БИОФИЗИКА, 2022, том 67, № 2, с. 240-243

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 519.876.5

СБОРКА ГЕНОМОВ ТРЕХ СЛАБОВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ

Fusarium oxysporum f. sp. lini

Т.А. Рожмина**, М.Г. Самсонова*

*Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого,

195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29

**Институт льна - обособленное подразделение Федерального научного центра лубяных культур,

172002, Торжок Тверской области, ул. Луначарского, 35

E-mail: m.samsonova@spbstu.ru

Поступила в редакцию 07.12.2021 г.

После доработки 07.12.2021 г.

Принята к публикации 12.12.2021 г.

Фузариозное увядание - наиболее разрушительное грибковое заболевание, ограничивающее

возделывание льна во всех основных странах, выращивающих лен. Его возбудитель - гриб Fusarium

oxysporum f. sp. lini. В работе сообщается о сборках генома трех слабопатогенных штаммов Fusarium

oxysporum f. sp. lini, а именно F200, F418 и F365. Геном штамма F418, секвенированного гибридным

методом по технологиям PacBio и Illumina, собран в хромосомы на основании данных

референсного генома MI39. Эти результаты закладывают прочную основу для сравнительных

геномных исследований грибковых патогенов растений, эволюции факторов патогенности и

вирулентности, лежащих в основе динамики взаимодействий между хозяином и патогеном, что в

конечном итоге предлагает решения для борьбы с этим заболеванием.

Ключевые слова: лен, геномика, секвенирование, фузариозное увядание.

DOI: 10.31857/S0006302922020053

Fusarium oxysporum - это генетически раз-

него развиваются микроконидии, блокирующие

нообразный видовой комплекс, состоящий

поток воды и питательных веществ, что приводит

из различных специальных форм (formae spe-

к увяданию растений, пожелтению нижних ча-

стей и гибели [9-12]. Грибок продуцирует мико-

ciales, f. sp.), которые демонстрируют узкую

токсины и ферменты, гидролизующие компонен-

адаптацию к хозяину и используют широкий

ты клеточной стенки (целлюлазы, пектиназы,

спектр экологических ниш [1]. Fusarium oxys-

глюкуронидазы и др.), которые облегчают про-

porum f. sp. включают в себя как непатоген-

никновение в ткани хозяина.

ные, так и патогенные штаммы, способные

Большинство сортов льна обладают высокой

вызывать серьезные заболевания у растений,

или средней устойчивостью к фузариозному увя-

подвергая опасности производство экономи-

данию. Однако быстрое уменьшение генетиче-

чески важных сельскохозяйственных культур

ского разнообразия сортов льна и нескончаемая

[2].

«гонка вооружений» между растением и патоге-

В последние годы были секвенированы мно-

ном способствуют значительному увеличению

гие геномы Fusarium oxysporum [3-8]. Безусловно,

риска развития болезней. Кроме того, изменение

наиболее точно секвенированный геном F. oxys-

климата может привести к повышенной агрес-

porum - это изолят Fusarium oxysporum lycopersici

сивности отдельных рас патогенов и потере

4287, собранный из фрагментов секвенирования

устойчивости сортов льна.

по методу дробовика с последующей привязкой

Учитывая экономическую важность выращи-

сборок к оптической карте [5].

вания льна, вышесказанное требует быстрых дей-

Fusarium oxysporum f. sp. lini, один из наиболее

ствий, включая всестороннюю характеристику

опасных грибковых возбудителей льна, является

популяции патогенов на геномном уровне, что

возбудителем фузариозного увядания. Он прони-

ускоряет создание сортов льна-волокна и мас-

кает в растение через корни и распространяется

личного с эффективной устойчивостью к патоге-

внутри сосудистого пучка. После прорастания у

нам. Ранее мы осуществили секвенировние и

240

СБОРКА ГЕНОМОВ ТРЕХ СЛАБОВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ

241

сборку геномов пяти различных высокопатоген-

мов F329, F324, F282 и F287. Поэтому эти геномы

ных штаммов Fusarium oxysporum f. sp. lini: MI39,

были пересобраны с использованием программы

F329, F324, F282, F287. Геном MI39 был секвени-

RagTag. Оценку качества сборки генома осу-

рован как по технологии Illumina, так и по техно-

ществляли с использованием программы QUAST

логии PacBio, что позволило выполнить его сбор-

(версия 5.0.2) [19]. Сравнительный анализ геном-

ку на уровне хромосом [13]. Здесь мы секвениро-

ных последовательностей различных штаммов с

вали и выполнили сборку геномов еще трех

референсной последовательностью MI39 прово-

слабовирулентных штаммов Fusarium oxysporum

дился с использованием программы GSAlign

f. sp. lini, F200, F418 и F365.

(версия 1.0.19) [20]. С использованием програм-

мы RepeatMasker была проведена аннотация

участков геномов, содержащих повторы. Функ-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

циональную аннотацию кодирующих генов, а

Для выделения ДНК культуры штаммов F200,

также их предсказание осуществляли с помощью

F418 и F365 были получены на жидкой среде Ча-

пакета программ BUSCO (версия 4.0.4) [21].

пека. ДНК из мицелия выделяли с помощью ком-

«Hypocreales_odb10» был использован в качестве

мерческого набора NucleoSpin Plant II (Macherey-

параметра

«-l», описывающего таксономиче-

Nagel, Германия), контроль качества ДНК прово-

скую принадлежность организма.

дили при помощи агарозного гель-электрофореза

Sekwenirowanie с использованием флуориметра

Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, США) и набора

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Qubit dsDNA high-sensitivity (Thermo Fisher Scien-

Геном штамма F418, секвенированного ги-

tific, США) по методике производителя. Отсут-

бридным методом по технологиям PacBio и Illu-

ствие загрязнения выделенной геномной ДНК

mina, собран в хромосомы на основании данных

оценивали с использованием спектрофотометра

референсного генома MI39 [13]. Сборка осталь-

NanoPhotometer Pearl UV/Vis (IMPLEN, Герма-

ных геномов штаммов F365 и F200, секвениро-

ния) по соотношению длин волн 260/280 нм.

ванных по методу Illumina, также проведена от-

Cеквенирование геномов штамма F200, F365,

носительно референсного генома MI39. Также

F418 было выполнено в BGI с помощью платфор-

проведена пересборка геномов ранее секвениро-

мы Illumina HiSeq400. По данным секвенирова-

ванных штаммов F282, F287, F324, F329.

ния покрытие по образцам составило 30×, а длина

парных прочтений - 150 п.н. Также с использова-

Гибридная сборка генома F418 с учетом рефе-

нием платформы PacBio RS II System было прове-

ренсного генома MI39 оказалась высоко эффек-

дено секвенирование штамма F418 со средним

тивной, включив в свой состав более 90% контин-

покрытием 100×. Гибридная сборка генома F418

гов. Сборки других геномов, основанные на дан-

была проведена в три этапа:

ных секвенирования только по технологии

Illumina, демонстрируют относительно низкую

1) при помощи программы Canu (версия 1.4),

долю повторяющихся последовательностей по

была проведена первичная сборка контигов фраг-

сравнению с эталонным геномом MI39. Посколь-

ментов секвенирования PacBio [14];

ку ассемблеры обычно генерируют контиги низ-

2) с использованием программы Pilon (версия

кого качества из прочтений, соответствуюших

1.23), осуществляли корректировку собранных

повторяющимся участкам генома, недопредстав-

контигов с учетом коротких фрагментов секвени-

ленность повторяющихся областей генома в

рования Illumina. Доля позиций с низким каче-

сборках не удивительна.

ством сборки составила 5.4⋅10^-5 (после коррек-

Oбщие данные, характеризующие собран-

ции) [15];

ные геномы и качество сборки приведены в

3) на базе программы RagTag (версия 2.1) [16],

таблице. Данные o геномах пяти сильно виру-

a также на основании данных референсного гено-

лентных штаммов MI39, F282, F287, F324, F329

ма MI39 была проведена сборка корректирован-

внесены в банк данных NCBI GenBank, их

ных контигов в хромосомы.

идентификаторы

- JABJUA000000000,

Сборку геномов штаммов F365 и F200 прово-

JABJUB000000000,

JABJUC000000000,

дили в два шага. В рамках первого этапа с помо-

JABJUD000000000, JABJUE000000000 соответ-

щью программы abyss-pe из пакета ABYSS (вер-

ственно.

сия 2.1.5) были собраны в контиги фрагменты се-

квенирования Illumina [17]. Дальнейшая сборка

была проведена на основе референсного генома

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

MI39 с помощью программы RagTag (версия 2.1)

[16]. Программа RagTag значительно лучше ана-

Работа выполнена при финансовой поддержке

логичной программы RaGOO

[18],

ис-

Российского научного фонда (грант № 19-16-

пользованной ранее при сборке геномов штам-

00030).

БИОФИЗИКА том 67

№ 2

2022

242

КАНАПИН и др.

Статистика сборки геномов штаммов Fusarium oxysporum f. sp. lini

Тип статистики

Штамм

MI39

F418

F200

F282

F287

F324

F329

F365

Технология

PacBio,

Illumina

секвенирования

Illumina

Покрытие

100 + 200

Число

2549

3879

3605

3233

3216

3024

скаффолдов

Размер генома

69,459,321

54,615,159

72,471,920

73,301,706

73,796,401

77,268,611

74,544,230

60,916,722

(п.о.)

Содержание GC

48.08

48.51

48.54

48.49

48.25

48.52

48.26

48.14

(%)

N50 (п.о.)

5,280,230

5,107,914

5,379,025

4,622,580

5,437,438

4,568,139

4,601,953

5,207,443

L50

Максимальная

длина контига

9,704,848

9,201,571

8,332,100

7,985,000

8,419,045

7,978,509

8,159,604

7,929,600

(п.о.)

Число контигов

с длиной > 50 kB

Аннотация

97.9

98.0

97.9

BUSCO (%)

Число

предсказанных

6682

6701

6474

6434

6437

6474

6431

6307

уникальных

белков

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

6. S. M. Schmidt, J. Lukasiewicz, R. Farrer, et al., New

Phytologist 209, 307 (2016).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

интересов.

7. S. Seo, A. Pokhrel, and J. J. Coleman, Mol. Plant Mi-

crobe Interact. 33, 138 (2020).

8. A. H. Williams, M. Sharma, L. F. Thatcher, et al.,

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

BMC Genomics 17, 191 (2016).

Настоящая работа не содержит описания ис-

следований с использованием людей и животных

9. C. B. Michielse and M. Rep, Mol. Plant Pathol. 10,

в качестве объектов.

311 (2009).

10. C. Olivain, S. Trouvelot, M. N. Binet, et al., Appl. En-

viron. Microbiol. 69, 5453 (2003).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

11. Т. А. Рожмина и Н. И. Лошакова, С.-х. биология

1. Y. Zhang and L. J. Ma, Adv. Genet. 100, 179 (2017).

51 (3), 310 (2016).

2. D. D. Johnson, G. K. Flaskerud, R. D. Taylor, and

V. Satyanarayana, in Agricultural economics report 396

12. Т. А. Рожмина, Биология в сельском хозяйстве 4

(Department of Agricultural Economics, North Da-

(17), 10 (2017).

kota State University, 1998).

13. A. Kanapin, A. Samsonova, T. Rozhmina, et al., Mol.

3. A. D. Armitage, A. Taylor, M. K. Sobczyk, et al., Sci.

Plant-Microbe Inter.

(9),

1112

(2020). DOI:

Rep. 8, 13530 (2018).

10.1094/MPMI-05-20-0130-SC

4. F. Garcia-Bastidas, N. Ordonez, J. Konkol, et al.,

14. S. Koren, B. P. Walenz, K. Berlin, et al., Genome Res.

Plant Dis. 98, 694 (2013).

27, 722 (2017).

5. L.-J. Ma, H. C. van der Does, K. A. Borkovich, et al.,

15. B. J. Walker, T. Abeel, T. Shea, et al., PLoS One 9,

Nature 464, 367 (2010).

e112963 (2014).

БИОФИЗИКА том 67

№ 2

2022

СБОРКА ГЕНОМОВ ТРЕХ СЛАБОВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ

243

16. M. Alonge, L. Lebeigle, M. Kirsche1, et al., bioRxiv

19. A. Gurevich, V. Saveliev, N. Vyahhi, and G. Tesler,

2021, 469135 (2021). DOI: 10.1101/2021.11.18.469135

Bioinformatics 29, 1072 (2013).

17. J. T. Simpson, K. Wong, S. D. Jackman, et al., Ge-

20. H. N. Lin and W. L. Hsu, BMC Genomics 21, 182

nome Res. 19, 1117 (2009).

(2020). DOI: 10.1186/s12864-020-6569-1

18. M. Alonge, S. Soyk, S. Ramakrishnan, et al., Genome

21. M. Seppey, M. Manni, and E. M. Zdobnov, Methods

Biol. 20, 224 (2019).

Mol. Biol. 1962, 227 (2019).

Assembly of Three Weakly Virulent Fusarium oxysporum f. sp. lini Strains

А.A. Кanapin*, А.А. Samsonova*, М.P. Bankin*, А.A. Logachev*,

Т.А. Rozhmina**, and М.G. Samsonova*

*Peter the Great St. Petersburg Polytechnic University, ul. Polytekhnicheskaya 29, St. Petersburg, 195251 Russia

**Flax Institute - a separate subdivision of the Federal Scientific Center for Bast Crops,

ul. Lunacharskogo 35, Thorzhok, Tver Region 172002 Russia

Fusarium wilt is the most destructive fungal disease, limiting flax cultivation in all main flax and linseed

growing countries. The causative agent is seedbourne and soilborne fungus F. oxysporum f. sp. lini. Here, we

report for the first time genome assemblies of five highly pathogenic isolates of Fusarium oxysporum f. sp. lini,

namely F200, F418 и F365. Genome of F418 strain sequenced with both Illumina and PacBio RS II technol-

ogies was assembled into chromosomes using the MI39 genome assembly as a reference. These results lay a

solid foundation for comparative genomics studies of plant fungal pathogens, evolution of pathogenicity and

virulence factors underlying the dynamics of host-pathogen interactions, thus eventually offering solutions to

Fusarium disease control.

Ключевые слова: flax, genomics, sequencing, Fusarium wilt

БИОФИЗИКА том 67

№ 2

2022