БИОФИЗИКА, 2022, том 67, № 3, с. 576-580

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 612

МИОНЕВРАЛЬНАЯ ПЕРЕДАЧА В БАРИЕВОЙ СРЕДЕ

Казанский государственный медицинский университет, 420012, Казань, ул. Бутлерова, 49

E-mail: sgrishin@inbox.ru

Поступила в редакцию 11.01.2022 г.

После доработки 01.02.2022 г.

Принята к публикации 02.02.2022 г.

Исследована проблема мионевральной передачи амфибий (озерной лягушки) в бескальциевой сре-

де. Известно, что для инициации выхода нейромедиатора в синаптическую щель необходима акти-

вация потенциал-зависимых кальциевых каналов. В начальных экспериментах была воссоздана

описанная многими авторами картина угнетения вызванных постсинаптических ответов вплоть до

их полного исчезновения в бескальциевой внешней среде. В экспериментах после замены перфузи-

онного раствора Рингера с нормальным ионным содержанием Са²⁺ на бескальциевый, но с эквимо-

лярным содержанием Ba²⁺, амплитуда токов концевой пластинки упала более чем в десять раз,

однако сохранялась в течение всего времени наблюдения - более 1 ч. Далее для чистоты экспери-

мента был использован кофеин - миметик выброса содержимого рианодин-чувствительных каль-

циевых депо. После подачи (и отмывки) 100 мкМ кофеина вызванные ответы в исключительно ба-

риевой среде возобновлялись (в особой специфической сверхзатянутой неровной форме) только в

условиях продления потенциала действия нервного окончания путем аппликации 4-аминопириди-

на в концентрации 100 мкМ, причем всего лишь в несколько первых минут. В дальнейшем вызван-

ные токи вновь прекращались, наблюдались лишь «вспышки» миниатюрных постсинаптических

токов в ответ на каждую стимуляцию. Таким образом, подтверждена принципиальная возможность

инициированной ионами бария нервно-мышечной передачи, хотя и в весьма специфических экс-

периментальных условиях.

Ключевые слова: нервно-мышечный синапс, ионы бария, металлы щелочноземельной группы, потенциал-

зависимые кальциевые каналы, вызванная квантовая секреция.

DOI: 10.31857/S0006302922030176, EDN: APNOGP

го канала, является не размер иона. В первую оче-

Хорошо известно, что потенциал действия, до-

редь важную роль играет его способность как к

ходя до синаптического окончания, вызывает

гидратированию/дегидратированию, так и к свя-

многоквантовый выход нейромедиатора, кото-

зыванию в поре ионного канала [2].

рый активируют потенциал-зависимые кальцие-

вые каналы [1]. В научной литературе обсуждает-

Вклад вышеперечисленных катионов в созда-

ся вопрос о проводимости этими каналами не-

ние примембранных фиксированных заряжен-

кальциевых двухвалентных катионов как общем

ных группировок описан еще в 1853 году Г. Гельм-

свойстве нейрональной мембраны [2, 3]. Так, в

гольцем [5]. Далее М. Гуи [6] и Д. Чэпмен [7], ос-

ГАМК-ергических синапсах гиппокампа крысы

новываясь на представлениях о двойном

при замене в базовом растворе Са²⁺ на Sr²⁺ си-

электрическом слое, независимо друг от друга

наптическая передача осуществлялась, но менее

связали этот эффект с количественным значением

эффективно. То же самое наблюдалось и при за-

поверхностного потенциала. В последующем эти

взгляды были существенно модифицированы

мене Са²⁺ на Ва²⁺ [4].

О. Штерном [8]. Согласно их представлениям,

В главную подгруппу второй группы периоди-

ческой системы входят следующие металлы (в по-

введение в перфузионный раствор Са²⁺ и других

рядке возрастания номеров и размеров): берил-

ионов вышеперечисленного ряда, приводит к из-

лий, магний, кальций, стронций, барий и радий.

менению потенциала поверхностной мембраны.

Фактором, влияющим на проницаемость ионно-

Причиной этого служит образование экранирую-

щего слоя противоионов и нейтрализация заря-

Сокращение:ТКП - токи концевой пластинки.

дов соответствующих группировок.

576

МИОНЕВРАЛЬНАЯ ПЕРЕДАЧА В БАРИЕВОЙ СРЕДЕ

577

Существуют множественные свидетельства,

Если бы действие Са²⁺ и других катионов опи-

сываемого ряда определялось только путем экра-

что в центральных нейронах моллюсков Ва²⁺ и

нирования поверхностных зарядов, то значение в

Sr²⁺ являются более эффективными переносчи-

процессе имела бы как валентность ионов, так и

ками некоторых компонентов тока через Са²⁺-

их концентрация. При наличии же связывания

эффект должен зависеть также от химических ха-

каналы мембраны, чем сам Са²⁺ [13-16]. Замена

рактеристик ионов, которые определяют кон-

в перфузионном растворе Са²⁺ на Ва²⁺ в сходных

станту их связывания с фиксированными груп-

концентрациях позволила оценить роль предва-

пировками [9].

рительной деполяризации мембраны в инактива-

Показано, что двухвалентные катионы в сопо-

ции входящего тока Са²⁺ [17-20].

ставимых концентрациях оказывают различное

В наших предшествующих исследованиях на

влияние на потенциал-зависимые характеристи-

мотонейронах лягушки [21] показано, что при ис-

ки поверхностной мембраны, то есть они дей-

ствительно связываются с фиксированными

пользовании ионов Sr²⁺ в периневральном Са²⁺

токе инактивация в терминали двигательного

группировками. На Са²⁺-каналах скелетных мы-

нейрона определялась повышением концентра-

шечных волокон была исследована возможность

ции внутриклеточного Са²⁺, которая обладает

связывания Са²⁺ и Ba²⁺[10]. Карбоксильную

возвратным блокирующим действием [22].

группу при этом рассматривали в качестве наибо-

лее вероятной основы такой связи. Описание

энергетического профиля Са²⁺-канала, по мне-

МЕТОДИКА

нию авторов, может осуществляться в рамках мо-

дели с одной энергетической ямой и двумя энер-

Эксперименты по регистрации токов конце-

гетическими барьерами.

вой пластинки (ТКП) проводили in vitro на препа-

В 2014 г. были опубликованы результаты кри-

рате: n.ichiatikus - m.sartorius Rana ridibunda. Дека-

сталлографического анализа селективного каль-

питацию осуществляли под эфирным наркозом.

циевого фильтра, встроенного в гомотетрамер-

Сухожилие дистального конца мышцы брали на

ный бактериальный NaV-канал [11]. Приведен-

лигатуру, мышцу отсепаровывали до места вхож-

ные данные показывают взаимодействие

дения в нее нерва. После вскрытия брюшной по-

гидратированных ионов Са²⁺ с двумя высокоаф-

лости седалищный нерв брали на лигатуру у места

вхождения в спинной мозг и выделяли до места

финными Ca²⁺-связывающими сайтами и после-

вхождения в мышцу. Для предотвращения сокра-

дующим третьим низкоаффинным сайтом, кото-

щений мышцы ее волокна поперечно рассекали.

рый координирует движение иона Са²⁺ внутрь

клетки. Первый, входной сайт селективного

Непрямое раздражение нерва проводили с по-

фильтра образован четырьмя карбоксильными

мощью серебряных электродов в отдельной гер-

боковыми цепями, которые играют важную роль

метической увлажненной камере, изолирован-

в селективности к ионам Са²⁺. Четыре карбок-

ной от ванночки, в которую помещали мышеч-

сильные группы и четыре основные карбониль-

ный препарат. Герметизацию отсека с нервом

ные группы образуют второй сайт, который слу-

осуществляли тонкой пластиной, покрытой сло-

ем вазелина. Электростимуляцию нерва для реги-

жит мишенью блокирующего действия как Cd²⁺,

страции токов концевой пластинки осуществля-

так и Mn²⁺. Последний сайт образован только че-

ли прямоугольными импульсами сверхпороговой

тырьмя основными карбонильными группами,

амплитуды длительностью 0.2-0.4 мс с частотой

формирующими выход для катиона в централь-

0.03 Гц.

ную полость. Эта архитектура пор предполагает

перемещение ионов Са²⁺ через фильтр канала в

Вызванную квантовую секрецию оценивали

процессе поэтапного связывания.

по амплитудно-временным параметрам вызван-

ных ТКП, которые отводили потенциальным и

Что касается третьей группы теорий - аллосте-

токовым микроэлектродами в области концевой

рической модуляции структуры Са²⁺ канала -об-

пластинки мышечного волокна. Оценку резуль-

разующиеся в результате такого взаимодействия

татов - накопления и усреднения ТКП - осу-

молекулярные изменения имеют важные физио-

ществляли с помощью персонального компьюте-

логические и патофизиологические последствия.

ра с периодом опроса 5-20 мкс на точку. Расчет

Аллостерическое подавление некоторых порооб-

параметров спада токов концевой пластинки

разующих Ca_vα₁-субъединиц (Ca_v2.3, Ca_v3.2)

проводили при помощи программного обеспече-

ионами Zn²⁺ и Cu²⁺ может играть важную роль в

ния Origin. Мышечный препарат перфузировали

регуляции тока катионов [12].

раствором Рингера со скоростью 2 мл/мин.

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022

578

ГРИШИН и др.

ТКП при потенциале действия нервного окончания в условиях его продления, вызванного аппликацией 100 мкМ

4-аминопиридина. Показан трек ТКП при полном отсутствии Са²⁺ (с эквимолярной заменой на Ва²⁺) на фоне ТКП при

нормальном содержании Са²⁺. В последнем заметна характерная повторная активность. Представлены репрезентативные

результаты отдельных опытов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

ОБСУЖДЕНИЕ

Как известно, в перфузионной среде, в кото-

Эксперименты в среде, свободной от двухва-

лентных катионов. При фиксации потенциала на

рой Са²⁺ заменен на Ba²⁺, действие основных эн-

уровне -40 мВ средняя амплитуда многокванто-

догенных модуляторов на мионевральную пере-

вых ТКП в обычном растворе Рингера составила

дачу кардинально изменяется [23], что, есте-

138 ± 25 нА (n = 10). Спад токов описывался од-

ственно, затрагивает и саму ацетилхолиновую

ной экспонентой с постоянной времени спада

трансмиссию. Тем интереснее данные работы

1.41 ± 0.12 мс (n = 10).

[24], согласно которым амплитуда спонтанных

ТКП не зависит от внеклеточной концентрации

В бескальциевом перфузионном растворе на-

ионов Са²⁺. Корреляция между ними и частотой

блюдалось постепенное снижение амплитуды

возникновения миниатюрных потенциалов здесь

ТКП. После получаса содержания в свободном от

не прослеживается, что подтверждается и други-

ионов Са²⁺ растворе ТКП переставали наблю-

ми работами [25, 26].

даться.

Сохранение спонтанных ответов концевой

пластинки в нервно-мышечном синапсе лягушки

Эксперименты в бариевой среде. После замены

в растворах, не содержащих Ca²⁺, но при его за-

в перфузионном растворе Са²⁺ на эквимолярное

мене на Mg²⁺, указывает на «дуальный» механизм

содержание Ba²⁺ амплитуда ТКП упала более чем

выхода квантов ацетилхолина в мионевральных

в десять раз, но сохранялась все время наблюде-

синапсах, о чем авторы работы [25] высказыва-

ния - более одного часа (n = 9).

лись еще в 1954 г. Вскоре после этого стало из-

Кофеин (100 мкМ) - агонист рианодин-чув-

вестно, что в нервно-мышечном синапсе тепло-

ствительных рецепторов кальциевых депо - в ба-

кровных (диафрагма крысы in vitro) частота спон-

риевой среде вызвал возобновление ответов, ко-

танных постсинаптических ответов снижается

торые имели специфическую сверхзатянутую не-

как при снижении концентрации Са²⁺, так и при

ровную форму (см. рисунок). Данная картина

увеличении содержания Mg²⁺ [27-29]. Позже бы-

наблюдалась исключительно в условиях апплика-

ло показано, что в поддержании спонтанного вы-

ции 4-аминопиридина (100 мкМ) и лишь в те-

хода квантов медиатора в мионевральных синап-

чение нескольких первых минут (n = 9). В

сах крысы ионы Sr²⁺ равноэффективны ионам

дальнейшем вызванные токи прекращались. На-

блюдались лишь

«вспышки» миниатюрных

Са²⁺. Кроме того, Co²⁺, Pb²⁺, Zn²⁺ и La³⁺ увели-

постсинаптических токов в ответ на каждую сти-

чивали время роста миниатюрных потенциалов,

муляцию.

но были не в состоянии поддерживать квантовый

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022

МИОНЕВРАЛЬНАЯ ПЕРЕДАЧА В БАРИЕВОЙ СРЕДЕ

579

релиз достаточно долгое время [30]. Была показа-

Наблюдаемые в наших экспериментах результаты

имели сходную картину.

на также способность Ba²⁺ наравне с Са²⁺ под-

держивать спонтанную секрецию в синапсе диа-

Одни авторы сообщают о вызванных ТКП в

фрагмы мыши [31].

бариевой среде [26], другим не удалось зареги-

стрировать их вне специальных условий [34]. В

Ранее нами было показано, что в случае пол-

литературе также отмечалось, что Ba²⁺-потенци-

ной замены в растворе Ca²⁺ на Ва²⁺ наблюдалось

алы являются очень неустойчивыми и быстро

двухфазное изменение положительной составля-

ослабевают при повторном вызове [35]. Однако

ющей периневрального тока седалищного нерва

отмечалось и то, что запускающий экзоцитоз ве-

лягушки [32]. После нескольких минут действия

зикул при одноквантовом выходе медиатора низ-

ионов Ва²⁺ амплитуда положительной компо-

копороговый Са²⁺-связывающий сайт, активи-

ненты увеличивалась на треть. В случае полной

рующийся в области Са²⁺-макродомена, обнару-

замены Са²⁺ на Ва²⁺ в концентрации 1.8 мМ мы

наблюдали двухфазное изменение последней по-

живает сходную чувствительность к ионам Са²⁺,

ложительной составляющей периневрального то-

Sr²⁺ и Ва²⁺ [36]. Наиболее вероятным молекуляр-

ка. После пятиминутного действия ионов Ba²⁺

ным кандидатом сайта служит высокоаффинная

амплитуда положительной компоненты увеличи-

изоформа одного из белков мембраны везикул -

валась примерно на треть. К двадцатой минуте

синаптотагмин III, у которого обнаружена спо-

этот показатель возрастал уже до двух третей от

собность связывать перечисленные катионы [37].

контроля.

Приведенные результаты собственных иссле-

Приведенные в данной статье результаты пока-

дований являются подтверждением принципи-

зали, что после замены перфузионного раствора

альной возможности нервно-мышечной переда-

Рингера с нормальным ионным содержанием на

чи, инициированной ионами Ba²⁺. Однако это

бескальциевый, но с эквимолярным содержанием

возможно лишь в весьма специфических услови-

Ba²⁺, амплитуда токов концевой пластинки упала

ях эксперимента.

более чем в десять раз, но сохранялась больше часа.

Далее использовали кофеин (агонист выброса

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Сa²⁺ из рианодин-чувствительных депо) с целью

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

истощения запасов внутриклеточного Сa²⁺.

интересов.

После подачи (и отмывки) кофеина в бариевой

среде вызванные ответы возобновлялись только в

условиях аппликации 4-аминопиридина, хотя и

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

имели специфическую сверхзатянутую неровную

Все применимые международные, националь-

форму. Эффект наблюдался всего лишь в течение

ные и институциональные принципы ухода и ис-

нескольких первых минут, после чего вызванные

пользования животных при выполнении работы

токи вновь прекращались. При этом в ответ на

были соблюдены.

каждую стимуляцию наблюдались лишь «вспыш-

ки» миниатюрных постсинаптических токов, что

напоминает ответ на серию стимуляции в гипо-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

кальциевом растворе. Однако в нашем случае мы

1. M. A. Mukhamedyarov, S. N. Grishin, A. L. Zefirov,

имели дело с одиночными нервными импульса-

and A. Palotas, Pflügers Arch. 458 (3), 563 (2009).

ми. Появление в первые минуты ТКП соответ-

2. П. Г. Костюк, Кальций и клеточная возбудимость

ствует начальному подъему амплитуды последней

(Наука, М., 1986).

положительной составляющей периневрального

3. С. Н. Гришин, Кальциевый ток (Изд-во Казан.

ответа при замене Сa²⁺ на Ba²⁺.

гос. техн. ун-та, Казань, 2010).

В 1950 г. авторы работы [33] нашли, что в бес-

4. T. Ohno-Shosaku, S. Sawada, K. Hirata, and

кальциевой среде потенциал действия доходит до

C. Yamamoto, Neurosci. Res. 20 (3), 223 (1994).

нервных окончаний. Однако, им не удалось заре-

5. H. Helmholtz, Annalen der Physik und Chemie 165

гистрировать вызванные ТКП. В предельных ги-

(6), 211 (1853).

покальциевых растворах вызванный одиночным

6. M. Gouy, J. Phys. Theor. Appl. 9, 457 (1910).

нервным импульсом постсинаптический ответ не

7. D. L. Chapman, Phil. Mag. & J. Sci. 25 (6), 475

бывает крупнее, чем один миниатюрный. В этих

(1913).

условиях серия нервных импульсов вызывает слу-

8. O. Z. Stern, Electrochemistry 30, 508 (1924).

чайный выброс небольших токов концевой пла-

9. P. G. Kostyuk, Neuroscience 92 (4), 1157 (1999).

стинки. Вариация их амплитуд описывается сту-

10. G. Cota and E. Stefani, J. Physiol. 351, 135 (1984).

пенчатой модой, что, по-видимому, соответству-

11. L. Tang, T. M. Gamal El-Din, J. Payandeh, et al., Na-

ет кратности разрядов этих токов

[24].

ture 505 (7481), 56 (2014).

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022

580

ГРИШИН и др.

12.

F. Neumaier, M. Dibué-Adjei, J. Hescheler, and

24. P. Fatt and B. Katz Cold. Spring. Harb. Symp. Quant.

T. Schneider, Prog. Neurobiol. 301 (15), 24 (2015).

Biol. 17, 275 (1952).

13.

B. Katz and R. Miledi, J. Physiol. 203 (2), 459 (1969).

25. J. Del Castillo and B. Katz, J. Physiol. 124 (3), 553

(1954).

14.

D. A. Nachshen and M. P. Blaustein, J. Gen. Physiol.

26. Z. L. Blioch, I. M. Glagoleva, E. A. Liberman, and

79 (6), 1065 (1982).

V. A. Nenashev, J. Physiol. 199 (1), 11 (1968).

15.

H. D. Lux and K. Nagy, Pflugers Arch. 391 (3), 252

27. A. W. Liley, J. Physiol. 134 (2), 427 (1956).

(1981).

28. J. I. Hubbard, J. Physiol. 159, 507 (1961).

16.

R. DiPolo, C. Caputo, and F. Bezanilla, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 80 (6), 1743 (1983).

29. D. Elmqvist and D. S. Feldman, J. Physiol. 181 (3),

487 (1965).

17.

D. Tillotson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (3), 1497

(1979).

30. R. Anwyl, T. Kelly, and F. Sweeney, Brain. Res. 246

(1), 127 (1982).

18.

P. Brehm, R. Eckert, and D. Tillotson, J. Physiol. 306,

193 (1980).

31. M. J. Curtis, D. M. Quastel, and D. A. Saint, J.

Physiol. 373, 243 (1986).

19.

R. Eckert and D. L. Tillotson, J. Physiol. 314, 265

(1981).

32. S. N. Grishin, Biochemistry (Moscow), Suppl. Ser. A:

Membrane and Cell Biology 10 (2), 99 (2016).

20.

A. M. Brown, K. Morimoto, Y. Tsuda, and D. L. Wil-

33. P. Fatt and B. Katz, J. Physiol. 111, 46 (1950).

son, J. Physiol. 320, 193 (1981).

34. E. M. Silinsky, Br. J. Pharmacol. 59 (1), 215 (1977).

21.

S. N. Grishin, Biochemistry (Mosc.), Suppl. Ser. A:

Membrane and Cell Biology 8 (3), 213 (2014).

35. I. S. Magura, J. Membr. Biol. 35 (3), 239 (1977).

22.

M. A. Mukhamedyarov, S. N. Grishin, A. L. Zefirov,

36. G. Neves, A. Neef, and L. Lagnado, J. Physiol. 535,

and A. Palotas, Brain Res. Bull. 69, 652 (2006).

809 (2001).

23.

A. U. Ziganshin, A. E. Khairullin, C. H. V. Hoyle, and

37. A. L. Zefirov and P. N. Grigor'ev, Neurosci. Behav.

S. N. Grishin, Int. J. Mol. Sci. 21, 6423 (2020).

Physiol. 40 (4), 389 (2010).

Neuromuscular Transmission in a Barium Environment

S.N. Grishin, A.E. Khairullin, A.Y. Teplov, and M.A. Mukhamedyarov

Kazan State Medical University, ul. Butlerova 49, Kazan, 420012 Russia

The problem of the neuromuscular junction of amphibians (lake frogs) in a calcium-free medium was stud-

ied. It is known that activation of potential-dependent calcium channels is necessary to initiate the release of

neurotransmitter into the synaptic cleft. In our initial experiments, we demonstrated depression of evoked

postsynaptic responses up to their complete disappearance in a calcium-free environment as it was described

by many authors. In our experiments, when Ringer's solution that contained a normal ionic content of

Ca²⁺was replaced with a calcium-free Ringer that had an equimolar content of Ba²⁺, the amplitude of the end

plate currents decreased by a factor of more than ten, although it remained at the same level during the entire

observation time for more than one hour. Then, caffeine, that was required to initiate calcium release from

ryanodine-sensitive Ca²⁺ stores, was used for fairness. Responses elicited by 100 μM caffeine exclusively after

the administration of barium were observed again (in a specific overtightened uneven shape) only after the

application of 4-aminopyridine (100 μM) and lasted just the first few minutes. Further, the evoked currents

were blocked again, only “flashes” of miniature postsynaptic currents were seen in response to each stimula-

tion. In this work, we have confirmed the fundamental possibility of neuromuscular junction initiated by bar-

ium ions, even under very specific experimental conditions.

Keywords: neuromuscular junction, barium ions, alkaline earth metals, potential-dependent calcium channels,

induced quantum secretion

БИОФИЗИКА том 67

№ 3

2022