БИОФИЗИКА, 2022, том 67, № 5, с. 859-867

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.217.39

16S рРНК E. coli ЗНАЧИТЕЛЬНО СТИМУЛИРУЕТ ТРАНСЛЯЦИЮ

РЕПОРТЕРНОЙ мРНК В БЕСКЛЕТОЧНОЙ

ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЕ

*Институт белка РАН, Институтская ул., 4, Пущино Московской области, 142290, Россия

**Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,

Институтская ул., 3, Пущино Московской области, 142290, Россия

^#E-mail: zyrina.nv@gmail.com

Поступила в редакцию 01.07.2022 г.

После доработки 01.07.2022 г.

Принята к публикации 20.07.2022 г.

Методом мониторинга люминесценции в режиме реального времени обнаружен эффект суще-

ственной стимуляции трансляции репортерных мРНК в бесклеточной системе WGE (бесклеточная

эукариотическая система на основе экстракта зародышей пшеницы) при добавлении 16S рибосом-

ной РНК E. coli. Эффект стимуляции трансляции мРНК люциферазы оказался специфичным имен-

но для бесклеточной системы WGE и проявлялся вне зависимости от природы 5′-нетранслируемой

области репортерной мРНК. Определен класс нетранслируемой РНК, не оказывающий стимулиру-

ющего эффекта. На величину эффекта стимуляции трансляции репортерных мРНК в системе WGE

влияли концентрация и тип 5′-нетранслируемой области репортерной мРНК, а также момент вне-

сения 16S РНК в работающую систему. Изучение явления стимуляции трансляции позволит опти-

мизировать бесклеточную систему WGE для применения в методах с использованием репортерных

генов и решения различных научно-прикладных задач.

Ключевые слова: биолюминесценция, трансляция, бесклеточная система WGE

DOI: 10.31857/S0006302922050027, EDN: JIDBYR

количественно, измеряя люминесценцию непо-

Бесклеточные системы трансляции - одна из

средственно во время трансляции мРНК

фундаментальных технологий, которая открыва-

люциферазы в системе. Анализ крайне чувствите-

ет широкие возможности в области изучения ме-

лен, так как реакция имеет высокий квантовый

ханизмов биосинтеза белка, функциональной ге-

номики, скрининга и масштабного получения ак-

выход при отсутствующей фоновой люминесцен-

ции [7]. Так, в оптимальных условиях реакции

тивных белков, разработки лекарственных

можно обнаружить около 10 фг люциферазы [8].

препаратов, изучения метаболических путей и др.

[1-3]. Для решения различных задач с примене-

Проводя мониторинг синтеза люциферазы в

нием этих систем разработан ряд методов на ос-

бесклеточной эукариотической системе трансля-

нове репортерных мРНК. Одним из таких мето-

ции на основе экстракта зародышей пшеницы

дов является метод мониторинга синтеза фермен-

(система WGE) мы обнаружили неожиданный

та люциферазы светлячка (Photinus рyralis) в

эффект стимуляции трансляции репортерной

режиме реального времени в бесклеточных систе-

мРНК люциферазы при добавлении в систему не-

мах трансляции, впервые предложенный в нашей

транслируемой 16S рибосомной РНК E.coli. Це-

лаборатории для изучения механизмов биосинте-

лью настоящей работы было определение факто-

за белка [4]. В основе метода лежит катализ люци-

ров, влияющих на обнаруженный эффект.

феразой реакции окисления люциферина, сопро-

вождаемой излучением кванта света в области

МЕТОДЫ

540-600 нм [5, 6]. Окисляемый субстрат добавля-

ют непосредственно в реакционную смесь,

Плазмиды и получение матриц для транскрип-

активность синтеза люциферазы характеризуют ции. Плазмиды pTZ10OmegaLuc [9], pSP36Tβ-glo-

bin-Luc-GAPDH-A50 [10] и pCrPV-Fluc [11], со-

Сокращениe:5′-НТО - 5′-нетранслируемая область.

держащие кодирующую последовательность лю-

859

860

ЗЫРИНА, АГАЛАРОВ

Таблица 1. ДНК и репортерные мРНК

Способ

Плазмидный

Размер

мРНК

5′-НТО (лидеры)

инициации

вектор

транскрипта, п.о.

трансляции

pTZ10Omega-Luc-

5′UTR_Omega-Luc-

5′-НТО РНК ВТМ (омега-

Кэп- и eIF4F-

2049

TMV

3′UTR_TMV

лидер)

независимый

pSP36T-β-globin-

5′UTR_βGlobin-Luc-

5′-НТО мРНК белка -глобина

Кэп-зависимый

1866

Luc-GAPDH-A50

3′UTR_GAPDH-A50

лягушки Xenopus

IRES-

Межгенная последовательность

5′UTR_CrPV-Luc-

опосредованный

pCrPV-Fluc

геномной РНК вируса паралича

2089

3′UTR

A50

(кэп- и фактор

сверчка (CrPV IRES)

независимый)

циферазы светлячка (Photinus pyralis) и различные

ДНК (при A₂₆₀ нм), а также дополнительную

5'-НТО (табл. 1) нарабатывали в E. coli DH5α

оценку чистоты препарата (соотношение

(ThermoFisher Scientific, США) и выделяли с по-

A₂₆₀/A₂₈₀) определяли на спектрофотометре

мощью набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit

SmartSpec™ Plus (Bio-Rad).

(ThermoFisher Scientific, США).

Получение мРНК. Матричные РНК, кодирую-

Для дальнейшего использования в транскрип-

щие люциферазу светлячка (Photinus pyralis)

ции плазмиду pTZ10OmegaLuc расщепляли эндо-

5′UTR_Omega-Luc-3'UTR_TMV, и

5′UTR_CrPV-Luc-

нуклеазой рестрикции Bsp120I (Psp OMI) (Ther-

moFisher Scientific, США), плазмиду pSP36T-β-

3′UTR_A50, были получены транскрипцией соот-

globin-Luc-GAPDH-A50 - эндонуклеазой HpaI

ветствующих ДНК (см. табл. 1) с использованием

(ThermoFisher Scientific, США) в условиях, реко-

РНК-полимеразы фага T7 (NEB) в условиях, ре-

мендованных производителями. Плазмиду

комендованных производителем фермента, до-

pCrPV-Fluc использовали в качестве матрицы для

бавляя MgCl₂ до 22 мМ и 1 ед/мкл ингибитора

синтеза ДНК-фрагмента с 5'-НТО вируса парали-

РНКазы RiboLock™ (ThermoFisher Scientific,

ча сверчка CrPV в ПЦР (см. табл. 1). Праймеры

США). Концентрация каждого NTP составляла

для реакции - T7 (прямой) 5'CGCCGTAATAC-

4 мМ, линеаризованной плазмиды pTZ10Omega-

GACTCACTATAGGGAAAGCAAAAATGTGATC-

Luc или очищенного продукта ПЦР pCrPV-Fluc -

TTGCTTG, последовательность промотора Т7

0.02 мкг/мкл. Реакционную смесь инкубировали

РНК-полимеразы подчеркнута) и FLA50a (обрат-

в течение 2 ч, после этого сразу проводили депро-

ный)

5'(T)₄₈AACTTGTTTATTGCAGCTTAT)

теинизацию смесью фенол с pH 5.5 : хлороформ

были синтезированы Научно-производственной

(1 : 1) и ряд спиртовых осаждений с использова-

компанией

«Синтол» (Россия). Реакционную

нием насыщенного раствора хлорида лития

смесь объемом 100 мкл, содержащую 1.6 нг/мкл

(1/3 объема) 4 М NH₄OAc (1/2 объема) и 3 М

плазмиды,

0.3 мкМ каждого из праймеров,

NaOAc с рН 5.5 (1/10 объема). Для получения

0.025 ед/мкл Taq-полимеразы (Roche, Германия),

мРНК

5′UTR_cap-βGlobin-Luc-3′UTR_GAPDH-A50

0.2 мМ каждого из дНТФ, 2.5 мМ MgCl₂ и 1× бу-

проводили реакцию с РНК полимеразой фага SP6

фер High Fidelity Buffer (Roche, Германия), поме-

(ThermoFisher Scientific, США) в условиях, реко-

щали в амплификатор Biometra Personal Cycler

мендованных производителем фермента. Кон-

(Analytik Jena, Германия) и амплифицировали це-

центрации добавленных MgCl₂, и других компо-

левой ДНК-фрагмент в режиме: стартовая дена-

нентов реакции, а также время инкубации и

турация (1 мин), 3 цикла денатурации (15 сек,

очистка были такими же, как указано выше.

94°С), отжига (30 сек, 50°С) и элонгации (72°С,

Кэпирование полученной мРНК проводили с по-

2 мин), 29 циклов денатурации (15 сек, 94°С), от-

мощью набора ScriptCap™m7G Capping System

жига (30 сек, 65°С) и элонгации (72°С, 2 мин) и

(CellScript), после этого мРНК экстрагировали

финальная элонгация (7 мин).

смесью фенол: хлороформ 1 : 1 и очищали на ко-

После расщепления плазмидные ДНК или

лонке Illustra MicroSpin G50 (GE Healthcare) со-

продукт ПЦР очищали фенольной депротеиниза-

гласно рекомендациям производителя.

цией с последующим спиртовым осаждением.

Все этапы работы контролировали электрофоре-

Качество полученного препарата РНК анали-

зом в 1%-й агарозе в нативных условиях с визуа-

зировали в 1%-й агарозе в 0.5× TBE с визуализа-

лизацией бромистым этидием. Концентрацию

цией бромистым этидием, а также в 6% ПААГ с

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

16S рРНК E. coli ЗНАЧИТЕЛЬНО СТИМУЛИРУЕТ ТРАНСЛЯЦИЮ

861

7 М мочевиной и окрашиванием толуидиновым

по протоколу производителя. Приготовление

синим.

экстракта S-100 E. coli и трансляцию в бесклеточ-

Препараты РНК и ДНК. 16S и 23S рибосомные

ной системе на его основе 0.5 мкг/мкл мРНК лю-

РНК выделяли из препаратов 30S и 50S субчастиц

циферазы

5′UTR_SD-Luc-3′UTR_N64

(5′-НТО

рибосом E. сoli MRE600. К препаратам добавляли

Шайн-Дальгарно) проводили по ранее опубли-

двукратный объем деионизированной воды и

кованным протоколам [12, 13].

0.2%-й раствор SDS в объемном соотношении

Все компоненты системы, кроме мРНК, сме-

1 : 5 при интенсивном перемешивании. После

шивали при 4°С, предварительно инкубировали

этого проводили депротеинизацию РНК с ис-

при температуре реакции в течение 2 мин, затем

пользованием фенола с рН 5.5 на первой стадии.

добавляли мРНК, помещали микроцентрифуж-

Экстрагированную РНК осаждали из водной фа-

ную пробирку с реакционной смесью в термоста-

зы, добавляя 3М NaOAc и этанол, осадок раство-

тируемую ячейку 12-ячеечного роторного люми-

ряли в деионизированной воде и хранили при -

нометра Хемилюм-12 (Россия) и инкубировали в

20°C. При выделении 23S РНК не отделяли 5S

течение часа. Мониторинг синтеза люциферазы

РНК.

проводили, регистрируя интенсивность биолю-

В работе использовали тотальную нетрансли-

минесценции в непрерывном режиме в течение

руемую РНК (тРНК) E. сoli MRE600 40 мкг/мл

указанного времени с автоматическим выводом

(Roche, Германия), РНК фага MS2 0.8 мкг/мл

потока данных в виде кинетической кривой.

(Roche, Германия) и ДНК тимуса теленка, обра-

Каждое измерение проводили в трех повторно-

ботанную ультразвуком до фрагментов размером

стях.

200-6000 п.о., с конц. 500 мкг/мл (Cytiva). К

Обработка данных. Активность трансляции ре-

100 мкг каждого препарата добавляли MgCl₂ до

портерной мРНК оценивали по максимальной

10 мМ, переводили в буфер, содержащий 10 мМ

скорости синтеза люциферазы, которую опреде-

трис-HCl, 100 мМ KCl, 10 мМ MgCl₂ (pH 7.5) и

ляли как максимальное значение производной по

очищали на колонке NAP™5 (Amersham, Велико-

времени на участке от конца лаг-периода до нача-

британия) согласно рекомендациям производи-

ла выхода кривой на плато. Обработку и анализ

теля. РНК и ДНК осаждали добавлением 3М

данных проводили с использованием программ-

NaOAc и этанола, осадок растворяли в деионизи-

ного обеспечения OriginPro 8 SR0, результаты

рованной воде и хранили при -20°C.

представляли в виде среднего арифметического

Трансляция в бесклеточных системах с непре-

(Mean) и среднеквадратичного отклонения (SD).

рывным мониторингом синтеза люциферазы.

Трансляцию в бесклеточной системе на основе

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

экстракта зародышей пшеницы WGE проводили

в стационарном режиме при 25°С: 10 мкл реакци-

Эффект стимуляции трансляции репортерной

онной смеси содержали 1× буфер для трансляции

мРНК люциферазы в присутствии 16S РНК E. coli.

WGE (25 мМ HEPES-KOH (pH 8.0), 0.4 мМ GTP,

Проводя мониторинг синтеза люциферазы в бес-

1 мМ ATP, 0.1 мМ cпермидина, 0.05 мг/мл тоталь-

клеточной системе WGE, транслирующую не-

ной тРНК дрожжей, 1.5 мМ дитиотреитола),

большие количества (0.35-0.70 мкг/мкл) мРНК

0.2 мМ каждой аминокислоты (смесь), 1.5 мМ

люциферазы с омега-лидером вируса табачной

Mg(OAc)₂ (до 3 мМ с учетом магния экстракта

мозаики 5′UTR_Omega-Luc-3′UTR_TMV, мы обнару-

WGE), 0.02 мМ KOAc (до 65 мМ с учетом магния

жили любопытное явление: внесение в бескле-

экстракта WGE), 2% глицерина, 0.15 мМ сперми-

точную систему выделенной из экстракта зароды-

дина, 0.01 мМ NP40, 16 мМ креатинфосфата, 30%

шей пшеницы тотальной РНК значительно сти-

экстракта зародышей пшеницы, 0.1 мг/мл креат-

мулировало трансляцию (рис. 1а). Известно, что

инфосфокиназы (Boehringer Mannheim, Герма-

около 80% тотальной РНК WGE составляет рибо-

ния), 0.5 ед/мкл ингибитора РНКаз RiboLock™

сомная РНК. Мы решили проверить, будет ли ри-

(ThermoFisher Scientific, США). Для непрерывно-

босомная РНК из другого организма стимулиро-

го мониторинга синтеза люциферазы реакцион-

вать подобным образом трансляцию мРНК лю-

ная смесь содержала 0.10 мМ люциферина. Ко-

циферазы при внесении в таких же количествах,

нечные концентрации мРНК, а также добавлен-

что и в первоначальных экспериментах с тоталь-

ных

16S и других РНК указаны в разделе

ной РНК из WGE, т.е. в дипапзоне

0.38-

«Результаты». Экстракт зародышей пшеницы

2.25 мкг/мкл. Оказалось, что добавление

16S

(WGE) получали, как описано в работе [12].

РНК E. coli стимулировало синтез люциферазы в

Трансляцию мРНК люциферазы 5′UTR_Omega-

бесклеточной системе WGE так же существенно и

Luc-3′UTR_TMV проводили также в бесклеточной

не менее эффективно (рис. 1б), значительно уве-

системе на основе лизата ретикулоцитов кролика

личивая накопление активной люциферазы.

(RRL) с использованием набора Flexi Rabbit Re-

Максимальный стимулирующий эффект дости-

ticulocyte Lysate System (Promega, США) при 30°С

гался при добавлении 0.75 мкг/мкл 16S РНК, при

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

862

ЗЫРИНА, АГАЛАРОВ

Рис. 1. Присутствие тотальной РНК из WGE и 16S РНК E. coli стимулирует синтез люциферазы в бесклеточной

системе трансляции на основе экстракта зародышей пшеницы: (а) - эффект внесения тотальной РНК изWGE; (б) -

кинетические кривые накопления активной люциферазы при добавлении разных концентраций 16S РНК E. coli; (в) -

максимальная скорость синтеза люциферазы в присутствии разных концентраций 16S РНК. Звездочкой отмечен

максимальный эффект стимуляции, данные представлены в виде Mean ± SD. Трансляция мРНК люциферазы в

концентрации 0.70 мкг/мкл с омега-лидером 5′UTR_Omega-Luc-3′UTR_TMV.

этом максимальная скорость синтеза люцифера-

добавление 23S рРНК оказало стимулирующее

зы увеличивалась в 4.8 раз (рис. 1в). Дальнейшее

влияние на трансляцию репортерной мРНК, со-

увеличение концентрации 16S РНК приводило к

поставимое с 16S РНК (рис. 2а,в). Внесение РНК

снижению стимулирующего эффекта, и внесение

фага MS2 тоже стимулировало трансляцию ре-

16S РНК в концентрации 2.25 мкг/мкл стимули-

портерной мРНК, однако эффект был значитель-

ровало скорость синтеза белка лишь на

20%

но менее выражен (рис. 2б,в). Так, внесение РНК

(рис. 1в).

фага МS2 в максимальной стимулирующей кон-

центрации 0.75 мкг/мкл вызывало увеличение

Для того чтобы определить, обладают ли дру-

гие РНК способностью стимулировать синтез

скорости синтеза люциферазы на 70%. В то же

люциферазы, были проверены 23S рРНК и тРНК

время внесение 23S РНК, так же как и 16S РНК,

E. coli, так как РНК этих классов содержатся в то-

увеличивало максимальную скорость синтеза бо-

тальной РНК WGE. Кроме того, в качестве образ-

лее чем в четыре раза. Добавление тРНК и ДНК в

ца еще одного класса РНК (геномной) была взята

указанных концентрациях в реакционную смесь

РНК бактериофага MS2. Для проверки возмож-

не стимулировало трансляцию, а приводило к

ности ДНК стимулировать трансляцию синтез

увеличению времени лаг-периода и уменьшению

люциферазы провели также в присутствии ДНК

максимальной скорости синтеза люциферазы

тимуса теленка. Эти эксперименты показали, что

(данные не представлены).

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

16S рРНК E. coli ЗНАЧИТЕЛЬНО СТИМУЛИРУЕТ ТРАНСЛЯЦИЮ

863

Рис. 2. 23S РНК и РНК фага MS2 также стимулируют трансляцию. Трансляция мРНК люциферазы в концентрации

0.70 мкг/мкл с 5′UTR_Omega-Luc-3′UTR_TMV при добавлении: (а) - 23S рРНК E. coli; (б) - РНК фага MS2; (в) -

максимальная скорость синтеза люциферазы в отсутствие (черные столбики) и в присутствии разных концентраций

23S РНК и РНК фага MS2 (указаны в легенде), концентрация 16S РНК - 0.75 мкг/мкл.

Трансляция мРНК люциферазы с разными спо-

Эксперименты показали, что стимуляция

собами инициации. Напомним, что в эксперимен-

трансляции мРНК люциферазы в экстракте WGE

тах, описанных выше, эффект стимуляции был

происходила вне зависимости от природы ее

обнаружен при трансляции небольших количеств

5′-НТО (или способа инициации) (рис. 3). Одна-

ко величина эффекта зависела от 5′-НТО и кон-

некэпированной мРНК. На следующем этапе ра-

центрации репортерных мРНК. В случае транс-

боты необходимо было установить, как внесение

ляции «низкой» концентрации (0.35 мкг/мкл)

16S РНК будет влиять на трансляцию мРНК с

мРНК люциферазы с омега-лидером добавление

разными типами 5′-НТО и, следовательно, отли-

16S РНК вызывало такой же эффект стимуляции,

чающихся по способу инициации (см. табл. 1).

как описано выше (рис. 3б,в), с увеличением мак-

Для этого, кроме мРНК люциферазы с омега-ли-

симальной скорости синтеза люциферазы в

дером, в системе WGE транслировали мРНК с

8.6 раз. Иной эффект вызывало добавление 16S

классическим кэпированным лидером мРНК

РНК на трансляцию «средней» и «высокой» кон-

глобина, а также с 5′-НТО IRES (табл. 1). Эти

центрации - 1.04 и 1.74 мкг/мкл мРНК соответ-

мРНК транслировали в WGE в трех концентра-

ственно. Во-первых, стимулирующий эффект 16S

циях («низкой», «средней» и «высокой») и добав-

РНК был заметно слабее. Так, максимальная ско-

ляли 16S РНК до конечной концентрации 0.38-

рость синтеза белка при внесении 0.38 мкг/мкл

2.25 мкг/мкл в реакционной смеси.

16S РНК превышала всего лишь в 2.6 и 1.2 раза

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

864

ЗЫРИНА, АГАЛАРОВ

максимальную скорость синтеза белка, а даль-

нейшее увеличение концентрации 16S РНК за-

медляло скорость синтеза люциферазы в 2-5 раз

(рис. 3а). Кроме того, в WGE, транслирующей

1.74 мкг/мкл репортерной мРНК, максимальная

скорость синтеза начинала уменьшаться уже при

внесении 0.75 мкг/мкл 16S РНК.

Иным было влияние добавления 16S РНК на

трансляцию мРНК с кэпированным лидером

мРНК глобина (рис. 3б). Проявление ингибиру-

ющего влияния 2.25 мкг/мкл 16S РНК начина-

лось уже с малых концентраций (0.06 мкг/мкл)

мРНК. Стимулирующий эффект на трансляцию

мРНК с глобиновым лидером был менее выра-

женным по сравнению с мРНК с омега-лидером.

Так, максимальная скорость реакции увеличива-

лась в лучшем случае в 1.9 раза (см. 0.06 и

0.16 мкг/мкл мРНК и 0.38 мкг/мкл 16S РНК,

рис. 3б).

В отличие от предыдущих мРНК, трансляция

всех концентраций мРНК с 5′-НТО IRES стиму-

лировалась всеми концентрациями

16S РНК

(рис. 3б). Лишь внесение 2.25 мкг/мкл замедляло

скорость синтеза люциферазы на 10% при макси-

мальном количестве мРНК

3.55 мкг/мкл

(рис. 3в). Максимальное увеличение скорости

синтеза белка (в 3.3 раза) наблюдали также при

трансляции «низкой» концентрации 0.71 мкг/мкл

мРНК при добавлении 1.5 мкг/мкл 16S РНК в си-

стему WGE.

Таким образом, мы выявили, что добавление

16S РНК влияет по-разному на трансляцию ре-

портерной мРНК в зависимости от 5′-НТО и ее

концентрации в системе WGE. Однако эффект

стимуляции синтеза люциферазы не является

специфическим свойством мРНК с омега-лиде-

ром, а проявляется вне зависимости от природы

5′-НТО мРНК. Максимальный стимулирующий

эффект наблюдали при внесении 16S РНК в си-

стему WGE при трансляции небольших коли-

честв репортерных мРНК. Наибольший эффект

стимуляции внесение 16S РНК оказывало на

трансляцию некэпированной мРНК с омега-ли-

Рис. 3. Трансляция мРНК люциферазы c различными

дером.

5′НТО при внесении разных концентраций 16S РНК

E. coli. Максимальная скорость синтеза люциферазы:

Изменение хода кинетической кривой трансля-

(а)

- мРНК с омега-лидером

5′UTR_Omega-Luc-

ции при внесении 16S РНК на разных этапах рабо-

3′UTR_TMV; (б)

- мРНК с глобиновым лидером

ты системы. Для определения зависимости эф-

5′UTR_βGlobin-Luc-3′UTR_GAPDH-A50; (в) - мРНК с

CrPV IRES 5′UTR_CrPV-Luc-3′UTR_A50. Данные пред-

фекта стимуляции трансляции мРНК люцифера-

ставлены в виде Mean ± SD.

зы от момента внесения 16S рРНК в систему

WGE, мы добавляли 0.75 мкг/мкл 16S РНК на

разных этапах работы системы: перед лаг-перио-

«контрольную» (рис. 3а). Во-вторых, увеличение

дом, на линейном участке кинетической кривой,

16S РНК в системе WGE до 1.50 мкг/мкл или

а также на этапе начала выхода кинетической

практически не влияло, или сильно замедляло

кривой на плато (рис. 4). Лаг-период соответству-

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

16S рРНК E. coli ЗНАЧИТЕЛЬНО СТИМУЛИРУЕТ ТРАНСЛЯЦИЮ

865

Рис. 4. Изменение хода кинетической кривой трансляции при внесении 16S РНК. Трансляция 0.70 мкг/мкл мРНК

люциферазы 5′UTR_Omega-Luc-3′UTR_TMV и внесение 0.75 мкг/мкл 16S РНК E. coli в момент начала выхода

кинетической кривой на плато (а) и на линейном участке кинетической кривой (стрелка) (б). Кривая с кружками -

16S РНК добавлена в начале реакции, пунктирная кривая - 16S РНК добавлена на определенном этапе реакции,

сплошная кривая - контроль, добавлена деионизированная вода.

ет так называемому времени пробега (transit

ская кривая контрольной реакции после продол-

time), в течение которого происходит инициация

жала свой ход как обычно, со скоростью 46-

трансляции и синтез полноразмерной люцифера-

48 усл. ед./с, после чего происходило замедление

зы, линейный участок кинетической кривой со-

и выход на плато. Временной интервал между до-

бавлением 16S РНК и скачком люминесценции

ответствует максимальной синтетической актив-

приблизительно соответствует времени пробега,

ности трансляционного аппарата, а начало выхо-

что позволило сделать вывод о стимуляции транс-

да кинетической кривой на плато соответствует

ляции на стадии инициации, тем самым исклю-

замедлению процессов синтеза люциферазы при

чив влияние на процесс элонгации.

условии избытка субстратов реакции и отсут-

Влияние 16S РНК на синтез люциферазы в дру-

ствии процессов деградации/агрегации фер-

гих бесклеточных системах трансляции. Для ответа

мента.

на вопрос, универсально ли обнаруженное влия-

Анализ изменения хода кинетических кривых

ние 16S РНК на синтез люциферазы во всех бес-

клеточных системах трансляции или же является

синтеза позволил выявить, что добавление 16S

специфическим свойством системы WGE, была

рРНК на всех этапах работы системы WGE вызы-

вало стимуляцию трансляции (рис. 4, пунктир-

проведена трансляция соответствующих репор-

терных мРНК в системах, полученных из клеток

ные кривые). Однако максимальный эффект на-

бактериий (E. coli) и млекопитающих (ретикуло-

блюдали при добавлении 16S РНК в момент нача-

цитов кролика). Оказалось что внесение 16S РНК

ла реакции (рис.

4а,б, кривые со светлыми

в диапазоне 0.38-2.25 мкг/мкл в обе эти бескле-

кружками). Добавление 16S рРНК в реакцию при

точные системы подавляло трансляцию репор-

начинающемся выходе кинетической кривой на

терных мРНК пропорционально внесенному ко-

плато проявлялось лишь в незначительном уве-

личеству (данные не представлены). Эффект сти-

личении люминесценции (рис. 4а). Внесение 16S

муляции трансляции репортерных мРНК

РНК на линейном участке кинетической кривой

оказался специфичным именно для бесклеточ-

влияло на ход синтеза люциферазы иначе (рис 4б,

ной системы WGE.

пунктирная кривая). Оказалось, что сначала ре-

акция в течение 6-7 мин продолжала идти в ли-

Таким образом, метод мониторинга люминес-

нейном режиме с такой же с максимальной ско-

ценции синтеза люциферазы в режиме реального

ростью (46 усл. ед./с), как до внесения 16S рРНК.

времени позволил обнаружить эффект суще-

После этого происходил скачок люминесценции

ственной стимуляции трансляции репортерной

и реакция снова продолжала идти в линейном ре-

мРНК в бесклеточной эукариотической системе

жиме в течение 13 мин с большей максимальной

WGE при добавлении 16S РНК E. coli. Определен

скоростью (59 усл. ед.). В то же время кинетиче-

класс нетранслируемой РНК (тРНК), не оказы-

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

866

ЗЫРИНА, АГАЛАРОВ

вающий стимулирующего эффекта. В данной ра-

БЛАГОДАРНОСТИ

боте удалось определить ряд факторов, влияющих

Авторы благодарят зав. лабораторией механиз-

на эффект стимуляции трансляции репортерных

мов биосинтеза белка Института белка РАН

мРНК в системе WGE: количество добавляемой

В.А. Колба за поддержку, постоянный интерес к

16S РНК, концентрация и тип 5′-НТО репортер-

работе и обсуждение результатов, а также со-

ной мРНК, а также момент внесения 16S рРНК в

трудников лаборатории: К.С. Василенко - за

работающую систему WGE. Максимальный сти-

предоставление плазмиды pTZ10OmegaLuc,

мулирующий эффект оказывало добавление 16S

А.А. Коммера и И.Г. Дашкову - за предоставле-

РНК при трансляции малых концентраций ре-

ние 30S и 50S субчастиц рибосом E. coli, экстракта

портерных мРНК вне зависимости от природы

S-100 E. coli и мРНК люциферазы 5′UTR_SD-Luc-

5′-НТО. Резкий подъем люминесценции, наблю-

3′UTR_N64.

даемый через промежуток времени, соответству-

ющий времени пробега, позволяет утверждать о

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

влиянии добавленной 16S РНК на стадию иници-

ации трансляции. Интересно, что среди проте-

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

стированных нами бесклеточных систем трансля-

интересов.

ции, эффект стимуляции трансляции репортер-

ных мРНК наблюдался только в системе WGE.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ НОРМ

В системе из зародышей пшеницы эффекты

Данная работа не содержит описания каких-

ускорения синтеза белка были показаны и ранее

либо исследований с участием людей или живот-

[9, 14]. Однако в работе [9] авторами подробно

ных в качестве объектов.

был изучен эффект «разгона белкового синтеза»,

происходящий только при высоких концентра-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

циях некэпированной мРНК, транслирующейся

N. E. Gregorio, M. Z. Levine, and J. P. Oza, Methods

в системе. В работе [14] было описано явление

Protoc., 2 (1), 24 (2019).

взаимной стимуляции трансляции «в одной про-

Y. Endo, Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci., 97

бирке» двух разных транслируемых матриц. В от-

(5), 261 (2021).

личие от этой работы, в рамках нашего исследо-

M. L. Fogeron, L. Lecoq, L. Cole, et al., Front. Mol.

вания показано, что рибосомная РНК, которая

Biosci., 8, 639587 (2021).

считается нетранслируемой, значительно стиму-

V. A. Kolb, E. V. Makeyev, and A. S. Spirin, EMBO J.,

лирует трансляцию мРНК с 5′-НТО различной

13 (15), 3631 (1994).

природы. Иными словами, обнаружено явное

J. W. Hastings, and C. H. Johnson, in Methods in Enzy-

влияние нетранслируемой РНК на трансляцию

mology, Ed. by G. Marriott and I. Parker (Acad. Press,

репортерной мРНК. Ранее небольшой эффект

2003), V. 360, pp. 75-104.

добавления нетранслируемой РНК (некэпиро-

S. M. Marques and J. C. Esteves da Silva, IUBMB Life,

ванная РНК с глобиновым лидером) был показан

61 (1), 6 (2009).

в работе [15].

K. V. Wood, Promega Notes, 28 (1990).

Обнаруженные факты позволяют предпола-

K. V. Wood, Y. A. Lam, and W. D. McElroy, J. Biolu-

гать, что в основе возможного механизма эффек-

min. Chemilumin., 4 (1), 289 (1989).

та стимуляции синтеза люциферазы при добавле-

O. M. Alekhina, K. S. Vassilenko, and A. S. Spirin, Nu-

нии 16S РНК может лежать следующее. Предпо-

cleic Acids Res. 35 (19), 6547 (2007).

ложительно, в экстракте зародышей пшеницы

10.

D. N. Lyabin, I. A. Eliseeva, L. P. Ovchinnikov, PLoS

содержатся неспецифичные РНК-связывающие

One, 7 (12), e52527 (2012).

белки, ингибирующие трансляцию. Находясь в

11.

I. V. Prokhorova, K. A. Akulich, D. S Makeeva, et al.,

системе, 16S РНК как бы «вытитровывает» эти

Sci. Rep., 6, 27720 (2016).

белки и тем самым снимает ингибирование и сти-

12.

V. A. Shirokov, A. Kommer, V. A. Kolb, et al., in Meth-

мулирует трансляцию [14]. Для выяснения моле-

ods Mol. Biol., Ed. by G. Grandi (Humana Press Inc.,

кулярного механизма эффекта стимуляции

Totowa, New Jersey, 2007), V. 375, pp. 19-55.

трансляции репортерных мРНК в бесклеточной

13.

L.M. Gold and M. Schweiger, in Methods in Enzymolo-

системе WGE в присутствии 16S РНК необходи-

gy, Ed. by K. Moldave and L. Grossman (Acad. Press,

мы дальнейшие исследования. Понимание этого

1971) 20, pp. 537-542.

механизма позволит оптимизировать бесклеточ-

14.

Е. А. Согорин и С. Ч. Агаларов, Молекуляр.

ную систему WGE для применения в методах с

биология, 52 (1), 19 (2018).

использованием репортерных мРНК, а также ре-

15.

E. A. Sogorin, S. C. Agalarov, and A. S. Spirin, Sci.

шения различных научно-прикладных задач.

Rep., 6, 24518 (2016).

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022