БИОФИЗИКА, 2022, том 67, № 3, с. 549-554

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 577

ВКЛЮЧЕНИЕ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА, СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ

ЦЕТИЛТРИМЕТИЛАММОНИЯ БРОМИДОМ, В СОСТАВ ЛИПОСОМ

НА ОСНОВЕ СОЕВОГО ЛЕЦИТИНА

Воронежский государственный университет, 394018, Воронеж, Университетская пл., 1

E-mail: zinkovae@list.ru

Поступила в редакцию 30.11.2019 г.

После доработки 28.02.2022 г.

Принята к публикации 17.03.2022 г.

Обладая высокой биосовместимостью с клетками организма в силу состава из мембранобразующих

липидов, липосомы могут быть использованы в качестве эффективного средства адресной доставки

лекарственных препаратов при лечении заболеваний различной этиологии. Взаимодействие липо-

сом с клетками-мишенями может принимать разные формы: адсорбция (прикрепление) на клеточ-

ной поверхности, эндоцитоз, слияние липосом с мембранами клеток. Внедрение в липосомы ком-

понентов для активного управления внешним магнитным полем в виде магнитовосприимчивых на-

ночастиц позволяет многократно повысить эффективность и скорость доставки лекарственных

препаратов. Нами были получены липосомальные наночастицы, содержащие наночастицы магне-

тита. Для создания магнитоуправляемых липосом были использованы полученные в нашей лабора-

тории наночастицы магнетита диаметром 4.2 ± 1.2 нм. Поверхность синтезированных частиц маг-

нетита покрывали молекулами цетилтриметиламмония бромида, после чего включали магнетит в

состав липосом из фосфатидилхолина. Количественную оценку интегрированных в липидный бис-

лой липосом магнитовосприимчивых наночастиц проводили спектральными методами и методом

просвечивающей электронной микроскопии. В ходе проведенных исследований показано, что мо-

дификация наноструктурированного магнетита цетилтриметиламмония бромидом повышает эф-

фективность внедрения наночастиц магнетита в липидный бислой на 31.6%.

Ключевые слова: наночастицы, магнитолипосомы, магнетит, ЦТАБ.

DOI: 10.31857/S0006302922030139, EDN: AONQWD

Наночастицы на сегодняшний день применя-

систем для адресной доставки лекарственных

средств необходимо для решения вышеуказан-

ют в различных областях медицины [1-3]. Липо-

ных и других вопросов при их получении.

сомы, содержащие в своем составе магнитовос-

приимчивые наночастицы (магнитолипосомы),

В частности, остается открытым вопрос о спо-

позволяют комбинировать диагностику и лече-

собах включения магнитных наночастиц в струк-

ние, выступая в качестве контрастирующих ве-

туру липосом, их интеграция в состав липосом

ществ для магнитно-резонансной томографии

может происходить различными путями, наибо-

наравне с терапевтическим действием. Более то-

лее предпочтительным из которых является их

го, использование липосом решает проблему рас-

включение в структуру липидного бислоя, это

творимости и коллоидной устойчивости магнит-

позволяет сохранить объем внутренней полости

ных наночастиц, которые в свободном состоянии

липосом для переноса большего количества ле-

коагулируют и формируют агломераты в крове-

карственного вещества, исключая взаимодей-

носном русле, вызывая эмболию сосудов и ише-

ствие магнетита с использованным препаратом

мические повреждения клеток [4]. Однако при

[5, 6]. Известен ряд работ, посвященных вопро-

получении магнитолипосом и по сей день суще-

сам включения магнитных наночастиц в бислой

ствует ряд проблем, главными из которых явля-

липосом, с этой целью производят гидрофобиза-

ются сложность получения наночастиц стандар-

цию поверхности наночастиц при помощи раз-

тизированного размера, достаточная степень

личных веществ [7-13]. По совокупности пара-

включения лекарственного препарата. Знание

метров (намагничиваемость, токсичность) магне-

механизмов взаимодействия компонентов нано-

тит является оптимальным вариантом. В связи с

вышесказанным большой интерес представляет

Сокращение: ЦТАБ - цетилтриметиламмония бромид.

собой изучение распределения компонентов

549

550

ШИЛОВА и др.

внутри системы для доставки лекарственных

Состав полученных наночастиц контролиро-

средств и стандартизация размеров получаемых

вали методом рентгеновской дифракции на ана-

наночастиц.

лизаторе ARL XʼTRA (ThermoScientific, США).

Целью настоящей работы явилось изучение

Размер полученных липосом измеряли с помо-

влияния модификации наночастиц магнетита це-

щью метода динамического светорассеяния Zeta-

тилтриметиламмония бромидом на их включение

sizer Nano ZSP (Malvern, Великобритания).

в состав липосом на основе соевого лецитина.

Определение встраивания наночастиц Fe₃O₄-

ЦТАБ в липидную мембрану липосом. Оценку

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

встраивания магнетита в липосомы производили

Синтез наночастиц магнетита, стабилизирован-

спектрофотометрическим методом. Синтезиро-

ных цетилтриметиламмония бромидом. Наноча-

ванные липосомы осаждали с помощью центри-

стицы магнетита получали модифицированным

фугирования при 50000 об/мин в течение 20 мин

методом Массарта путем соосаждения солей же-

на микроультрацентрифуге Sorvall MTX

150

леза II и железа III в щелочной среде [14]. В каче-

(ThermoScientific, США) с использованием рото-

стве осаждающего реагента использовали 1%-й

ра S120-AT2, после чего отбирали супернатант и

раствор аммиака, от которого наночастицы маг-

регистрировали оптическую плотность (магне-

нетита отмывали три раза дистиллированной во-

тит, не вошедший в липосомы, D₁). Осажденные

дой. Поверхность полученных наночастиц магне-

липосомы ресуспензировали в объеме натрий-

тита была модифицирована цетилтриметиламмо-

фосфатного буфера, равном изначальному, и раз-

ния бромидом (ЦТАБ) в концентрации 0.06 М,

рушали путем инкубации в 1%-м растворе Triton

после чего наночастицы трижды отмывали ди-

X-100 в течение 1 ч. При использовании этого де-

стиллированной водой и высушивали в лиофиль-

тергента происходит солюбилизация фосфоли-

ной сушилке производства Labconco (США) [15].

пидов с образованием смешанных мицелл либо

Синтез липосом из фосфатидилхолина и наноча-

червеобразных везикул [18]. Магнетит, находив-

стиц Fe₃O₄-ЦТАБ. Контрольные наночастицы и

шийся изначально внутри липосом, при этом вы-

комплекс Fe₃O₄-ЦТАБ были добавлены в соста-

ходил в раствор. Затем опять производили оса-

ве натрий-фосфатного буфера к липосомам.

ждение образовавшихся структур при аналогич-

Липосомы готовили методом гидратации/ре-

ных условиях и отбирали супернатант (магнетит,

гидратации, выпаривая 5 мл 1%-го раствора сое-

находящийся во внутренней полости липосом,

вого лецитина в этиловом спирте на ротационном

D₂). Оптическую плотность регистрировали с по-

испарителе RV10 (IKA, Германия) при температу-

мощью спектрофотометра UV 2401-PC (Shimad-

ре водяной бани 60°С. В результате на стенке ис-

zu, Япония) в кварцевой кювете с длиной оптиче-

парительной колбы получали пленку липидов.

ского пути 1 см при длине волны 412 нм.

Затем добавляли сантимолярный натрий-фос-

фатный буфер (рН 7.4) с наночастицами магнети-

Процент встраивания наночастиц магнетита в

та (1 мг/мл) в объеме, равном объему раствора ле-

мембрану липосом оценивали по формуле:

цитина в этиловом спирте, перемешивали в тече-

ние 1 мин.

Нв = (1 - D⁴¹²¹/D^412исх - D⁴¹²²/D^412исх)×100%,

Следующим этапом стала стандартизация по-

лучаемых липосом, для чего растворы были под-

где Нв - количество включенного в мембрану ли-

вержены воздействию ультразвуком с помощью

посом магнетита в процентах, D⁴¹²¹- оптическая

дезинтегратора Q500 (Qsonica Sonicators, США) в

плотность раствора после центрифугирования

течение 15 мин (20 кГц, импульс длительностью

липосом, D⁴¹²² - оптическая плотность раствора

10 с и перерывом 3 с) [16].

после разрушения и центрифугирования липо-

Методы контроля размера частиц. Изображе-

ния Fe₃O₄ получали с помощью просвечивающе-

сом, D^412исх - оптическая плотность исходного

го электронного микроскопа Libra 120 (Carl Zeiss,

раствора магнетита в буфере.

Германия) с использованием методики получе-

Приготовление образцов липосом для просвечи-

ния светопольных изображений [17]. Приготов-

вающей электронной микроскопии. Препараты ли-

ление препаратов для исследования образцов по-

посом для исследования методом просвечиваю-

рошков магнетита осуществляли следующим об-

щей электронной микроскопии были подготов-

разом: предметные сетки с тонкой пленкой

лены согласно работе

[18]. В качестве

аморфного углерода погружали в водно-желати-

новую суспензию порошка, измельченного в ага-

контрастирующего вещества использовали 2%-й

раствор OsO_4.Изображения получали с помощью

товой ступке. Лишнюю жидкость удаляли с помо-

щью фильтровальной бумаги.

микроскопа JEM-100C (JEOL, Япония).

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022

ВКЛЮЧЕНИЕ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА

551

Полученные наночастицы магнетита встраи-

вали в липосомы из соевого лецитина, которые

синтезировали методом гидратации/регидрата-

ции. Размер липосом контролировали методом

динамического светорассеяния. Исследование

показало, что полученные липосомальные нано-

частицы имеют размеры 173.8 ± 12.5 нм (рис. 3).

Данный размер позволяет рассматривать полу-

ченные нами липосомы в качестве возможного

средства адресной доставки лекарственных пре-

паратов.

На следующем этапе работы оценивали встра-

ивание в липосомы нестабилизированных частиц

магнетита и частиц магнетита, покрытых молеку-

лами ЦТАБ.

Исследования с помощью спектрофотометри-

Рис. 1. Изображение наночастиц магнетита, получен-

ное с помощью метода просвечивающей электрон-

ческого метода показали, что в случае магнетита

ной микроскопии.

без оболочки наблюдается включение 49.2 ± 0.5%

магнетита, при использовании покрытия в виде

ЦТАБ в липидный бислой включается 80.8 ± 0.5%

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

магнетита (таблица).

На рис. 4 представлены характерные элек-

На первом этапе работы методом просвечива-

тронномикроскопические изображения липосом

ющей электронной микроскопии был определен

с адсорбированными наночастицами магнетита.

размер синтезированных нами магнитных нано-

На микрофотографиях липосом с наночастицами

частиц. Было проанализировано 100 наночастиц

Fe₃O₄-ЦТАБ (рис. 4в) заметно увеличение числа

магнетита, размер которых рассчитывали с помо-

наночастиц магнетита, встроенных в липидный

щью программы Adobe Photoshop®.

бислой, по сравнению с частицами, немодифи-

Было установлено, что размер синтезируемых

цированными ЦТАБ (рис. 4б).

наночастиц составил 4.2 ± 1.2 нм (рис. 1).

Увеличение доли встроенных в липидную

мембрану наночастиц Fe₃O₄ обусловлено взаи-

Для оценки качественного состава синтезиру-

емого магнетита были зарегистрированы рентге-

модействием гидрофобной углеводородной цепи

нограммы наночастиц. Обнаруженные на рентге-

молекулы ЦТАБ ([С₁₆Н₃₃N(CH₃)₃]Br) и гидро-

нограммах пики, соответствующие 2θ = 18, 30.20,

фобных остатков жирных кислот молекул фосфа-

35.53, 43.1 и 57.1, соответствуют показателям

тидилхолина.

стандартного образца магнетита (Fe₃O₄) (PDF-2

Следовательно, покрытие наночастиц магне-

карта № 01-088-0315) (рис. 2).

тита молекулами ЦТАБ способствует встраива-

Рис. 2. Рентгенограмма наночастиц магнетита: 1 - Fe₃O₄, 2 - Fe₃O₄ - ЦТАБ.

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022

552

ШИЛОВА и др.

Рис. 3. Распределение по размерам липосом из соевого лецитина с включенными наночастицами магнетита.

Определение распределения магнетита в структуре липосом спектрофотометрическим методом

Включение в липидный

Включение во внутреннюю

Невключившийся

бислой, %

полость, %

магнетит, %

Fe₃O₄

49.2 ± 0.5

32.1 ± 0.5

18.9 ± 0.1

Fe₃O₄-ЦТАБ

80.8 ± 0.5

13.9 ± 0.2

5.2 ± 0.3

нию наночастиц в структуру липидного бислоя

Таким образом, по данным динамического

липосом. В результате происходит увеличение

светорассеяния мы можем сделать вывод о том,

что покрытие ЦТАБ наночастиц магнетита не

свободного пространства во внутренней полости

влияет на склонность липосом к агрегации. Столь

липосом, что позволит доставлять к клеткам-ми-

быстрое увеличение размеров синтезированных

шеням большее количество гидрофильных лекар-

липосом связано с тем, что в данной работе экс-

ственных препаратов.

перименты проводились на модельных липосо-

мах, липидный бислой которых состоит только из

Так как одной из главных проблем при синтезе

фосфатидилхолина, который при физиологиче-

липосом является их высокая склонность к агре-

ских значениях рН имеет суммарный нейтраль-

гации, нами были проведены исследования по

ный заряд. Поэтому для применения в клиниче-

контролю изменений размера полученных нами

ской практике необходимо включать в состав ли-

липосом. Было показано, что увеличение разме-

посом отрицательно заряженные липиды.

ров липосом происходит уже через 2 ч в обоих об-

разцах (рис. 5).

Рис. 4. Изображения липосом, полученные с помощью метода просвечивающей электронной микроскопии: (а) -

липосомы без добавления магнетита; (б) - липосомы с включенными наночастицами магнетита; (в) - липосомы с

включенными наночастицами магнетита, покрытыми ЦТАБ.

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022

ВКЛЮЧЕНИЕ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА

553

Рис. 5. Изменение размеров полученных липосом в течение времени: темные столбики - липосомы с магнетитом без

покрытия; светлые столбики - липосомы с наночастицами магнетита, покрытыми ЦТАБ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Российской Федерации в рамках государственно-

го задания ВУЗам в сфере научной деятельности

В ходе проведенных нами исследований было

на 2020-2022 годы, проект №FZGU-2020-0044.

изучено влияние покрытия наночастиц магнети-

та цетилтриметиламмония бромидом на их встра-

ивание в липосомы из соевого лецитина.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Синтезированные магнитные наночастицы

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

магнетита обладают необходимыми размерными

интересов.

характеристиками для встраивания в липидный

бислой липосом.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Таким образом, интегрирование магнитных

наночастиц в структуру липидного бислоя при

Настоящая статья не содержит каких-либо ис-

получении магнитоуправляемых липосом позво-

следований с участием людей или животных в ка-

лит снизить риск взаимодействия вводимого в

честве объектов исследований.

них препарата с материалом самих наночастиц, а

рост свободного объема внутренней полости,

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

вследствие ее освобождения от включенного на-

номатериала, сделает возможным увеличить

1. М. А. Наквасина и В. Г. Артюхов, Основы бионано-

удельное содержание доставляемого к клеткам-

технологии (Издательский дом ВГУ, Воронеж,

мишеням лекарственного препарата с одновре-

2016).

менным снижением количества вводимых в орга-

2. C. Buzea, I. P. Blandino, and K. Robbie, Biointer-

низм липосом.

phases 2 (4), MR17 (2007).

3. В. Н. Никифоров, Изв. Академии инженерных

наук им. А. М. Прохорова, № 1, 23 (2013).

БЛАГОДАРНОСТИ

4. De Mrinmoy, P. S. Ghosh, and V. M. Rotello, Adv.

Mater. 20, 4225 (2008).

Результаты исследований были получены на

5. M. Auffan, J. Rose, and M. R. Wiesner, J. Bottero En-

оборудовании лаборатории электронной микро-

vir. Pollution 157, 1127 (2009).

скопии ЦКПНО ВГУ (контроль размера получае-

6. J. Kohlbrecher, E. Müller, Th. Schweizer, et al., Nano

мых наночастиц) и сектора электронной микро-

Lett. 11 (4), 1664 (2011).

скопии ЦКП ПНЦБИ РАН (исследования пре-

7. Y. Chen, Y. Chen, D Xiao, et al., Colloids and Surfac-

паратов липосом методом просвечивающей

es B: Biointerfaces 116, 452 (2014).

электронной микроскопии).

8. C. Berry and A. Curtis. J. Phys. D. Appl. Phys. 36,

R198 (2003).

9. A. H. Lu, E. L. Salabas, and F. Schuth, Angew. Chem.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Int. Ed. 46, 1222 (2007).

Работа выполнена при финансовой поддержке

10. P. B. Santhosh, B. Drašler, D. Drobne, et al., Int. J.

Министерства науки и высшего образования

Nanomed. 10, 6089 (2015).

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022

554

ШИЛОВА и др.

11. J. Santoyo-Salazar, M. A. Castellanos-Roman, and

16. Е. В. Шилова, В. Г. Артюхов, Е. Д. Скорбач и др.,

L. B. Gomez. Mater. Sci. Engineer. 27, 1317 (2007).

Нанотехнологии: разработка, применение

12. S. Laurent, D. Forge, M. Port, et al., Chem. Rev. 108,

XXI век, № 4, 9 (2018).

2064 (2008).

17. П. Хирш и др., Электронная микроскопия тонких

13. K. K. Kadyrzhanov, K. Egizbek, A. L. Kozlovskiy, and

кристаллов (Мир, М., 1968).

M. V. Zdorovets, Nanomaterials (Basel) 9 (8), 1079

18. K. Asami, J. Ultrastruct. Mol. Struct. Res. 95, 38

(2019).

(1986).

14. R. Massart, IEEE Trans. Magn. 17 (2), 1247 (1981).

15. О. Р. Егунова, Дисс. … канд. хим. наук (Саратов-

19. С. В. Герман, Дисс. … канд. ф.-м. наук (Саратов-

ский гос. ун-т им. Н.Г. Чернышевского, Саратов,

2017).

2015).

Inclusion of Magnetite Nanoparticles Stabilized with Cetyltrimethylammonium Bromide

in the Composition of Liposomes Prepared Using Soy Lecithin

E.V. Shilova, I.A. Koltakov, S.V. Kannykin, and V.G. Artyukhov

Voronezh State University, Universitetskaya pl. 1, Voronezh, 394018 Russia

Liposomes provide high biocompatibility with the cells of the human body due to the prevalence of mem-

brane lipids in their composition and can be used as an effective tool for targeted delivery of drugs against dis-

eases of different etiology. Interactions between liposomes and target cells can be different: adsorption on the

cell surface, endocytosis, fusion of liposomes with cell membranes. However, by incorporation of magnetic

nanoparticles into liposomes for active control of an external magnetic field, it is possible to enhance the ef-

ficiency and rate of drug release. To create magnetically controlled liposomes, we have chosen nanostruc-

tured magnetite obtained in our laboratory. In this work, we used nanoparticles of diameter 4.23 ± 1.19 nm.

Surfaces of synthesized magnetite nanoparticles were covered with molecules of cetyltrimethylammonium

bromide (CTAB), after that magnetite nanoparticles were included into the composition of liposomes formed

with phosphatidylcholine. Quantitative analysis of magneto-sensitive nanoparticles embedded in the lipid bi-

layer was carried out by spectrophotometry and using the transmission mode in an electron microscope. This

study showed that modification of nanostructured magnetite with CTAB increases the efficiency of magnetite

nanoparticles incorporation into the lipid bilayer by 31.6%.

Keywords: nanoparticles, magnetoliposomes, magnetite, CTAB

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022