БИОФИЗИКА, 2022, том 67, № 3, с. 569-575

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 577.323: 576.385: 612.014.464

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК

В ЛЕЙКОЦИТАХ КРОВИ МЫШИ И КЛЕТКАХ АДЕНОКАРЦИНОМЫ

МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА MDA-MB-231 В ЗАВИСИМОСТИ

ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ОЗОНА, ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА

И ГЕМЦИТАБИНА

М.Ю. Земскова****, Г.К. Рысцов****, Т.Г. Щербатюк**^, ***

*Институт биофизики клетки РАН - обособленное подразделение ФИЦ «Пущинский научный центр биологических

исследований РАН», 142290, Пущино Московской области, Институтская ул., 3

**Нижегородский научно-исследовательский институт гигиены и профпатологии Роспотребнадзора,

603005, Нижний Новгород, ул. Семашко, 20

***Пущинский государственный естественно-научный институт Минобрнауки России,

142290, Пущино Московской области, просп. Науки, 3

****Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН - обособленное подразделение ФИЦ

«Пущинский научный центр биологических исследований РАН»,

142290, Пущино Московской области, Институтская ул., 5

E-mail: a_b_g@mail.ru

Поступила в редакцию 24.03.2022 г.

После доработки 04.04.2022 г.

Принята к публикации 06.04.2022 г.

Проведено сравнительное исследование генотоксической активности медицинского озона и пе-

роксида водорода в отношении нормальных лейкоцитов периферической крови лабораторных мы-

шей линии Kv:SHK и клеток аденокарциномы молочной железы человека линии MDA-MB-231

in vitro. На основе данных, полученных методом ДНК-комет, определен интервал от минимальной

концентрации, вызывающей повреждение ДНК опухолевых клеток, до минимальной генотоксиче-

ской концентрации для нормальных клеток крови в пределах от 0.2 до 0.4 мг/л для озона в озоно-

кислородной смеси и от 0.1 до 3.0 мкМ для пероксида водорода. В установленных диапазонах озон

по сравнению с пероксидом водорода проявляет меньшую генотоксическую активность в отноше-

нии клеток аденокарциномы молочной железы. При комбинировании озона с концентрацией

0.4 мг/л в озоно-кислородной смеси с цитостатическим препаратом гемцитабином наблюдалось

потенцирование генотоксического эффекта цитостатика: повреждающие действие цитостатика на

ДНК клеток увеличилось более чем в два раза. Предполагается, что усиление генотоксического эф-

фекта гемцитабина в комбинации с озоном связано с интенсификацией инкорпорирования в

структуру ДНК его основных метаболитов в результате стимулирования процессов репарации ДНК.

Ключевые слова: озон, пероксид водорода, гемцитабин, генотоксический эффект, лейкоциты

периферической крови, клетки опухолевой линии MDA-MB-231.

DOI: 10.31857/S0006302922030164, EDN: AOVQOB

эффекта озона и перспективность его примене-

Несмотря на существенные достижения в об-

ласти онкологии, проблема лечения злокаче-

ния в составе комплексной противоопухолевой

ственных новообразований по-прежнему акту-

терапии [1]. Однако для перехода к клиническим

альна и требует разработок новых стратегий

испытаниям необходимо решить целый ряд во-

воздействия. Доклинические исследования, про-

просов, связанных с безопасным и эффективным

веденные научными коллективами различных

применением озонотерапии в онкологии. К этим

стран, установили наличие противоопухолевого

вопросам, в частности, относятся изучение дозо-

зависимого эффекта озона и определение диапа-

Сокращения: ОКС - озоно-кислородная смесь, dFdCTP -

зона терапевтического дозирования, исследова-

гемцитабина трифосфат, ПБС-ЭДТА - фосфатно-солевой

буферный раствор с этилендиаминтетраацетатом.

ние вариации чувствительности различных опу-

569

570

ГАПЕЕВ и др.

холевых клеток, а также взаимодействия озона с

потенцирования фармакологического действия,

различными противоопухолевыми агентами.

что увеличивает вероятность успешного включе-

ния dFdCTP в цепь ДНК: гемцитабина дифосфат

Ранее было показано, что озон оказывает пря-

ингибирует рибонуклеотидредуктазу, фермент,

мое цитотоксическое действие на опухолевые

ответственный за катализацию реакций, которые

клетки саркомы-45 при локальном применении

генерируют дезоксицитидинтрифосфат для син-

(концентрация озона в озоно-кислородной смеси

теза ДНК. Поскольку гемцитабина дифосфат

(ОКС) - 0.8-5.0 мг/л) [2], а при системном введе-

снижает уровень дезоксицитидинтрифосфата,

нии потенцирует действие гамма-излучения

уменьшается конкуренция для dFdCTP при

(лимфосаркома Плисса, концентрация озона в

включении в ДНК [8].

ОКС 0.4 мг/л) [3], усиливает действие доксоруби-

цина и 5-фторурацила (штаммы гепатома 27 и ге-

Однако одна из проблем терапевтического ис-

патома Зайделя, концентрация озона в ОКС -

пользования озона заключается в крайне малом

0.2 мг/л) [4], повышает эффективность фотоди-

времени его жизни в биологических тканях. При

намической терапии (штамм карциномы почки

этом из всех активных форм кислорода самым

РА, концентрация озона в ОКС - 0.4 мг/л) [5].

стабильным является пероксид водорода [9, 10].

Однако интервал от минимальной концентра-

Этот оксидант характеризуется относительно ма-

ции, вызывающей повреждение опухолевых кле-

лыми скоростями взаимодействия с органиче-

ток, до минимальной токсической концентрации

скими субстратами, высокой диффузной способ-

для нормальных клеток, т. е. диапазон терапевти-

ностью и свойствами мессенджера при активации

ческого действия озона, до сих пор определен не

факторов транскрипции и редокс регуляции экс-

был.

прессии генов [11]. При этом известно, что перок-

сид водорода является одним из вторичных мес-

Известно, что озон в высоких концентрациях

сенджеров, опосредующих действие озона на

способен окислять липиды, запуская их перекис-

клетки крови при проведении озонотерапии [12],

ное окисление, белки, а также деструктивно дей-

вероятно, через фактор транскрипции Nrf2 [13].

ствовать на ДНК. Озон реагирует с двойными

Открытым остается вопрос о целесообразности

связями азотистых оснований нуклеиновых кис-

замены озона на более стабильный пероксид во-

лот, образуя озониды, которые в итоге вызывают

дорода, в первую очередь, в отношении геноток-

образование разрывов в одиночных или двойных

сического действия.

спиралях. Кроме того, озон нарушает включение

азотистых оснований в структуру ДНК при ее

В связи с этим цель исследования состояла в

синтезе

[6]. Генотоксическое действие озона

определении на нормальных и опухолевых клет-

можно применять для усиления эффективности

ках эффективного генотоксического диапазона

противоопухолевых препаратов, в основе меха-

концентраций озона и пероксида водорода в

низмов действия которых лежит повреждение

сравнительном аспекте, а также в оценке

нуклеиновых кислот. Перспективность исполь-

перспективности усиления уровня повреждений

зования озона в сочетании с цисплатином, этопо-

ДНК при комбинировании гемцитабина с

зидом и гемцитабином на клеточных линиях ней-

озоном.

робластомы человека (SK-N-SH и SK-N-DZ) бы-

ла продемонстрирована в работе [7]. Однако из-за

выраженной токсичности гемцитабина на тести-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

руемые клеточные линии оценить потенцирую-

щий вклад озона в сочетании с этим цитостати-

Получение биологических образцов. В экспери-

ком не представилось возможным.

ментах использовали общую фракцию лейкоци-

тов периферической крови лабораторных мышей

Гемцитабин — антиметаболит из группы анта-

линии Kv:SHK (возраст 2 месяца, масса тела 25-

гонистов пиримидинов. Его основные метаболи-

30 г), приобретенных в Центральном питомнике

ты, гемцитабина дифосфат и гемцитабина три-

лабораторных животных РАМН (Крюково, Мос-

фосфат (dFdCTP), являются нуклеозидами.

ковская область). Мышей содержали в виварии,

dFdCTP конкурирует с дезоксицитидинтрифос-

для кормления использовали стандартную диету

фатом за включение в ДНК, тем самым ингиби-

со свободным доступом к коммерческому корму

руя удлинение цепи ДНК. Нетерминальное поло-

и водопроводной воде. Образцы периферической

жение dFdCTP в цепи нуклеиновых кислот

крови забирали из хвостовой вены мышей в про-

предотвращает обнаружение и репарацию вы-

бирки, содержащие фосфатно-солевой буфер-

званных им повреждений: этот процесс называет-

ный раствор с добавлением ЭДТА в качестве ан-

ся «замаскированным окончанием цепи ДНК».

тикоагулянта (ПБС-ЭДТА:

136.7 мМ NaCl,

Включение dFdCTP в цепь ДНК в конечном ито-

2.7 мМ KCl, 8.1 мМ Na₂HPO₄, 1.5 мМ KH₂PO₄,

ге приводит к прекращению цепи, фрагментации

1 мМ ЭДТА, pH 7.4). При этом концентрация

ДНК и апоптотической гибели злокачественных

клеток. Гемцитабин обладает феноменом само-

лейкоцитов составляла около 1·10⁶ кл/мл.

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК

571

В качестве опухолевых клеток использовали

фиксированный объем раствора гемцитабина

клетки аденокарциномы молочной железы чело-

(4 мкл) в концентрациях 1, 10, 100 и 1000 мкг/мл и

века линии MDA-MB-231. Клеточную линию

помещали их в термостат на 10 мин при 37°С, за-

культивировали в среде DMEM с добавлением

тем слайды помещали в ПБС-ЭДТА, содержащий

10% фетальной бычьей сыворотки, стрептомици-

озон (концентрация озона 0.4 мг/мл в ОКС), и

на и пенициллина (50 мкг/мл) и L-глютамина

термостатировали при 37°С в течение 10 мин. Та-

(НПП «ПанЭко», Москва). Рост клеточных куль-

кую же процедуру проводили с изменением по-

тур поддерживали в СО₂-инкубаторе (Sanyo, Япо-

следовательности воздействия гемцитабина и

ния) в увлажненной атмосфере, при температуре

озонированного раствора: сначала препараты по-

37°C и 5%-м содержании СО₂. Пересев клеток

мещали в озонированный ПБС-ЭДТА и инку-

бировали при используемых ранее условиях, за-

производили каждые 72 ч по достижению 80%-й

тем на слайды наносили 4 мкл раствора гемцита-

конфлюентности. После предварительного под-

бина с исследуемой концентрацией и термоста-

счета количества жизнеспособных клеток в об-

тировали при 37°C в течение 10 мин. Затем слайды

разце культуры с использованием витального

с клетками помещали в лизирующий раствор.

красителя трипанового синего и камеры Горяева

образец культуры в питательной среде смешивали

Анализ уpовня повpеждений ДНК в клеткаx

с ПБС-ЭДТА в необходимом соотношении до ко-

пpоводили c иcпользованием щелочного ваpиан-

нечной концентрации 5·10⁵-1·10⁶ кл/мл.

та метода ДНК-комет согласно протоколу, опи-

санному в работе [16]. Каждую группу препаратов

Полученные суспензии лейкоцитов крови мы-

сравнивали с собственным контролем. По методу

ши или клеток аденокарциномы молочной желе-

ДНК-комет регистрировали нуклеоиды, распо-

зы человека использовали для приготовления

ложенные в центральной части препарата в одной

микроскопных агарозных препаратов, состоящих

плоскости. На каждом слайде фотометрировали

из трех слоев 0.5%-й легкоплавкой агарозы с им-

по 25-30 «комет». Рассчитывалось среднее ариф-

мобилизованными клетками в среднем слое [14].

метическое значение показателя «процентное со-

Обработка химическими агентами. В качестве

держание ДНК в «хвосте кометы», которое отра-

генотоксических агентов использовали озон, пе-

жает интенсивность флуоресценции окрашенной

роксид водорода и гемцитабин.

ДНК, мигрировавшей во время электрофореза в

При воздействии озоном препарат помещали в

«хвост кометы», выраженное в процентах. Про-

ПБС-ЭДТА, содержащий озон в определенной

центное содержание ДНК в «хвосте кометы» пря-

концентрации, и инкубировали в термостате в те-

мо пропорционально уровню повреждений ДНК

чение 10 мин при 37°С. Затем слайды с клетками

в конкретной индивидуальной клетке и является

помещали в лизирующий раствор. Для получения

одним из наиболее информативных показателей

озона использовали аппарат терапевтический

[17, 18].

низких и средних концентраций озона с деструк-

Статистический анализ. Данные представлены

тором АОТ-НСК-01-С(А-16), разработанный в

в виде среднего значения ± стандартная ошибка.

Российском федеральном ядерном центре - Все-

Поcкольку вcе данные соответствовали ноpмаль-

российском научно-исследовательском институ-

ному pаcпpеделению (по теcту Колмогоpова-

те экспериментальной физики (Саров, Нижего-

Cмиpнова), то cтатиcтичеcкий анализ пpоводили

родская область) [15]. Диапазон тестируемых

c иcпользованием t-критерия Стьюдента (p <

концентраций озона в озоно-кислородной смеси

0.05).

составил 0.1-1.4 мг/л. Озонированный ПБС-

ЭДТА использовали сразу после окончания пяти-

минутного барботажа ОКС.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При воздействии пероксида водорода препа-

Оценка генотоксического действия озона. Для

рат помещали в фиксированный объем ПБС-

определения терапевтического диапазона дей-

ЭДТА (10 мл - большой объем раствора по срав-

ствия озона был исследован его генотоксический

нению со слайдами), содержащий пероксид водо-

эффект на опухолевые клетки и лейкоциты крови

рода определенной концентрации и инкубирова-

мыши в составе агарозных препаратов в зависи-

ли в термостате 10 мин при 37°С. Диапазон ис-

мости от концентрации озона в ОКС. В результа-

пользуемых концентраций Н₂О₂: 0.1-30 мкМ для

те проведенных экспериментов была получена

опухолевых клеток и 3-200 мкМ для лейкоцитов

линейная зависимость величины генотоксиче-

крови мыши. Непосредственно после инкубации

ского эффекта от концентрации озона на опухо-

в присутствии пероксида водорода микроскоп-

левых клетках линии MDA-MB-231 (рис. 1). При

ные слайды с клетками помещали в лизирующий

этом минимально действующая концентрация

раствор.

озона в ОКС составила

0.2 мг/л, которая

В случае комбинированного воздействия гем-

вызывала статистически значимые повреждения

цитабина и озона сначала на препараты наносили

ДНК в исследуемых опухолевых клетках на

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022

572

ГАПЕЕВ и др.

Рис. 1. Зависимость уровня повреждений ДНК в

Рис. 2. Зависимость уровня повреждений ДНК в

клетках аденокарциномы молочной железы человека

лейкоцитах крови мыши от концентрации озона в

MDA-MB-231 от концентрации озона в ОКС; * -

ОКС; * - p < 0.001 относительно уровня повреждений

p < 0.003 относительно уровня повреждений в кон-

в контроле по t-критерию Стьюдента, n ≥ 12.

троле по t-критерию Стьюдента, n ≥ 12.

0.21%), что свидетельствует о высокой чувстви-

уровне 1.55 ± 0.18%, что в полтора раза выше

тельности опухолевых клеток данной линии к

значений контрольных образцов без воздействия.

действию озона.

При оценке генотоксического эффекта этого

Оценка генотоксического действия пероксида

же диапазона концентраций озона в ОКС на лей-

водорода. Поскольку пероксид водорода является

коцитах крови мыши получена нелинейная зави-

вторичным мессенджером озона, для сопоставле-

симость (рис. 2). Было обнаружено, что чувстви-

ния их действия и оценки вклада Н₂О₂ в индук-

тельность лейкоцитов крови мыши к озону ниже,

цию повреждений ДНК в тех же условиях на клет-

чем чувствительность к озону опухолевых клеток.

ках аденокарциномы молочной железы человека

Минимальная генотоксическая концентрация

MDA-MB-231 и лейкоцитах крови мыши была

для лейкоцитов крови мыши составила 0.4 мг/л,

протестирована генотоксичность различных кон-

индуцирующая повреждения ДНК на уровне

центраций пероксида водорода.

0.99 ± 0.11%, что в 1.9 раза выше контрольных

Наши исследования показали, что клетки ли-

значений без воздействия. Стоит отметить, что

нии MDA-MB-231 чувствительны к генотоксиче-

при воздействии на лейкоциты крови мыши кон-

скому действию пероксида водорода и зависи-

центраций озона выше 0.4 мг/л и до 1.4 мг/л уве-

мость уровня повреждений ДНК от концентра-

личение уровня повреждений ДНК не наблюда-

ции Н₂О₂ оказывается линейной (рис.

3).

лось (рис. 2). Это может быть связано с активаци-

ей защитных механизмов лейкоцитов от

Минимально действующей концентрацией Н₂О₂

повреждающего действия озона, вероятно, за

в отношении исследуемых опухолевых клеток яв-

счет усиления компактизации хроматина и сни-

ляется концентрация 0.1 мкМ, при которой уро-

жения доступности свободных радикалов к ДНК

вень повреждений ДНК статистически значимо

клеток [19]. Большая чувствительность и линей-

увеличивается в четыре раза (1.14 ± 0.09%) по

ность зависимости уровня повреждений ДНК от

сравнению с контролем (0.28 ± 0.05%).

концентрации озона в опухолевых клетках гово-

Пероксид водорода оказывает генотоксиче-

рит о нарушении или отсутствии такого защитно-

ское действие на лейкоциты крови мыши и в этом

го механизма в клетках аденокарциномы молоч-

случае зависимость уровня повреждений ДНК от

ной железы человека линии MDA-MB-231.

концентрации Н₂О₂ также является линейной

Таким образом, на основании исследования

(рис. 4). Минимальная генотоксическая концен-

генотоксического действия озона методом ДНК-

трация пероксида водорода для нормальных кле-

комет можно заключить, что терапевтический

ток составляет 3.0 мкМ. При этом процентное со-

диапазон является достаточно узким и составляет

держание ДНК в «хвосте кометы» увеличивается

0.2-0.4 мг/л озона в ОКС. При таких концентра-

более чем в два раза (0.37 ± 0.07%) по сравнению

циях в опухолевых клетках аденокарциномы мо-

с контролем (0.15 ± 0.03%). В целом чувствитель-

лочной железы генерация повреждений ДНК на-

ность лейкоцитов крови интактных мышей к пе-

блюдается на уровне

(1.55

± 0.18%)-(2.17

роксиду водорода оказывается в среднем в десять

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК

573

Рис. 3. Зависимость уровня повреждений ДНК в

Рис. 4. Зависимость уровня повреждений ДНК в лей-

клетках аденокарциномы молочной железы человека

коцитах крови мыши от концентрации пероксида во-

MDA-MB-231 от концентрации пероксида водорода;

дорода; * - p < 0.003 относительно уровня поврежде-

* - p < 0.003 относительно уровня повреждений в

ний в контроле по t-критерию Стьюдента, n ≥ 12.

контроле по t-критерию Стьюдента, n ≥ 12.

воздействий (рис. 5). Аналогичные результаты

раз ниже по сравнению с клетками аденокарци-

были получены и для клеток аденокарциномы.

номы молочной железы человека MDA-MB-231.

Показано, что уровень повреждений ДНК в опу-

Таким образом, полученные данные позволя-

холевых клетках линейно зависит от концентра-

ют заключить, что терапевтический диапазон

ции гемцитабина. При комбинированном воз-

действия пероксида водорода находится в преде-

действии озона и гемцитабина уровень поврежде-

лах 0.1-3.0 мкМ. В этом диапазоне в клетках аде-

ний ДНК не зависит от последовательности

нокарциномы молочной железы можно индуци-

воздействий (рис. 6).

ровать повреждения ДНК на уровне 1-4%, что

превышает генотоксический эффект озона в те-

Предварительное или последующее воздей-

ствие озона в сочетании с гемцитабином позволя-

рапевтическом диапазоне. Однако при концен-

трации пероксида водорода более 3.0 мкМ гено-

ет снизить концентрацию последнего в 100 раз,

токсичность для нормальных клеток возрастает

так как повреждающее действие на опухолевые

более выражено, чем для озона в пределах кон-

центраций 0.4-1.4 мг/л. Эти данные свидетель-

ствуют о том, что пероксид водорода если и явля-

ется посредником в передаче сигнала озона при

воздействии на клетки, то генотоксический эф-

фект озона обусловлен более сложными механиз-

мами.

Оценка совместного генотоксического действия

озона и цитостатического препарата. Для опреде-

ления перспективности увеличения уровня по-

вреждений ДНК при комбинировании гемцита-

бина с озоном была проведена серия эксперимен-

тов, в ходе которых мы оценили повреждающее

действие гемцитабина в концентрациях 1, 10, 100

и 1000 мкг/мл с предварительной и последующей

обработкой озонированным ПБС-ЭДТА. Кон-

центрация озона в озоно-кислородной смеси со-

ставляла 0.4 мг/л.

Рис. 5. Зависимость уровня повреждений ДНК в лей-

В ходе экспериментов установлено, что озон в

коцитах крови мыши от концентрации гемцитабина;

концентрации 0.4 мг/л в ОКС усиливает геноток-

* - p < 0.005 относительно уровня повреждений при

сичность цитостатического препарата на лейко-

действии только гемцитабина по t-критерию Стью-

циты крови мыши. При комбинированном воз-

дента, n ≥ 12; ^ - p < 0.01 относительно уровня повре-

действии озона и гемцитабина уровень поврежде-

ждений по сравнению с концентрацией гемцитабина

ний ДНК не зависит от последовательности

1 мкг/мл по t-критерию Стьюдента, n ≥ 12.

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022

574

ГАПЕЕВ и др.

Комбинирование озона с концентрацией в озо-

но-кислородной смеси 0.4 мг/л с гемцитабином

потенцирует генотоксический эффект цитоста-

тика в отношении клеток аденокарциномы мо-

лочной железы человека MDA-MB-231, что мо-

жет позволить при разработке методики ком-

плексной противоопухолевой терапии снизить

дозу химиопрепарата и соответственно умень-

шить побочные эффекты в отношении нормаль-

ных клеток. В связи с возможностью разработки

более щадящих режимов противоопухолевой хи-

миотерапии продолжение исследований в этой

области оправдано и перспективно.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при финансовой поддержке

Рис. 6. Зависимость уровня повреждений ДНК в

клетках аденокарциномы молочной железы человека

Российского фонда фундаментальных исследова-

MDA-MB-231 от концентрации гемцитабина; * -

ний в рамках проекта № 19-02-00667а.

p < 0,005 относительно уровня повреждений при дей-

ствии только гемцитабина по t-критерию Стьюдента,

n ≥ 12; ^ - p < 0.01 относительно уровня повреждений

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

по сравнению с концентрацией гемцитабина

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

1 мкг/мл по t-критерию Стьюдента, n ≥ 12.

интересов.

клетки оказывает наибольшая концентрация гем-

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

цитабина 1000 мкг/л, а при совместном воздей-

ствии гемцитабина и озона такое же действие

Все манипуляции с животными проводили в

оказывает концентрация гемцитабина в 100 раз

соответствии с принципами и рекомендациями,

меньше - 10 мкг/л. Наблюдаемый эффект можно

установленными Директивой 2010/63/EU Евро-

объяснить более эффективным встраиванием в

пейского Парламента и Совета Европейского Со-

ДНК клеток метаболитов гемцитабина за счет ин-

юза от 22 сентября 2010 г. о защите животных, ис-

дуцирования озоном репаративных процессов, в

пользуемых в научных целях.

результате которых дезоксицитидинтрифосфат

замещается dFdCTP и нарушает структуру ДНК.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

При этом повреждающее действие цитостатика

увеличивается более чем в два раза (рис. 5 и 6).

1. J. Baeza-Noci and R. Pinto-Bonilla, Int. J. Mol. Sci.

22, 11796 (2021). DOI: 10.3390/ijms222111796

Следовательно, при введении озона в состав

2. Т. Г. Щербатюк и К. Н. Конторщикова, Патент на

комплексной противоопухолевой терапии нужно

изобретение RUS 2137481 C1 (1999).

учитывать, что возможно потенцирующее повре-

3. Т. Г. Щербатюк, Фізіологіч. журн.

(2),

ждающее действие исследуемого цитостатика не

(2008). DOI: 10.15407/fz54.02.041

только на трансформированные, но и на нор-

4. Т. Г. Щербатюк, В. Д. Селемир и Е. С. Клинцова,

мальные клетки. Однако генотоксичность препа-

Патент на изобретение RUS 2361590 (2007).

рата можно нивелировать за счет снижения его

5. Т. Г. Щербатюк, Е. С. Жукова (Плеханова),

дозы без потери эффективности.

Ю. В. Никитина и др., Биофизика 65 (2), 367

(2020). DOI: 10.31857/S0006302920020209

6. С. Н. Котельников, Труды ИОФАН 71, 10 (2015).

ВЫВОДЫ

7. A. Cannizzaro, C. V. Verga Falzacappa, M. Martinelli,

et al., J. Cell Physiol.

213

(1),

115

(2007).

Таким образом, на основе данных генотоксич-

DOI:10.1002/jcp.21097

ности, полученных с помощью щелочной версии

8. National Center for Biotechnology Information. Pub-

метода ДНК-комет, определен терапевтический

Chem Compound Summary for CID 60750, Gemcit-

диапазон действия в пределах от 0.2 до 0.4 мг/л

abine,

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/com-

для озона в озоно-кислородной смеси и от 0.1 до

pound/ Gemcitabine (Last modified: 05.03.2022, ac-

3.0 мкМ для пероксида водорода. Пероксид водо-

cessed 05.03.2022)

рода, который является вторичным мессендже-

9. О. Ю. Гудкова, С. В. Гудков, А. Б. Гапеев и др.,

ром при озонотерапии, возможно, вносит суще-

Биофизика 50 (5), 773 (2005).

ственный вклад в генотоксическое действие озо-

10. И. Н. Штаркман, С. В. Гудков, А. В. Черников

на, но не определяет его в полной мере.

и др., Биофизика 53 (1), 1 (2008).

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК

575

11. Ю. И. Губский, И. Ф. Беленичев, С. В. Павлов

15. С. Н. Буранов, В. И. Карелин, О. А. Пименов

и др., Современные проблемы токсикологии,

и др., Мед. альманах 3 (27), 26 (2013).

№ 2, 37 (2006).

16. А. Б. Гапеев и Н. А. Лукьянова, Биофизика 60 (5),

889 (2015).

12. V. Bocci, I. Zanardi, G. Valacchi, et al., Cardiovasc.

17. A. R. Collins, A. A. Oscoz, G. Brunborg, et al., Muta-

Haematol. Disorders - Drug Target 15, 127 (2015).

genesis

(3),

143

(2008). DOI:

10.1093/mu-

DOI: 10.2174/1871529X1502151209114642

tage/gem051

13. L. Re, Front. Physiol. 13, 842229 (2022). DOI:

18. N. K. Chemeris, A. B. Gapeyev, N. P. Sirota, et al.,

10.3389/fphys.2022.842229

Mutat. Res. 558 (1-2), 27 (2004).

14. A. B. Gapeyev, N. A. Lukyanova, and S. V. Gudkov,

19. Н. Ю. Воробьева, Е. Ю. Архангельская, А. Ю. Буш-

Central Eur. J. Biol.

(10),

915

(2014). DOI:

манов и др., Саратовский науч.-мед. журн. 10 (4),

10.2478/s11535-014-0326-x

735 (2014).

Comparative Study of DNA Damage in Mouse Blood Leukocytes and MDA-MB-231

Human Breast Adenocarcinoma Cells Depending on the Concentration of Ozone,

Hydrogen Peroxide and Gemcitabine

A.B. Gapeyev*, E.S. Zhukova**, V.A. Sinelnikova***, G.Yu. Balakin***, M.Yu. Zemskova****,

G.K. Rystsov****, and T.G. Shcherbatyuk**^, ***

*Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

**Nizhny Novgorod Research Institute of Hygiene and Occupational Pathology, Federal Service for Surveillance on Consumer

Rights Protection and Human Welfare, ul. Semashko 20, Nizhny Novgorod, 603005 Russia

***Pushchino State Institute of Natural Science, prosp. Nauki 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

****G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,

prosp. Nauki 5, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

The genotoxic activity of ozone and hydrogen peroxide was tested using the comet assay on normal Kv:SHK

mouse peripheral blood leukocytes and human breast adenocarcinoma cell line MDA-MB-231 in vitro. The

comet assay showed that the concentration range from the minimum ozone concentration in ozone-oxygen

mixture that caused damage to DNA of tumor cells to the minimum ozone concentration that induced geno-

toxic effects on normal blood cells was 0.2 to 0.4 mg/l, while the minimum concentration of hydrogen per-

oxide was 0.1 to 3.0 μM. Furthermore, the comet assay revealed that genotoxic effect of ozone on breast ad-

enocarcinoma cells was less than that of hydrogen peroxide. Gemcitabine, a cytostatic drug, in combination

with ozone-oxygen (ozone concentration in the mixture was 0.4 mg/l) induced potentiation of the genotoxic

effect of the cytostatic agent: the cytotoxic effect of gemcitabine on cells increased more than twofold through

enhancement of DNA damage. It is assumed that the increased genotoxic effect of gemcitabine in combina-

tion with ozone is associated with intensification of incorporation of gemcitabine main metabolites into the

DNA strand because of stimulation of DNA repair processes.

Keywords: ozone, hydrogen peroxide, gemcitabine, genotoxic effect, peripheral blood leukocytes, MDA-MB-231

breast cancer cell line

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022