизу.

терны довольно длительные миграции с неболь-

шой скоростью [4].

Для количественной оценки осмотической ре-

Кровь получали пункцией хвостовой артерии

зистентности эритроцитов использовали величи-

стеклянной пипеткой у костистых рыб и пункци-

ну осмотичности инкубационной среды (физио-

ей желудочка сердца шприцем - у хрящевых. У

логического раствора), соответствующую 50%-му

ската на опыт хватало крови от одной особи, а у

гемолизу клеток (С_50%), - центр распределения

костистых рыб - от пяти-семи особей. Получен-

эритроцитов по осмотической резистентности

ную кровь помещали (в соотношении 1:20) в со-

[5].

ответствующий физиологический раствор следу-

ющего состава: для костистых рыб - 0.18 М

Все результаты подвергали статистической об-

NaCl + 0.01 М трис-HCl, pH 7.4; для хрящевых

работке. Результаты были получены при проведе-

рыб - 0.22 М NaCl + 0.3 М мочевины + 0.05 М

нии пяти-двенадцати независимых эксперимен-

трис-HCl, pH 7.4. Для предотвращения сворачи-

тов. Данные подвергали статистической обработ-

ваемости крови использовали 5%-й раствор гепа-

ке и представляли как среднее арифметическое ±

рина, которым прополаскивали пипетку, иглу и

стандартное отклонение, достоверность разли-

внутреннюю часть шприца, применяемых для

чий оценивали при помощи критерия Стьюдента.

БИОФИЗИКА том 66

№ 6

2021

РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ

1139

Влияние гипоосмотической среды и неионных детергентов на количество распавшихся эритроцитов рыб разной

экологии

Изото-

Степень

Степень гипотонично-

Степень гипотоничности

нич-

гипотоничности среды

сти среды (% разведе-

Изо-

среды (% разведения физ.

ная

(% разведения физ.

Изото-

ния физ. раствора +

тонич-

раствора)

раствора + 0,01%

среда

ничная

0.01% твин-20)

ная

(физ.

тритона Х-100)

среда

рас-

(физ.

твор +

раствор

Вид рыб

С_{50 %}

рас-

0.01%

+ 0,01%

твор,

три-

твин-20,

кон-

тона

кон-

30%

50%

70%

(дист.

30%

50%

70%

30%

50%

70%

троль

Х-100,

троль

H₂O)

№ 1)

кон-

№ 3)

троль

№ 2)

4.5 ±

7.2 ±

75.5 ±

100.0 ±

85.0 ±

45.0 ±

6.5 ±

8.9 ±

16.2 ±

100.0 ±

Став-

0.3

0.5

7.2*

0.0*

7.0*

2.0

0.1

0.5

1.2*(**)

0.0*

рида

n = 7

n = 9

n = 5

n = 10

n = 12

n = 5

n = 7

n = 5

n = 10

3.5 ±

3.8 ±

5.6 ±

100.0 ±

95.0 ±

60.0 ±

5.0 ±

6.0 ±

10.0 ±

100.0 ±

Ласкирь

0.4

0.7

0.0*

3.0*

3.5

0.5

0.3

0.5

0.0*

n = 4

n = 5

n = 4

1.7 ±

2.4 ±

3.2 ±

84.3 ±

100.0 ±

64.0 ±

2.4 ±

3.6 ±

4.5 ±

72.6 ±

0.5 ±

1.6 ±

2.4 ±

73.0 ±

Скор-

0.1

0.2

0.3

3.9*

0.0*

2.8

0.2

0.1

0.4

2.9 *(**)

0.1**

0.2

0.6

1.1*

пена

n = 9

n = 8

n = 12

n = 5

n = 9

n = 8

n = 9

n =9

2.3 ±

3.3 ±

10.7 ±

75.2 ±

100.0 ±

62.5 ±

2.0 ±

3.5 ±

8.6 ±

72.9 ±

2.0 ±

2.8 ±

8.9 ±

70.6 ±

Морская

0.3

0.4

1.7

0.5*

0.0*

4.4

0.2

0.3

0.8

1.5*

0.3

0.1

0.4

0.4*

лисица

N = 6

n = 6

n = 5

n = 4

n= 5

n = 5

Примечание. С_50% - степень разведения физиологического раствора (в %), при котором происходит гемолиз 50%

инкубированных эритроцитов рыб; n - число повторных опытов; * - достоверные различия по сравнению с распадом клеток

в контрольных средах собственных серий опытов с p < 0.05; ** - достоверные различия по сравнению с распадом клеток в

средах без добавления детергента с p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

тельно: у скорпены - до 2.4%, у ласкиря - до

3.8%, у морской лисицы - до 3.3% и у ставриды -

Полученные результаты по влиянию гипоос-

до 7.2%. В 50%-й гипотоничной среде клетки

мотических растворов разной концентрации и

скорпены сохраняли определенную устойчивость

действия неионных детергентов на устойчивость

(до 3.2%), тогда как у других рыб гемолиз клеток

эритроцитов рыб представлены в таблице.

был более выражен и составлял у ласкиря 5.6%, у

Как видно из таблицы, часть эритроцитов в

морской лисицы - 10.7%. Эритроциты ставриды

изотонических для рыб растворах подвергалась

в этих условиях демонстрировали самую высокую

распаду. В ряду костистых рыб самыми стойкими

гемолитическую способность (75.5%). При повы-

были эритроциты скорпены, которые имели са-

шении гипотоничности среды до 70% от исход-

мый низкий показатель гемолиза, равный 1.7%.

ной практически все клетки ставриды и ласкиря

Затем следовали эритроциты ласкиря - 3.5%,

гемолизировались, тогда как часть клеток мор-

эритроциты ставриды были самыми хрупкими -

ской лисицы и скорпены (25 и 15% соответствен-

их показатель гемолиза равнялся 4.5%. Эритро-

циты морской лисицы по устойчивости немного

но) сохраняли свою устойчивость в этих средах

уступали клеткам скорпены, их показатель гемо-

(см. таблицу). В дистиллированной воде эритро-

лиза составлял 2.3%. В слабо гипотоничных сре-

циты рыб должны были бы демонстрировать

дах, в которых физиологический раствор был

100%-й гемолиз, но у ставриды и ласкиря показа-

разбавлен дистиллированной водой на 30%, раз-

тели экстинкции растворенного гемоглобина

рушение клеток у рыб увеличивалось незначи-

были меньше, чем в гипоосмотической среде с

БИОФИЗИКА том 66

№ 6

2021

1140

CИЛКИН и др.

70%-м разведением (на 15 и 5% соответственно,

собственного контроля вызывал рост гемолиза

см. таблицу).

по мере увеличения разведения инкубационной

среды.

Устойчивость эритроцитов к гипоосмии хоро-

шо демонстрировала величина С_50%. Эти данные

свидетельствовали о том, что самыми устойчивы-

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ми из исследованных рыб были эритроциты скор-

Проведенные исследования показали, что

пены и морской лисицы, а самыми хрупкими -

эритроциты разных черноморских рыб имели су-

эритроциты ласкиря и ставриды. Кроме того,

щественные различия по осмотической рези-

эритроциты исследованных костистых рыб демон-

стентности. Факт различной резистентности

стрировали по С_50% четкую зависимость от по-

эритроцитов рыб к действию гипотоничных рас-

движности, которая возрастала в ряду рыб с умень-

творов известен достаточно давно [6], в настоя-

шением их двигательной активности (см. таблицу).

щее время основные исследования направлены

Внесение в физиологический раствор 0.01%

на выяснение причин такой гетерогенности. Мы

Тритона Х-100 приводило к стимуляции гемолиза

исследовали резистентность эритроцитов у трех

эритроцитов костистых рыб и не вызывало изме-

видов костистых рыб (ставрида, ласкирь, скорпе-

нений гемолитической активности эритроцитов

на), различающихся по двигательной активности,

морской лисицы (таблица, контроли № 1 и № 2).

и одного хрящевого вида - морской лисицы.

При гипоосмии действие тритона Х-100 на гемо-

Принципиальным отличием между хрящевыми и

лиз эритроцитов рыб был индивидуален для каж-

костистыми рыбами является наличие в плазме

дого исследованного вида. У ставриды при 30%

скатов высокой концентрации мочевины

разведении тритон Х-100 не изменял гемолитиче-

(300 ммолей), обеспечивающей высокое осмоти-

ской активности эритроцитов, в то время как при

ческое давление крови. Высокое осмотическое

50% гипоосмии тритон Х-100 в 4.7 раза тормозил

давление крови, по мнению ряда авторов [6, 7],

гемолиз и тем самым выполнял стабилизирую-

существенным образом снижает осмотическую

щую роль для плазматической мембраны эритро-

резистентность эритроцитов у селяхий (Selachi-

цитов ставриды. Стабилизация мембраны эрит-

morpha). Наши данные не подтверждают эту зако-

роцитов (на 16%) в присутствии тритона Х-100 от-

номерность. Эритроциты морской лисицы обла-

мечена и у скорпены, но при 70%-м разведении

дали существенно большей резистентностью к

среды. У ласкиря и морской лисицы эффекта ста-

гипоосмии по сравнению с эритроцитами ставри-

билизация плазматической мембраны эритроци-

ды и ласкиря. Более того, эритроциты ската со-

тов тритоном-Х100 не была отмечена. У этих ви-

всем немного уступали по этому показателю

дов рыб при гипоосмии тритон Х-100 умеренно

эритроцитам скорпены, показавшей самый высо-

стимулировал гемолиз, его действие соответство-

кий уровень гипоосмотической устойчивости

вало природе этого неионного детергента. Такая

среди исследованных рыб (см. таблицу). В отно-

же тенденция воздействия тритона Х-100 в эрит-

шении морских костистых рыб одни авторы счи-

роцитах этих рыб сохранялась при сравнении

тают, что их эритроциты имеют меньшую гипоос-

влияния гипоосмии в присутствии детергента с

мотическую резистентность, чем у проходных и

их собственным контролем (контроль № 2).

пресноводных видов. Более того, резистентность

эритроцитов у молоди кеты (Oncorhynchus keta)

Добавление в инкубационную среду другого

может значительно ухудшаться в процессе смол-

неионного детергента - твин-20 - вызывало по-

тификации мальков, как бы подтверждая факт

вышение резистентной способности эритроци-

большей устойчивости эритроцитов у рыб, нахо-

тов скорпены Как видно из данных таблицы, в

дящихся в пресноводной среде [7]. Напротив,

изотоничных средах (контроли № 1 и № 3) гемо-

другие авторы [8] показали, что эритроциты мор-

лиз эритроцитов скорпены в присутствии твин-

ских рыб имели более высокую резистентность,

20 уменьшался в три раза. В гипотоничных средах

чем пресноводные рыбы. Известно, что сниже-

с твин-20 гемолитическая активность клеток

ние солености водной среды в целом коррелиро-

скорпены относительно гипоосмии без детерген-

вало со снижением устойчивости эритроцитов

та, снижалась с меньшей интенсивностью - от 13

рыб к гемолизу.

до 34%. При сравнении действия твин-20 при ги-

поосмии с собственным контролем (контроль

У исследованных нами рыб можно отметить

№ 3) видно, что детергент закономерно стимули-

более высокую резистентность эритроцитов у ме-

ровал гемолиз эритроцитов с уменьшением осмо-

нее активных (скорпена) и холодоустойчивых

тичности среды. У морской лисицы в изотониче-

(морская лисица) видов. Кроме того, в ряду ко-

ских средах твин-20 не вызывал изменений в ге-

стистых рыб прослеживается четкая зависимость

молитической активности эритроцитов, а в

резистентности эритроцитов рыб от их подвиж-

гипотонических средах действовал, как и у скор-

ности, которая закономерно возрастает с умень-

пены, аналогичным образом - тормозил гемолиз

шением двигательной активности. Причины этой

в клетках этого вида на 7-20%, а относительно

закономерности неизвестны. Возможно, высокая

БИОФИЗИКА том 66

№ 6

2021

РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ

1141

резистентность клеток обусловлена особенностя-

немного физиологического раствора до концен-

ми фосфолипидного состава плазматических

трации 1-2‰ и проверяли оптическую плот-

мембран эритроцитов скорпены и морской лиси-

ность супернатантов. Результаты показали, что в

цы. Липидный состав играет центральную роль в

присутствии низкоосмотичного солевого раство-

функции клеточных мембран и определяет ее фи-

ра оптическая плотность супернатанта возрастала

зические свойства, такие как проницаемость, те-

до 90-95%, что указывало на переход части агре-

кучесть, резистентность к внешним и внутрен-

гированного гемоглобина в раствор. Таким обра-

ним факторам среды. Важным фактором стабиль-

зом, отсутствие 100%-го гемолиза эритроцитов у

ности плазматической мембраны являются

ставриды и ласкиря в дистилляте является арте-

особенности структурной упаковки ее фосфоли-

фактом, вызванным либо осаждением макромо-

пидного бислоя [9]. При определении фосфоли-

лекулярного гемоглобина, либо частичной ад-

пидного состава мембран эритроцитов морских

сорбций гемоглобина нерастворимым в воде кле-

рыб нами ранее было показано [10], что плазма-

точным материалом.

тические мембраны морской лисицы и скорпены

Детергенты по своим свойствам относятся к

имели самые высокие индексы насыщенности

амфифильным молекулам и, следовательно, бла-

жирных кислот, входящих в состав их фосфоли-

годаря этому могут встраиваться в мембрану, вы-

пидов. Этот факт является подтверждением более

зывать перегруппировки ее компонентов и в ко-

упорядоченной упаковки плазматических мем-

нечном итоге экстрагировать липиды и белки в

бран у этих видов в сравнении с другими рыбами,

мицеллярные структуры. По этой причине детер-

что может играть решающую роль в их высокой

генты играют важную роль в изучении состава и

гипоосмотической резистентности. Хорошим до-

свойств мембран [11]. Уже достаточно давно было

полнением к установленным закономерностям

установлено, что неионные детергенты (тритон

явилось определение концентрации физиологи-

Х-100, твины-20-40-80) в малых концентрациях

ческого раствора, при котором происходит 50%-й

способны стабилизировать мембрану эритроци-

гемолиз инкубированных эритроцитов рыб

тов от гипотонического гемолиза, тогда как в

(С_50%). В соответствии с определенными нами ве-

больших концентрациях они вызывали солюби-

личинами С_50% осмотическая устойчивость эрит-

лизацию мембран и гемолиз эритроцитов [12, 13].

роцитов исследованных рыб распределялась сле-

Установлено, что для эритроцитов протекторные

дующим образом: самыми устойчивыми были

свойства тритона Х-100 и твин-20 максимальны

эритроциты скорпены, затем следовали эритро-

при их концентрации, равной 0.01% [14]. В наших

циты морской лисицы, ласкиря и самыми осмо-

исследованиях мы использовали такие же кон-

тически хрупкими оказались эритроциты ста-

центрации детергентов для выяснения их воздей-

вриды.

ствия на мембраны эритроцитов рыб. Как видно

из таблицы, тритон Х-100 не защищал мембраны

При глубокой гипоосмии, когда разведение

эритроцитов ласкиря и морской лисицы от гипо-

физиологического раствора достигало 70%, эрит-

осмотического воздействия среды. При этом у

роциты рыб гемолизировались либо на 100% (ста-

ласкиря присутствие тритона Х-100 стимулирова-

врида, ласкирь), либо в подавляющей своей мас-

ло гемолиз, а в эритроцитах морской лисицы этот

се: у скорпены - на 85%, а у морской лисицы - на

эффект не проявлялся. Действие тритона Х-100

75%. Можно было бы ожидать, что в чистой ди-

на эритроциты скорпены при низких разведениях

стиллированной воде все эритроциты должны

среды (на 30-50%) не изменяло гемолитической

показать 100%-й гемолиз. Однако у некоторых

активности клеток, тогда как при более высоких

видов рыб (ставрида, ласкирь) оптическая плот-

разведениях отмечался слабый протекторный эф-

ность растворов была меньше 100%. Как мы пола-

фект детергента. Наибольшие протекторные

гаем, возможны две причины этой «аномальной»

свойства тритона Х-100 были отмечены для эрит-

оптической плотности. Первая причина состоит в

роцитов ставриды в гипоосмотических средах с

том, что часть эритроцитов остается негемолизи-

50%-м разведением. В этих условиях в присут-

рованной в дистиллированной воде и, таким об-

ствии детергента торможение гемолиза было зна-

разом, не происходит выделение части гемогло-

чительным и в 4.7 раза увеличивало резистент-

бина в надосадочную жидкость. Вторая причина,

ность клеток в сравнении с контролем. Причины

возможно, связана с тем, что полный гемолиз

столь различного отношения клеток к действию

эритроцитов осуществляется, но в дистиллиро-

тритона Х-100 скорее всего обусловлены струк-

ванной воде часть высвобожденного клетками ге-

турной организацией плазматической мембраны

моглобина, связанного с водой, как бы образует

эритроцитов этих рыб. Мы уже указывали на то,

пересыщенный раствор и осаждается в процессе

что плазматические мембраны скорпены и мор-

центрифугирования вместе с другими фрагмента-

ской лисицы имели самые высокие индексы на-

ми разрушенных клеток или же часть гемоглоби-

сыщенности жирных кислот, т.е. имели самые

на сорбируется этими фрагментами. Для провер-

жесткие ацильные цепи их фосфолипидов. Авто-

ки второй причины в пробирки добавляли

ры работы [9] с помощью ЭПР-спектроскопии

БИОФИЗИКА том 66

№ 6

2021

1142

CИЛКИН и др.

показали, что устойчивость к детергентам у мем-

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

бран выше, когда ацильные цепи более насыще-

Работа выполнена в рамках темы Государ-

ны. При этом наблюдается более плотная упаков-

ственного задания № АААА-А19-119012490045-0

ка бислоя, что и является определяющим факто-

«Изучение фундаментальных физических, фи-

ром устойчивости таких мембран к действию

зиолого-биохимических, репродуктивных, попу-

тритона Х-100 и других детергентов.

ляционных и поведенческих характеристик мор-

ских гидробионтов».

Протекторные свойства к гипоосмотическому

воздействию среды на эритроциты рыб кроме

тритона Х-100 демонстрировал и твин-20 (см.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

таблицу). Это выражалось в уменьшении гемоли-

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

тической активности эритроцитов рыб как в кон-

интересов.

троле (физиологический раствор), так и при ги-

поосмотической нагрузке. В основе такого про-

текторного действия твина-20 и тритона Х-100

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

лежит способность неионных детергентов в ма-

В экспериментах соблюдали принципы гуман-

лых концентрациях интеркалировать (встраи-

ности, изложенные в директивах Европейского

ваться) в мембрану и увеличивать ее площадь.

Сообщества (2010/63 EU) и положении ИВНД и

НФ РАН о работе с экспериментальными живот-

Считается, что наиболее важным параметром

ными.

эритроцита является отношение площади по-

верхности клетки к ее объему. В нормальном

эритроците человека это соотношение равно 1.9.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Это означает, что эритроциты человека могут по-

1. А. Я. Потапенко, А. А. Кягова и А. М. Тихомиров,

чти в два раза увеличить свой объем без измене-

Осмотическая устойчивость эритроцитов. Учеб-

ния площади мембраны. Плазматическая мем-

ное пособие (ГОУ ВПО ГРМУ, 2006).

брана эритроцитов сопротивляется трем видам

2. С. И. Головко, Автореф. дисс. … канд. биол. наук

деформации: растяжению - сжатию, сопровож-

(Ярославль, 2010).

дающемуся изменением площади мембраны; де-

3. A. M. Seddon, P. Curnow, and P. J. Booth, Biochim.

формации сдвига, без изменения площади; де-

Biophys. Acta 1666, 105 (2004).

формации изгиба [15]. Увеличение площади по-

4. А. Н. Световидов, Рыбы Черного моря. (Наука, М.,

верхности мембраны эритроцита за счет

1964).

растяжения на 3% приводит к ее разрыву [16].

Твин-20 и тритон Х-100 благодаря тому, что они

5. М. А. М. Аль-Рабии, Ш. И. Чалабов, М. Д. Астаева

и Н. К. Кличханов, Современные проблемы науки

могут встраиваться в мембрану и увеличивать

и образования 2015 (3), 17364 (2015). URL: http://

площадь ее поверхности, тем самым уменьшают

www.science-education.ru/ru/article/view?id=17364.

отношение площади поверхности к объему в

эритроцитах некоторых рыб. Поэтому чтобы осу-

6. Г. Н. Калашников, Уч. записки МГУ 33, 65 (1939).

ществить разрыв мембраны при гипоосмотиче-

7. Е. Е. Изергина и И. Л. Изергин, Исследование вод-

ской нагрузке клетки нужно помещать в более

ных биологических ресурсов Камчатки и северо-

разбавленный солевой раствор, чем до воздей-

западной части Тихого океана 23, 18 (2011).

ствия детергентов. Таким образом, исследован-

8. А. М. Андреева, И. П. Рябцева, И. И. Руднева и др.,

ные неионные детергенты по-разному воздей-

Вестн. СПбГУ 3 (4), 3 (2013).

ствовали на устойчивость мембран эритроцитов

9. P. V. Rodi, V. M. Trucco, and A. M. Gennaro, Biophys.

рыб. Тритон Х-100 почти не оказывал протектор-

Chem. 135 (1-3), 14 (2008).

ных свойств и вызывал усиление гемолиза в эрит-

10. Yu. A. Silkin, E. N. Slkina, and S. A. Zabelenskii, J.

роцитах ласкиря и морской лисицы, но кратно (в

Evol. Biochim. and Physiol. 48 (1), 43 (2012).

4.7 раза) понижал осмотическую хрупкость эрит-

11. D. Linke, Methods Enzymol. 463, 603 (2009).

роцитов ставриды в инкубационных средах с

12. P. Seeman, Biochem. Pharmacol. 15, 1753 (1966).

50%-м разведением инкубационной среды, а в

13. H. Hägerstrand and B. Isomaa, Chem. Biol. Interact.

эритроцитах скорпены - на 16% даже в 70%-х ги-

79 (3), 335 (1991).

поосмотических средах. Твин-20 характеризовал-

ся выраженным протекторным эффектом в эрит-

14. K. A. Riske, C. C. Domingues, B. R. Casadei, et al.,

роцитах всех исследуемых рыб в изо- и гипотони-

Biophys. Rev. 9, 649 (2017).

ческих средах. Поэтому твин-20 может быть

15. М. К. Боровская, Э. Э. Кузнецова, В. Г. Горохова

использован для поддержания стабильности сус-

и др., Бюл. ВСНЦ СО РАМН 3 (73), 334 (2010).

пензий эритроцитов рыб при проведении экспе-

16. Э. С. Бабаев, Гематология и трансфузиология 43

риментальных исследований.

(1), 34 (2001).

БИОФИЗИКА том 66

№ 6

2021

РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ

1143

Resistance of Erythrocytes in Some Black Sea Hyposmic Fishes Exposed to Non-Ionic

Detergents Triton-X100 and Tween-20

Yu.A. Silkin, E.N. Silkina, and M.Yu. Silkin

Karadag Scientific Station named after T.I. Vyazemsky - nature reserve of the Russian Academy of Sciences,

ul. Nauki 24, Kurortnoe, Feodosia, Crimea, 298188 Russia

The osmotic resistance of erythrocytes and the hemolytic effect of non-ionic detergents, Triton X-100 and

Tween-20, on red blood cells were analyzed using 4 hyposmiс Black Sea fish species such as horse mackerel

(Trachurus mediterraneus ponticus Aleev), gilthead (Diplodus annularis L.), black scorpionfish (Scorpaena

porcus L.) and thornback ray (Raja clavata L.). It was shown that in physiological solutions, red blood cells

from hyposmic thornback ray and black scorpionfish were highly resistant to hypotonic environment. Deter-

mination of the concentration of physiological solution, in which, during incubation, 50% of fish erythro-

cytes (C_50%) were hemolyzed, it was possible to rank fish erythrocytes according to the degree of osmotic re-

sistance in the following order: black scorpionfish > thornback ray > gilthead > horse mackerel. The eryth-

rocytes of the investigated teleost fishes exhibited a clear dependence on the mobility by C_50%, which in-

creased in some fishes with a decrease in their motor activity. Triton X-100 did not induce an increase in re-

sistance or even weakly stimulated an increase in the hemolytic activity of erythrocytes in gilthead and thorn-

back ray. In the presence of Triton X-100 in horse mackerel erythrocytes, cell resistance increased by a factor

of 4.7 in an incubation medium with 50% dilution. Protective properties of Triton X-100 were seen during

incubation of black scorpionfish erythrocytes in media with 70% dilution. Tween-20 also increased the resis-

tance of fish erythrocytes to hemolysis. The results of this study showed that Tween-20 and, in some cases,

Triton X-100 are useful in maintaining stability of fish erythrocyte suspensions during experimental studies.

Keywords: resistance, erythrocytes, plasma membrane, hyposmia, detergents, fish

БИОФИЗИКА том 66

№ 6

2021