БИОФИЗИКА, 2022, том 67, № 4, с. 819-826

БИОФИЗИКА CЛОЖНЫX CИCТЕМ

УДК 577.3

МЕТОД МУЛЬТИСЕНСОРНОЙ ИНВЕРСИОННОЙ

ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ В АНАЛИЗЕ

ПРОТИВОГЛАУКОМНЫХ ПРЕПАРАТОВ

***, И.И. Колеcниченко****,

В.А. Намиот

Ю.Д. Кузнецова*^, **, А.А. Балашов**, Ж.М. Салмаси*, С.Н. Удальцов*****

*Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава РФ,

ул. Островитянова, 1, Москва, 117997, Россия

^#E-mail: blm1962@yandex.ru

**НП Международный научно-практический Центр пролиферации тканей,

ул. Пречистенка, 29/14, Москва, 119034, Россия

***Институт ядерной физики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова,

Ленинские горы, 1, Москва, 119991, Россия

****Институт физической химии и электрохимии имени А.Н. Фрумкина PАН,

Ленинский просп., 31/4, Москва, 119071, Россия

*****ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований РАН»,

ул. Институтская, 2, Пущино Московской области, 142290, Россия

Поступила в редакцию 23.05.2021 г.

После доработки 06.02.2022 г.

Принята к публикации 18.03.2022 г.

Электрохимическим методом мультисенсорной инверсионной вольтамперометрии изучена воз-

можность определения в слезной жидкости ряда противоглаукомных препаратов (арутимола, пило-

карпина, трусопта и др.). Показано, что метод эффективен для определения указанных препаратов.

Рассмотрена динамика изменения их концентрации во времени. Таким образом, расширен список

органических веществ, которые могут определяться методом мультисенсорной инверсионной

вольтамперометрии.

Ключевые слова: мультисенсорная инверсионная вольтамперометрия, планарные электроды, противо-

глаукомные препараты, арутимол, тимолол, трусопт, азопт, дорзопт, пилокарпин, фотил.

DOI: 10.31857/S0006302922040214, EDN: IVVGIO

Глаукома - одна из наиболее тяжелых форм

этом большинство из них ориентированы на сни-

офтальмопатологии, занимающая лидирующее

жение уровня внутриглазного давления, как за

место после катаракты среди причин слепоты и

счет подавления продукции водянистой влаги,

слабовидения населения Земли. До сих пор не су-

так и за счет активизации оттока внутриглазной

ществует эффективных методов лечения глауко-

жидкости из глаза. Для определения фармакоки-

мы, можно говорить только о более или менее

нетики и эффективного использования исполь-

удовлетворяющих методиках, как минимум при-

зующихся противоглаукомных препаратов суще-

останавливающих дальнейшее развитие заболе-

ственна оценка динамики изменения их концен-

вания.

трации во времени после применения. С этой

В Российской Федерации в нозологической

целью вполне успешно может быть задействован

структуре слепоты и слабовидения доля глаукомы

разработанный в Институте физической химии и

составляет 29%. Распространенность глаукомы

электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН (Москва)

среди населения России за последние годы вы-

метод мультисенсорной инверсионной вольтам-

росла в 2,8 раза [1]. Глаукома занимает первое ме-

перометрии [2, 3]. Этим методом определяется

сто в структуре первичной инвалидности по зре-

изменение электрохимической активности кати-

нию в большинстве регионов Российской Феде-

онов металлов в растворе в результате их взаимо-

рации.

действия с органическими веществами. Метод

На практике используется большое число про-

позволяет осуществлять идентификацию различ-

тивоглаукомных препаратов местного примене-

ных веществ на основании анализа характерных

ния, различающихся по механизму действия. При

изменений вольтамперных кривых, происходя-

819

820

БАЛАШОВА и др.

щих в результате введения различных веществ в

На рис. 1 (кривая 2) показано влияние слезной

исходную тест-систему. На получаемых вольтам-

жидкости на усредненную вольтамперограмму,

перограммах при этом фиксируются изменения

полученную у десяти здоровых людей. Разброс

пиков токов растворения металлов, которые

(ошибка) результатов для слезной жидкости со-

можно определить для каждого металла тест-си-

ставляет 12%.

стемы по отдельности или оценить изменение

Влияние исследуемых препаратов на тест-систе-

всей вольтамперограммы интегрально. Измере-

му. На планарные электроды фирмы «Автоком»

ния проводят на одном индикаторном электроде,

наносили 50 мкл тест-системы, снимали инвер-

что имеет большое преимущество по сравнению с

сионную вольтамперограмму при потенциале ка-

мультисенсорными методами, использующими

тодного осаждения металлов минус 1.55 В отно-

набор измерительных электродов.

сительно хлорсеребряного электрода с последую-

Работоспособноcть и эффективность метода

щей разверткой в анодную сторону потенциала до

экспресс-диагностики биологических объектов с

0.3 В. Полученная вольтамперограмма являлась

использованием мультисенсорной инверсион-

фоновой. Затем на электрод помещали 50 мкл

ной вольтамперометрии ранее была продемон-

свежего раствора тест-системы и исследуемые

стрирована нами пpи опpеделении некоторых

препараты в различной концентрации, после чего

применяемых в офтальмологии анестетиков -

снова регистрировали вольтамперограммы.

наропина, хирокаина и лидокаина [4], ропивака-

Влияние исследуемых препаратов на слезную

ина [5], а также ряда других офтальмологичеcких

жидкость. Исследуемые препараты по одной кап-

пpепаpатов - визомитина [9], ланостерола и фен-

ле вносили в конъюктивальный мешок глаза и ту-

танила [10], в том числе противоглаукомного пре-

да же помещали диск диаметром 8 мм из предва-

парата бетоптика и некоторых его дженериков

рительно обработанного пористого материала

[11, 12].

(фильтровальная бумага). Через определенное

В данной работе оценены возможности метода

время бумажный диск извлекали из конъюнкти-

мультисенсорной инверсионной вольтамперо-

вального мешка и помещали на электрод с нане-

метрии при анализе ряда широко применяемых

сенной на него тест-системой (50 мкл). Измере-

противоглаукомных препаратов (арутимола,

ния проводили через 3 мин, 1 ч, далее через каж-

азопта, трусопта и др., см. табл. 1) по оценке

дый час в течение шести часов после

их содержания в слезной жидкости после инстил-

инстилляции препаратов.

ляции.

РЕЗУЛЬТАТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Взаимодействие исследуемых препаратов с тест-

Получение фоновой вольтамперограммы. На

системой. На рис. 1 (кривые 3-6) показаны вольт-

планарные электроды производства ООО НПП

амперограммы, полученные для трусопта в раз-

«Автоком» (Москва) наносили 50 мкл тест-систе-

личных концентрациях in vitro. Можно видеть,

мы, состоящей из 0.05 М КС1 и катионов метал-

что в присутствии трусопта токи ионов металлов,

лов (Zn²⁺, Cd²⁺, Рb²⁺, Со²⁺ и Hg²⁺, каждый в

входящих в тест-систему, изменяются в разной

концентрации 5∙10^-5 М), затем снимали инверси-

степени в зависимости от концентрации трусоп-

онную вольтамперограмму при потенциале ка-

та: с ростом концентрации ток иона ртути возрас-

тодного осаждения металлов -1.55 В относитель-

тает, а у остальных металлов - уменьшается.

но хлорсеребряного электрода с последующей

На рис. 2 и 3 приведены аналогичные данные

разверткой в анодную сторону до потенциала до

соответственно для арутимола и пилокарпина.

0.3 В. Полученная вольтамперограмма являлась

Так как в препарате дорзопт основное действу-

фоновой (рис. 1, кривая 1).

ющее вещество является тем же, что и в трусопте,

Влияние слезной жидкости здоровых людей на

влияние дорзопта на тест-систему аналогично

тест-систему. Для изучения влияния на тест-си-

влиянию трусопта и на отдельном рисунке не

стему слезной жидкости в конъюнктивальный

приводится. Также не приводится соответствую-

мешок глаза помещали диск диаметром 8 мм из

щий рисунок для азопта, поскольку его действую-

предварительно обработанного пористого мате-

щее вещество- бринзоламид - влияет на тест-си-

риала (фильтровальной бумаги, которую предва-

стему аналогично дорзоламиду.

рительно тщательно промывали в спирте и ди-

Результаты по влиянию всех исследованных

стиллированной воде и сушили при температуре

противоглаукомных препаратов на тест-систему

80ºС в течение трех часов). Через определенное

приведены в табл. 1.

время (1 мин) этот бумажный диск извлекали из

конъюнктивального мешка, помещали на элек-

Видно, что с увеличением концентрации пре-

трод с нанесенной на него тест-системой и сни-

паратов заметно уменьшаются токи свинца, кад-

мали вольтамперограмму при тех же условиях, в

мия и кобальта. Токи цинка, меди и ртути изме-

которых получали фоновую вольтамперограмму.

няются менее существенно.

БИОФИЗИКА том 67

№ 4

2022

МЕТОД МУЛЬТИСЕНСОРНОЙ ИНВЕРСИОННОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ

821

Рис. 1. Инверсионные вольтамперограммы тест-системы с трусоптом в различной концентрации: 1 - тест-система,

2 - слезная жидкость здоровых людей, 3 - 10%, 4 - 12%, 5 - 25%, 6 - 30%.

Таким образом, метод мультисенсорной ин-

все перечисленные препараты через 6 ч после ин-

версионной вольтамперометрии может быть эф-

стилляции продолжают оказывать действие на

фективным при определении в тест-системе ис-

слезную жидкость. Что касается пилокарпина, то

следованных противоглаукомных препаратов.

из рис. 4а (кривая 2) следует, что через 6 ч после

инстилляции его действие на тест-систему осла-

Поведение исследуемых препаратов в слезной

бевает, в отличие от арутимола и трусопта

жидкости в зависимости от времени после их ин-

(рис. 4б,в).

стилляции. Влияние слезной жидкости на тест-

систему через 6 ч после инстилляции исследован-

Данные о влиянии слезной жидкости на тест-

ных противоглаукомных препаратов показано в

систему через 12 ч после инстилляции препаратов

табл. 3. Так, при воздействии как арутимола, так

приведены в табл. 4. Видно, что влияние препара-

и трусопта токи растворения металлов изменяют-

тов трусопта, дорзопта, азопта, арутимола и фо-

ся несущественно, откуда следует, что концен-

тила на тест-систему даже через 12 ч после ин-

трации арутимола и трусопта в слезной жидкости

стилляции все еще достаточно велико. Следова-

в течение 6 ч также не меняются. Следовательно,

тельно, препараты достаточно устойчивы во

Таблица 1. Исследованные противоглаукомные препараты

№

Препарат

Активное вещество

Арутимол

Тимолола гидромалеат

(Франция)

Тимолол

Тимолола малеат

(Московский эндокринный завод)

Трусопт

Дорзоламида гидрохлорид

(Франция)

Азопт

Бринзоламид

(Бельгия)

Дорзопт

Дорзоламида гидрохлорид

(Румыния)

Пилокарпин (Россия)

Пилокарпина гидрохлорид

Фотил

Пилокарпина гидрохлорид, тимолола малеат,

(Россия)

бензалкония хлорид

БИОФИЗИКА том 67

№ 4

2022

822

БАЛАШОВА и др.

Рис. 2. Инверсионные вольтамперограммы тест-системы с арутимолом в различной концентрации: 1 - тест-система, 2 -

слезная жидкость здоровых людей, 3 - 10%, 4 - 12%, 5 - 25%.

Рис. 3. Инверсионные вольтамперограммы тест-системы с пилокарпином в различной концентрации: 1 - тест-система,

2 - слезная жидкость здоровых людей, 3 - 10%, 4 - 12%, 5 - 25%.

времени и через 12 ч после инстилляции продол-

групп препаратов на тест-систему по сравнению с

жают оказывать действие на слезную жидкость и

другой группой препаратов нельзя, так как это

глазную поверхность.

требует дополнительных исследований. Действие

препарата фотил обусловлено, вероятно, наличи-

Как видно из табл. 3 и 4, разные группы препа-

ем двух активных компонентов - пилокарпина

ратов оказывают неодинаковое влияние на раз-

гидрохлорида и тимолола малеата.

ные металлы, входящие в состав тест-системы.

Например, препараты арутимол и тимолол ока-

зывают достаточно сильное влияние на такие ме-

ВЫВОДЫ

таллы как кобальт, медь и кадмий. Препараты

трусопт, дорзопт и азопт увеличивают пик тока

1. Метод мультисенсорной инверсионной

ртути, но уменьшают пики токов цинка. Поэтому

вольт-амперометрии позволяет анализировать в

говорить о более сильном влиянии одной из

формате

«Электронный язык» влияние

БИОФИЗИКА том 67

№ 4

2022

824

БАЛАШОВА и др.

Таблица 2. Влияние исследованных противоглаукомных препаратов на тест-систему

Пики токов растворения металлов, мкА

Препарат

Концентрация, %

Фон

Арутимол

Тимолол

Трусопт

Азопт

Дорзопт

Пилокарпин

Таблица 3. Влияние слезной жидкости

на тест-систему через 6 ч после

инстилляции исследованных

противоглаукомных препаратов

Пики токов растворения металлов, мкА

Слезная жидкость

Тест-система

58.0

40.0

80.8

Здоровые люди

34.6

50.4

23.2

74.6

Больные глаукомой после инстилляции

20.3

30.1

75.5

пилокарпина

Больные глаукомой после инстилляции

35.5

40.5

20.4

18.0

68.2

трусопта

Больные глаукомой после инстилляции

азопта

Больные глаукомой после инстилляции

дорзопта

Больные глаукомой после инстилляции

19.5

20.0

арутимола

БИОФИЗИКА том 67

№ 4

2022

МЕТОД МУЛЬТИСЕНСОРНОЙ ИНВЕРСИОННОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ

825

Таблица 4. Влияние слезной жидкости на тест-систему через 12 ч после инстилляции исследованных

противоглаукомных препаратов

Пики токов растворения металлов, мкА

Слезная жидкость

Тест-система

58.0

40.0

80.8

Здоровые люди

34.6

50.4

23.2

74.6

Больные глаукомой после инстилляции

20.3

30.1

75.5

пилокарпина

Больные глаукомой после инстилляции

трусопта

Больные глаукомой после инстилляции

фотила

Больные глаукомой после инстилляции

азопта

Больные глаукомой после инстилляции

дорзопта

Больные глаукомой после инстилляции

19.5

20.0

арутимола

исследованных противоглаукомных препаратов

2. В. Н. Андреев, В. М. Ганшин, А. Н. Доронин и

на слезную жидкость во времени.

В. П. Луковцев, Патент РФ № 2375705, опубл.

2. Показано, что влияние препаратов трусопта,

10.12.2009.

дорзопта, азопта, арутимола и фотила на тест-

3. В. П. Луковцев, А. Н. Доронин, В. А. Семенова и

систему даже через 12 ч после инстилляции все

В. М. Ганшин, Электрохимия, 45 (7), 869 (2009).

еще достаточно велико. Следовательно,

препараты достаточно устойчивы во времени и

4. Л. М. Балашова, В. А. Намиот, И. И. Колеcничен-

через

12 ч после инстилляции продолжают

ко и др., Биофизика, 65 (6), 1211 (2020).

оказывать действие на слезную жидкость и

глазную поверхность.

5. Л. М. Балашова, В. А. Намиот, И. И. Колеcничен-

3. Показано, что пилокарпин менее устойчив

ко и др., Биофизика, 67 (1), 134 (2022).

во времени и через 6 часов после инстилляции его

влияние на слезную жидкость уменьшается.

6. И. И. Колесниченко, Е. П. Кантаржи и А. Н. Доро-

нин, в сб. Труды 6-й Всероссийской науч.-практич.

конф. «Измерения в современном мире - 2017»

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

(СПбПУ, СПб., 2017), сс. 33-37.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

7. Л. М. Балашова, И. И. Колеcниченко и Е. П. Кан-

интересов.

таpжи, Клин. геpонтология, 23 (9-10), 6 (2017).

8. Л. М. Балашова, В. А. Намиот, И. И. Колеcничен-

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

ко и др., Биофизика, 63 (4), 825 (2018).

Все процедуры с участием пациентов соответ-

ствовали этическим стандартам Хельсинкской

9. И. И. Колеcниченко, Л. М. Балашова и Е. П. Кан-

декларации 1964 г. и ее последующим изменени-

таpжи, Клин. геpонтология, 23 (9-10), 36 (2017).

ям. От участников экспериментов получено

10. И. И. Колеcниченко, Л. М. Балашова и Л. С. Коро-

письменное информированное согласие на про-

бова, Биофизика, 66 (3), 577 (2021).

ведение исследования.

11. I. I. Kolesnichenko, L. M. Balachova, and E. P. Kan-

tarzhi, Am. J. Anal. Chem., 7 (7), 588 (2016).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. А.П. Нестеров, Глаукома (Медицинское ин-

12. Л. М. Балашова, И. И. Колеcниченко, В. А. На-

формационное агентство, М., 2014).

миот и др., Биофизика, 64 (6), 1088 (2019).

БИОФИЗИКА том 67

№ 4

2022