БИОФИЗИКА, 2022, том 67, № 1, с. 30-36

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 535.343.32

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОЦЕНКИ РАЗМЕРА

И КОНЦЕНТРАЦИИ ЛАЗЕРНО-АБЛИРОВАННЫХ

ЗОЛОТЫХ НАНОЧАСТИЦ

А.А. Попов**, Г.В. Тихоновский**, Ю.А. Финогенова*^, **,

А.В. Смирнова*^, **^, ****, Е.Ю. Григорьева*^, **

*Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н. Н. Блохина Минздрава России,

115522, Москва, Каширское шоссе, 24

**Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ», 115409, Москва, Каширское шоссе, 31

ГНЦ РФ «Федеральный медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна»,

123098, Москва, ул. Живописная, 46

***Московский клинический научный центр имени А.С. Логинова Департамента здравоохранения г. Москвы»,

111123, Москва, шоссе Энтузиастов, 86

E-mail: skvseva@yandex.ru

Поступила в редакцию 07.10.2021 г.

После доработки 07.10.2021 г.

Принята к публикации 18.11.2021 г.

Рассматривается возможность использования спектрофотометрического метода для оценки разме-

ра и концентрации золотых наночастиц, полученных методом лазерной абляции. Золотые наноча-

стицы, синтезированные разными методами, имеют различные физико-химические свойства своей

поверхности. Это может влиять на их оптические свойства в коллоидном растворе. В работе полу-

чены результаты, подтверждающие возможность использования спектрофотометрического метода

для оценки размера и концентрации наночастиц, полученных методом лазерной абляции. Показа-

но, что оценку концентрации наночастиц спектрофотометрическим методом оптимально прово-

дить на длине волны 400 нм. Определение размера наночастиц по спектрам поглощения в ультра-

фиолетовой и видимой области возможно для частиц размером не менее 11 нм.

Ключевые слова: золотые наночастицы, радиосенсибилизаторы, спектрофотометрия, коллоидный

раствор.

DOI: 10.31857/S0006302922010045

промышленного уровня метод лазерной абляции

Наночастицы являются перспективной осно-

вой для создания препаратов-радиосенсибилиза-

экономически выгоднее [10]. Однако при получе-

торов в лучевой терапии, а также систем доставки

нии наночастиц золота методом лазерной абля-

лекарственных и рентгеноконтрастных средств

ции максимальная концентрация золота в итого-

[1-4]. Для использования наночастиц в качестве

вом коллоидном растворе наночастиц лимити-

рентгеноконтрастных средств или радиосенсиби-

рована оптической проницаемостью самого

лизаторов необходима концентрация элемента с

раствора для аблирующего лазера и составляет

атомным номером Z > 52 не менее 65 мг/мл [5-7].

порядка ~ 0.1 мг/мл.

Одним из наиболее перспективных и широко ис-

При разработке, исследовании и производстве

пользуемых металлов для синтеза наночастиц яв-

препаратов на основе наночастиц возникает не-

ляется золото.

обходимость проводить простую и быструю оцен-

Существуют два основных принципиально

ку концентрации и размера наночастиц. Для

разных метода получения растворов коллоидного

оценки концентрации и размера золотых наноча-

золота: химический метод Туркевича [8] и физи-

стиц существует множество точных и чувстви-

ческий метод лазерной абляции [9]. При масшта-

бировании производства золотых наночастиц до

тельных методов, таких как методы атомной

эмиссионной спектроскопии и метод электрон-

Сокращениe: ППР - пик плазмонного резонанса.

ной микроскопии.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОЦЕНКИ

Параметры установки с лазером при синтезе золотых наночастиц

Характеристика установки

Кратность единиц измерения

Частота следования лазерных импульсов

100 кГц

Энергия в импульсе

30 мкДж

Длина волны лазерного излучения

1030 нм

Длительность лазерных импульсов

250 фс

Тип фокусирующего объектива

F-theta

Фокусное расстояние объектива

100 мм

Скорость перемещения лазерного луча по поверхности мишени

4 м/с

Методы атомной эмиссионной спектроско-

Теория рассеяния и поглощения света Ми на

пии и масс-спектрометрии с индуктивно связан-

сферических наночастицах связывает положение

ной плазмой имеют пределы обнаружения вплоть

пика плазмонного резонанса в спектре поглоще-

до 0.1 мкг/мл и 0.05 нг/мл соответственно [11].

ния с размером наночастицы [16]. Данная теория

Для определения концентрации золота в колло-

является основой для спектрофотометрического

идном растворе наночастиц данными методами

метода определения размера наночастиц. На ос-

требуется пробоподготовка, которая заключается

нове данной теории в ряде работ определяли раз-

в полном растворении золотых наночастиц в рас-

мер сферических золотых наночастиц, получен-

творе концентрированных азотной и соляной

ных методом Туркевича [17-19]. Однако наноча-

кислот, взятых в соотношении 1 : 3 по объему.

стицы, полученные методом лазерной абляции,

Пробоподготовка образца для исследования мо-

представляют собой смесь сфер и эллипсоидов, в

жет длиться от нескольких часов до суток, что не

связи с чем были предложены уточненные моде-

позволяет проводить быструю оценку концентра-

ли взаимодействия наночастиц со светом [20, 21].

ции раствора. Также данные методы требуют на-

Также при синтезе методом лазерной абляции в

личия дорогостоящего оборудования и расход-

водном растворе на поверхности золотых наноча-

ных материалов для его эксплуатации.

стиц преобладает золото в химической форме

Au-O^- [22]. В то же время при синтезе методом

Для определения размера золотых наночастиц

Туркевича с цитратом на поверхности образуется

электронная микроскопия является одним из

Au-COO^-, а также присутствуют атомы Au³⁺

наиболее точных методов. Данный метод часто

используется в качестве метода сравнения [12-

[23]. Таким образом, наночастицы золота, полу-

ченные методом лазерной абляции, могут иметь

14]. Электронная микроскопия может обеспечить

химические и оптические свойства, отличающие-

точность определения размера наночастиц до де-

ся от наночастиц, полученных методом Турке-

сятых долей нанометра. Однако данный метод

вича.

требует высокой профессиональной квалифика-

ции персонала, трудоемкой обработки изображе-

Учитывая все выше изложенное, целью дан-

ний и дорогостоящего оборудования.

ной работы являлось исследование возможности

применения спектрофотометрического метода

Спектрофотометрический метод позволяет

для оценки размера и концентрации лазерно-аб-

объединить в себе возможность оценки размера и

лированных золотых наночастиц.

концентрации наночастиц. При этом данный ме-

тод отличается простотой исполнения и скоро-

стью анализа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В основе определения концентрации раствора

Золотые наночастицы были синтезированы

спектрофотометрическим методом лежит закон

одностадийным методом фемтосекундной лазер-

Бугера-Ламберта-Бера [15]:

ной абляции в водном растворе 1 мМ NaCl. При

наработке наночастиц были использованы пара-

A = ln(I₀/I) = εCx,

метры лазера, указанные в таблице.

где A - оптическая плотность, I₀ - интенсивность

Массовую концентрацию полученного колло-

светового потока в отсутствии образца, I - интен-

идного раствора определяли гравиметрическим

сивность светового потока в присутствии образ-

путем - взвешиванием абляционной мишени до

ца, ε - коэффициент экстинкции, С - концен-

и после процесса лазерной абляции с последую-

трация образца, x - толщина исследуемого об-

щим делением полученной разницы масс на объ-

разца.

ем используемой жидкости. Массовая концен-

БИОФИЗИКА том 67

№ 1

2022

СКРИБИЦКИЙ и др.

Рис. 1. Спектры поглощения лазерно-аблированных золотых наночастиц различной концентрации.

трация, определенная таким способом, составила

тометр Cary 50 (Varian, США). Измерения прово-

0.1 мг Au/кг.

дили в кварцевой кювете с длиной оптического

пути 10 мм при температуре 20°С.

Для оценки размера наночастиц в качестве ме-

тода сравнения использовали просвечивающий

электронный микроскоп MAIA

3 (TESCAN,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Чехия).

Определение концентрации коллоидного раство-

Для предотвращения агломерации в качестве

ра золотых наночастиц. Был проведен спектраль-

стабилизатора при концентрировании наноча-

ный анализ шести образцов с различными кон-

стиц использовали бычий сывороточный альбу-

центрациями золотых наночастиц одной размер-

мин. К раствору исходных нестабилизированных

ной фракции. Растворы различной концентрации

золотых наночастиц (0.1 мг Au/кг) при переме-

были получены путем разбавления исходного

шивании при комнатной температуре добавляли

стабилизированного коллоидного раствора с

стабилизирующий подготовленный раствор од-

концентрацией 0.08 мг Au/кг. На рис. 1 приведе-

новременно с раствором HEPES с рН 7.0. В ре-

ны спектры поглощения данных растворов.

зультате был получен коллоидный раствор стаби-

лизированных золотых наночастиц с концентра-

Был построен график зависимости массовой

цией 0.08 мг Au/кг.

концентрации золотых наночастиц в растворе от

оптической плотности при длине волны 400 нм.

Для разделения исходного раствора по размер-

Полученные результаты аппроксимированы ли-

ным фракциям использовали центрифугу 5427R

нейной зависимостью, представленной для дли-

(Eppendorf, Германия) с ротором FA-45-30-11.

ны волны 400 нм уравнением y = 117.8x - 1.6 (R >

Центрифугирование исходного раствора золотых

0.99). Градуировочная кривая представлена на

наночастиц проводили с центробежным ускоре-

рис. 2. Выбор длины волны был обусловлен влия-

нием 14000 g в течение 10 мин при комнатной

нием стабилизирующего вещества на оптическую

температуре.

плотность коллоидного раствора золотых нано-

Подготовку образца золотых наночастиц для

частиц. Для наночастиц, полученных методом

спектрофотометрического анализа осуществляли

Туркевича, зависимость оптической плотности

следующим образом. Не менее 5 мкл анализируе-

при длине волны 400 нм от стабилизирующего ве-

мого коллоидного раствора золотых наночастиц

щества слабее, чем при больших длинах волн [17,

разбавляли дистиллированной водой. При этом

18]. Также данное утверждение было проверено

кратность разведения подбирали таким образом,

для лазерно-аблированных золотых наночастиц.

чтобы оптическая плотность раствора составляла

На рис. 3 представлены спектры поглощения в

от 0.2 до 1.4. Далее образец помещали в кварцевую

ультрафиолетовой и видимой областях коллоид-

кювету и проводили регистрацию спектра погло-

ных растворов лазерно-аблированных золотых

щения в оптической и ультрафиолетовой обла-

наночастиц со стабилизирующим веществом и

стях (от 250 до 800 нм). Использовали спектрофо-

без такового. При добавлении стабилизирующего

БИОФИЗИКА том 67

№ 1

2022

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОЦЕНКИ

Рис. 2. График зависимости концентрации золотых наночастиц в растворе от оптической плотности. Уравнение прямой

носит линейный характер: y = 117.8x - 1.6 (R > 0.99).

вещества (бычьего сывороточного альбумина),

спектрофотометрии. На рис.

4 представлено

прозрачного в данной области спектра, заметно

электронно-микроскопическое изображение ис-

увеличение оптической плотности коллоидного

ходного раствора золотых наночастиц.

раствора. Разница оптических плотностей при

В результате анализа изображений был опре-

длине волны пика плазмонного резонанса (ППР)

делен средний диаметр золотых наночастиц для

составляет 0.06, тогда как при длине волны 400 нм

трех размерных фракций: исходная фракция -

- 0.008. Таким образом, можно сделать вывод о

11.3

± 5.2 нм, первая размерная фракция -

меньшем воздействии стабилизирующего веще-

8.9 ± 1.7 нм, вторая размерная фракция - 22.3 ±

ства на оптическую плотность коллоидного рас-

твора при длине волны 400 нм.

± 6.8 нм.

Для определения размера золотых наночастиц

Определение среднего размера золотых наноча-

с помощью оптических спектров поглощения бы-

стиц в коллоидном растворе. Исходный коллоид-

ный раствор золотых наночастиц был разделен на

ли сопоставлены результаты, полученные мето-

две размерные фракции путем центрифугирова-

дом электронной микроскопии, и отношения оп-

ния. Исходная и полученные размерные фракции

тических плотностей при длине волны ППР и

золотых наночастиц были проанализированы ме-

400 нм (А_ППР/А_{400 нм}). На рис. 5 представлена

тодами электронной микроскопии и оптической

данная зависимость. В данном диапазоне зависи-

Рис. 3. Спектры поглощения в видимой и ультрафиолетовой областях коллоидного раствора лазерно-аблированных

золотых наночастиц со стабилизирующим веществом и без него. Разница оптических плотностей при длине волны ППР

составляет 0.06, а при длине волны 400 нм - 0.008.

БИОФИЗИКА том 67

№ 1

2022

СКРИБИЦКИЙ и др.

Рис. 4. Изображение лазерно-аблированных золотых наночастиц, полученное методом ïðîñâå÷èâàþùåé электронной

микроскопии.

мость можно аппроксимировать линейной функ-

лотых наночастиц, полученных методом Турке-

цией y = 23.4x - 18.2 (R > 0.98).

вича в работе [19]. Таким образом, коллоидный

раствор лазерно-аблированных наночастиц де-

По спектрам поглощения был рассчитан сред-

монстрирует сходные оптические свойства с зо-

ний диаметр золотых наночастиц в исследуемых

лотыми наночастицами, полученными методом

образцах согласно работе [19], в которой приме-

Туркевича.

няется теория светорассеяния Ми на золотых на-

ночастицах, полученных методом Туркевича.

Результат сравнения расчетов по спектрам по-

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

глощения с электронной микроскопией исследу-

емых образцов представлен на рис. 6. Получен-

Концентрация и размер золотых наночастиц

ные результаты хорошо согласуются в пределах

являются одними из основных параметров кол-

погрешности при размерах наночастиц больше

лоидного раствора. Спектрофотометрический

11 нм. При размерах золотых наночастиц меньше

метод позволяет проводить быструю оценку раз-

11 нм наблюдается расхождение размеров, опре-

мера и концентрации лазерно-аблированных зо-

деленных разными методами. Такое же расхожде-

лотых наночастиц в коллоидном растворе. Неза-

ние в области меньше 10 нм представлено для зо- висимо от метода получения наночастицы обла-

Рис. 5. Зависимость среднего диаметра золотых наночастиц от отношения оптических плотностей при длинах волн ППР и

400 нм.

БИОФИЗИКА том 67

№ 1

2022

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОЦЕНКИ

Рис. 6. Сравнение среднего размера золотых наночастиц: кружки - значения получены методом электронной микроско-

пии, квадраты - расчетные значения по спектрам поглощения коллоидных растворов.

дают схожими оптическими свойствами, что

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

позволяет использовать ранее разработанные ме-

Настоящая работа не содержит описания ис-

тоды обработки экспериментальных данных на

следований с использованием людей и животных

лазерно-аблированных золотых наночастицах.

в качестве объектов.

Показано, что добавление бычьего сывороточ-

ного альбумина в качестве стабилизатора в кол-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

лоидный раствор лазерно-аблированных золотых

K. Haume, S. Rosa, S. Grellet, et al., Cancer Nano-

наночастиц приводит к изменению его спектра

technol. 7 (1), 1 (2016).

поглощения в области пика плазмонного резо-

D. M. Connor and A. M. Broome, Adv. Cancer Res.

нанса в сравнении с нестабилизированными на-

139, 163 (2018).

ночастицами с той же концентрацией золота. В

V. N. Kulakov, A. A. Lipengol’ts, and N. L. Shi-

области 400 нм спектра поглощения наблюдается

manovskii, Rus. J. Gen. Chem. 83 (12), 2559 (2013).

на порядок меньшее изменение оптической плот-

Yu. V. Stukalov, E. Yu. Grigorieva, A. V. Smirnova,

ности при сравнении спектров стабилизирован-

et al., Bull. Rus. State Medical University 6,

113

(2018).

ных и нестабилизированных наночастиц, в связи

C. Schürmann, F. Gremse, H. Jo, et al., PLoS One 10

с этим данная длина волны является оптималь-

(6), e0130374 (2015).

ной для определения концентрации золота в кол-

Y. Wang, Z. Xiong, Y. He, et al., Mater. Sci. Engineer.

лоидном растворе наночастиц.

C 83, 9 (2018).

Проведено сравнение средних диаметров зо-

A. A. Lipengol’ts, A. A. Cherepanov, V. N. Kulakov,

лотых наночастиц, определенных методом про-

et al., Pharmaceut. Chem. J. 51 (9), 783 (2017).

свечивающей электронной микроскопии и мето-

J. Kimling, M. Maier, B. Okenve, et al., J. Phys.

дом расчета по спектрам поглощения в ультрафи-

Chem. B 110 (32), 15700 (2006).

олетовой и видимой областях. Установлено

A. A. Popov, G. Tselikov, A. Al-Kattan, et al., Synthe-

различие диаметров в пределах погрешности в

sis and Photonics of Nanoscale Materials XVI 10907,

области менее 11 нм, что также отмечено в лите-

1090708 (2019).

ратуре для наночастиц, полученных методом

10.

S. Jendrzej, B. Gökce, M. Epple, et al., ChemPhys-

Туркевича. При размере наночастиц более 11 нм

Chem. 18 (9), 1012 (2017).

наблюдается согласование результатов в пределах

11.

В. Н. Музгин, Н. Н. Емельянова и А. А. Пупышев,

Аналитика и контроль, № 3-4, 3 (1998).

погрешности, что позволяет использовать рас-

четные методы по спектрам поглощения на ла-

12.

J. Zhang, L. Mou, and X. Jiang, Chem. Sci. 11 (4), 923

(2020).

зерно-аблированных золотых наночастицах в

данном интервале.

13.

J. Kim, M. Yeom, T. Lee, et al., J. Nanobiotechnol. 18

(1), 1 (2020).

14.

K. X. Lee, K. Shameli, Y. P. Yew, et al., Int. J.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Nanomed. 15, 275 (2020).

15.

J. H. Lambert, Photometria sive de mensura et gradibus

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

luminis, colorum et umbrae (sumptibus vidvae E. Klett,

интересов.

typis CP Detleffsen, 1760).

БИОФИЗИКА том 67

№ 1

2022

СКРИБИЦКИЙ и др.

16. G. Mie, Annalen der Physic 330 (3), 377 (1908).

20. M. Zimbone, L. Calcagno, G. Messina, et al., Materi-

als Lett. 65 (19-20), 2906 (2011).

17. T. Hendel, M. Wuithschick, F. Kettemann, et al.,

21. V. Amendola, M. Meneghetti, J. Phys. Chem. C 113

Anal. Chem. 86 (22), 11115 (2014).

(11), 4277 (2009).

18. A. G. Shard, L. Wright, and C. Minelli, Biointer-

22. J. P. Sylvestre, S. Poulin, A.V. Kabashin, et al., J. Phys.

phases 13 (6), 061002 (2018).

Chem. B 108 (43), 16864 (2004).

19. W. Haiss, N.T. Thanh, J. Aveyard, et al., Analytical

23. R. La Spina, V. Spampinato, D. Gilliland, et al., Bio-

chemistry 79 (11), 4215 (2007).

interphases 12 (3), 031003 (2017).

A Spectrophotometric Method for Evaluation of Size and Concentration

of Laser Ablated Gold Nanoparticles

V.A. Skribitsky*^, **, N.V. Pozdniakova*^, **, A.A. Lipengolts*^, **^, ***, A.A. Popov**,

G.V. Tikhonowski**, Yu.A. Finogenova*^, **, A.V. Smirnova*^, **^, ****, and E.Yu. Grigorieva*^, **

*N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of the Russian Federation,

Kashirskoye Shosse 24, Moscow, 115478 Russia

**National Research Nuclear University “Moscow Engineering Physics Institute”,

Kashirskoe shosse 31, Moscow, 115409 Russia

***A.I. Burnasyan Federal Medical Biophysical Center, Zhivopisnaya ul. 46, Moscow, 123098 Russia

**** A.S. Loginov Moscow Clinical Scientific Center, Moscow Healthcare Department,

shosse Entuziastov 86, Moscow, 111123 Russia

In this work, we consider if a spectrophotometry approach can be used for evaluation of size and concentra-

tion of gold nanoparticles produced by laser ablation. Gold nanoparticles synthesized by different methods

have different physical and chemical properties of their surface. This can have an effect on their optical prop-

erties in colloidal water solution. The results obtained from experiments confirmed that a spectrophotometry

approach can be useful for evaluation of size and concentration of gold nanoparticles prepared by laser abla-

tion. It has been shown that 400 nm is an optimal wavelength to use for estimation of the concentration of

nanoparticles by spectrophotometry. Determination of gold nanoparticles size from UV-Vis spectra is possi-

ble only for nanoparticles not less than 11 nm in diameter.

Keywords: gold nanoparticles, radiosensitizers, spectrophotometry, colloidal solution

БИОФИЗИКА том 67

№ 1

2022