БИОФИЗИКА, 2022, том 67, № 5, с. 991-1001

БИОФИЗИКА CЛОЖНЫX CИCТЕМ

УДК 577.3

ВЛИЯНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДЕЙСТВИЯ НЕЙТРОННОГО

И ПРОТОННОГО ИЗЛУЧЕНИЙ НА ОПУХОЛЕВЫЙ ОТВЕТ СОЛИДНОЙ

КАРЦИНОМЫ ЭРЛИХА И РЕАКЦИИ КОЖИ У МЫШЕЙ

В РАННИЕ И ОТДАЛЕННЫЕ СРОКИ

А.Е. Шемяков*^, **, А.В. Смирнов**

*Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,

Институтская ул., 3, Пущино Московской области, 142290, Россия

^#E-mail: rozanova.iteb@gmail.com

**Физико-технический центр Физического института им. П.Н. Лебедева,

Академический пр., 2/110, Протвино, Московская область, 142281, Россия

^##E-mail: belyakovata@lebedev.ru

Поступила в редакцию 15.07.2022 г.

После доработки 15.07.2022 г.

Принята к публикации 22.07.2022 г.

Изучено влияние последовательности действия протонного излучения в суммарной дозе 80 Гр и

нейтронного в дозе 5 Гр при сочетанном облучении солидной формы асцитной карциномы Эрлиха

на опухолевый ответ и лучевые реакции кожи у мышей-опухоленосителей в ранние и отдаленные

сроки. Обнаружено, что облучение мышей нейтронами как до, так и после облучения протонами

эффективно подавляло рост солидной асцитной карциномы Эрлиха в течение месяца после воздей-

ствия. По частоте и тяжести лучевых поражений кожи, наблюдаемых у мышей через 15-40 суток по-

сле терапии, облучение нейтронами после облучения протонами приводило к значительному улуч-

шению этих показателей по сравнению с действием только пучка протонов, однако облучение ней-

тронами до протонов оказалось более повреждающим, чем в других вариантах. Показано также, что

частота рецидивирования опухолей в группах животных при комбинированном облучении значи-

тельно выше, а общая продолжительность жизни ниже по сравнению с группой мышей, облучен-

ных только протонным излучением.

Ключевые слова: нейтроны, протоны, асцитная карцинома Эрлиха, лучевые реакции кожи, рецидивы,

мыши.

DOI: 10.31857/S0006302922050180, EDN: JKCJQG

страненных, так и редких видов онкологических

В последнее десятилетие во всем мире интен-

заболеваний; применение протонной терапии

сивно развиваются центры лучевой терапии,

оказалось особенно эффективным при терапии

оснащенные установками для протонной тера-

пии опухолей, которая является перспективным

опухолей головного мозга и в педиатрии [1, 2]. В

методом лечения многих видов онкологических

протонной терапии используется основное пре-

заболеваний. Протонная терапия особенно под-

имущество протонов, а именно специфическое

ходит в тех случаях, когда альтернативные методы

распределение поглощенной дозы: относительно

терапии не обеспечивают адекватного терапевти-

низкая энергия частиц на входе в биологическую

ческого эффекта, а традиционная лучевая тера-

ткань; наличие пика Брэгга, т.е. максимального

пия представляет высокий риск для пациента. На

энерговыделения в конце пробега частицы на за-

сегодняшний день более 250 тыс. пациентов по-

ранее заданной глубине непосредственно в опу-

лучили протонную терапию, которая с успехом

холи; резкое падение энергии до нуля после пика,

применяется для лечения как наиболее распро-

которое позволяет не повреждать окружающие

здоровые ткани [3]. В медицинских центрах при-

Сокращения: ОБЭ - относительная биологическая эффек- меняют два основных способа формирования до-

тивность, ОСК - опухолевые стволовые клетки, ЛПЭ - зовых полей для равномерного облучения всего

линейная потеря энергии, ТСПП - тонкий сканирующий

пучок протонов, АКЭ - асцитная карцинома Эрлиха,

объема мишени при протонной терапии опухо-

СПЖ - средняя продолжительность жизни.

лей: метод пассивного рассеяния и метод скани-

991

992

РОЗАНОВА и др.

рования карандашным пучком, при которых

фективно снижало популяцию ОСК-подобных

формируется модифицированная кривая Брэгга.

клеток карциномы легкого, а экспрессия генов,

Технология сканирования карандашным пучком

участвующих в гибели клеток, возрастала в десять

позволяет проводить максимально эффективную

раз [17].

протонную терапию с модулированной интен-

В ряде исследований показана высокая эф-

сивностью, за счет снижения дозовой нагрузки на

фективность нейтронов при лечении радиорези-

здоровые ткани, чего трудно достичь при пассив-

стентных и достаточно распространенных опухо-

ном рассеянии; кроме того, не требует подготов-

лей молочной железы, легкого, гортани, метаста-

ки специальных компенсаторов и коллиматоров

зов плоскоклеточного рака, опухолей слюнных

для конкретного пациента, что сокращает сроки

желез, различных видов сарком [18, 19]. Особен-

и стоимость лечения [4].

ностью биологического действия нейтронов яв-

Известно, что коэффициент относительной

ляется практически полное отсутствие зависимо-

сти развития повреждающего эффекта от насы-

биологической эффективности (ОБЭ) для прото-

щения клеток кислородом и фаз клеточного

нов, характеризующий степень воздействия излу-

цикла, а также индуцирование нерепарируемых

чения на биологические структуры относительно

двунитевых разрывов ДНК, приводящих к гибели

гамма- или рентгеновского излучения, невысок,

и согласно рекомендациям Международной ко-

опухолевых клеток, в том числе и ОСК, в отличие

от действия гамма-излучения [20, 21]. В исследо-

миссии по радиационным единицам составляет

ваниях на культурах клеток и на различных видах

1.1 при расчете доз протонной терапии в клиниче-

животных установлено, что в зависимости от

ских условиях [5-7]. Для дальнейшего расшире-

энергии частиц, дозы и радиочувствительности

ния и совершенствования протонной терапии в

последние годы были разработаны подходы и ме-

объекта ОБЭ нейтронов находится в диапазоне

1.2-8.0 [22]. Исследования клоногенной актив-

тодики с целью усиления эффекта протонного

ности клеток мышиной меланомы В-16 показали,

излучения с использованием FLASH-терапии [8],

что предварительное нейтронное облучение мо-

наноэнхансеров [9], схем гипофракционирова-

жет усиливать действие фотонного облучения как

ния [10, 11], а также в сочетании с другими видами

облучения и гипертермией [12]. Эти направления

аддитивно, так и синергетически, причем эффект

зависит от соотношения дозы нейтронов и сум-

в исследованиях обусловлены не только стремле-

марной дозы [23]. Обнаружено, что одновремен-

нием увеличить ОБЭ протонов и, следовательно,

ное воздействие нейтронов с энергией 14 МэВ и

эффективность лучевой терапии, но и сменой на-

γ-излучения приводит к синергетическому био-

учных парадигм о происхождении и развитии он-

кологических заболеваний, а также о причинах

логическому действию при вкладе нейтронов в

суммарную поглощенную дозу 15% или макси-

возникновения их рецидивов [13]. В последние

мум 30% и его снижению до аддитивного при

годы сформировалось представление о сложном

вкладе нейтронов 45%. В экспериментах на мы-

клеточном строении злокачественных образова-

шах с использованием 30-суточной выживаемо-

ний и присутствия в них опухолевых стволовых

клеток (ОСК), которые обладают способностью

сти ОБЭ импульсного и непрерывного γ-ней-

тронного излучений была определена в пределах

не только формировать опухоль и поддерживать

1.9-3.0 и зависела от режима воздействия и рас-

ее рост, но и имеют более высокую резистент-

стояния между активными зонами реактора и

ность к действию редкоионизирующих излуче-

платформы с мышами [24]. Современные тенден-

ний по сравнению с другими клетками опухоли

[14]. Многие факты также указывают на то, что

ции использования быстрых нейтронов в лучевой

терапии заключаются в замене их самостоятель-

именно ОСК отвечают не только за радиорези-

ного применения на схемы сочетанного гамма-

стентность таких агрессивных опухолей головно-

нейтронного воздействия, в которых вклад ней-

го мозга как мультиформная глиобластома, но и

тронов в суммарную очаговую дозу колеблется от

за возникновение рецидивов после радиотерапии

других видов онкологических заболеваний [9].

20 до 40% [25].

Показано, что излучения с высокими значениями

В предыдущих исследованиях нами при экс-

линейной потери энергии (ЛПЭ), так называе-

тремальном гипофракционированном облучении

мые плотноионизирующие, к которым относятся

тонким сканирующим пучком протонов (ТСПП)

протоны, ионы углерода и нейтроны, способны

солидной формы асцитной карциномы Эрлиха

преодолеть радиорезистентность ОСК за счет ин-

(АКЭ) в дозах 30+30 Гр [10] и 40+40 Гр [11] была

дукции в них нерепарируемых повреждений ДНК

показана эффективность воздействия на рост

[15, 16], что делает лечение злокачественных но-

первичных опухолей, продолжительность перио-

вообразований эффективным не только за счет

да ремиссии, частоту рецидивов и среднюю про-

подавления роста опухоли, но и снижения часто-

должительность жизни (СПЖ) мышей [26]. С

ты рецидивирования. Также установлено, что об-

учетом полученных результатов было высказано

лучение протонами с энергией 3 МэВ в дозах, эк-

предположение, что появление вторичных опухо-

вивалентных дозам гамма-излучения, более эф-

лей происходит за счет сохранения единичных

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

ВЛИЯНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДЕЙСТВИЯ ИЗЛУЧЕНИЙ

993

наиболее радиоустойчивых опухолевых клеток,

В эксперименте использовалось сочетанное с

скорее всего ОСК. Поскольку имеются суще-

нейтронами гипофракционированное облучение

ственные доказательства, свидетельствующие о

опухолей тонким сканирующим пучком прото-

вкладе ОСК в формирование вторичных солид-

нов двумя фракциями по 40 Гр с интервалом 24 ч.

ных злокачественных новообразований на более

Данный режим протонного облучения был вы-

поздних сроках в месте расположения первичной

бран на основе наших предыдущих результатов

опухоли, а также в других местах [27], то для по-

[11], где была показана полная регрессия первич-

вышения эффективности протонной терапии не-

ных опухолевых узлов у всех мышей, двукратное

обходимо усилить воздействия на ОСК и снизить

снижение частоты рецидивов и увеличение

частоту рецидивирования.

средней продолжительности жизни на 35% у мы-

шей с облученной АКЭ, по схеме 40 + 40 Гр, в от-

Целью настоящей работы было исследование

личие от фракционированного облучения в дозах

влияния последовательности действия протон-

30 + 30 Гр. Доза облучения нейтронами 5 Гр была

ного излучения в суммарной дозе 80 Гр и ней-

выбрана с учетом величины ОБЭ непрерывных

тронного в дозе 5 Гр при сочетанном облучении

нейтронов с энергией 14 МэВ, равной 2.4-2.6, ко-

солидной формы АКЭ на опухолевый ответ и лу-

торая была определена на клетках мышиной ме-

чевые реакции кожи у мышей-опухоленосителей.

ланомы В-16 [30] и расчета доли нейтронов в сум-

марной дозе облучения около 15% для получения

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

синергетического или аддитивного эффекта.

Эксперименты проводили на белых беспород-

Опухоль у мышей в первой группе облучали

ных мышах-самцах линии SHK в возрасте 8-9 не-

только двумя фракциями ТСПП («протоны»), во

дель массой 24-28 г. Мыши содержались в вива-

второй группе предварительно за 3 ч до первой

рии ИТЭБ РАН в стандартных условиях и имели

фракции ТСПП мышей с АКЭ облучали нейтро-

свободный доступ к сухому корму и воде [28].

нами в дозе 5 Гр («нейтроны+протоны»), третью

Мышей контрольной и опытных групп содержа-

группу облучали нейтронами в дозе 5 Гр через 3 ч

ли в одинаковых условиях на протяжении всего

после второй фракции ТСПП («протоны+ней-

эксперимента. Было использовано 120 мышей, по

троны»), а в четвертой группе опухоль однократ-

15-30 особей в каждой группе.

но облучали нейтронами в дозе 5 Гр («нейтро-

ны»). Пятая (контрольная) группа включала

В качестве модели опухоли была выбрана со-

необлученных мышей с опухолями, подвергав-

лидная форма АКЭ [29]. Линия опухолевых кле-

шихся транспортировке к источникам излуче-

ток получена в РНЦ им. Н.Н. Блохина (Москва,

ний, анестезии и имитации условий облучения.

Россия). Клетки АКЭ поддерживали in vivo в фор-

ме асцита у мышей SHK путем серийной внутри-

В качестве источника протонного излучения

брюшинной инокуляции с интервалом 7-9 суток.

использовали комплекс протонной терапии

У животных в асептических условиях извлекали

«Прометеус»

(Физико-технический

центр

асцитную жидкость и трижды промывали фос-

ФИАН, Протвино, Московская обл.) [31]. Перед

фатно-солевым буфером с помощью центрифу-

облучением мышь фиксировали пластиковыми

гирования при 500 об/мин в течение 5 мин. Клет-

зажимами на платформе из полипропилена та-

ки АКЭ после центрифугирования тестировали

ким образом, чтобы облучаемая конечность была

на жизнеспособность с помощью красителя три-

максимально удалена от тела. Платформу на-

панового синего. Количество клеток подсчиты-

клонно погружали в водный фантом и получали

вали с помощью камеры Горяева и суспендирова-

томограмму с помощью компьютерного томогра-

ли в физиологическом растворе в конечной кон-

фа с коническим пучком, интегрированного в

центрации

20·10⁶ клеток/мл. Для индукции

ускоритель. Для каждой мыши был определен

солидной АКЭ мышам внутримышечно вводили

размер опухоли и рассчитан средний фактиче-

ский объем облучения, который равнялся

2·10⁶ клеток в бедро левой задней лапы. При та-

кой имплантации опухолевых клеток частота ин-

0.47 см³. Этот объем был выбран на основе наших

дукции АКЭ у мышей через 5 суток составляла

предыдущих работ, где была показана более вы-

100%, и животные гибли через 47 ± 5 суток.

сокая противоопухолевая эффективность и зна-

чительное увеличение СПЖ мышей при облуче-

Первое локальное облучение опухолей у мы-

нии ТСПП именно пальпируемого объема ткани

шей пучком протонов в пике Брэгга или нейтро-

по сравнению с облучением большего по класси-

нами проводили на пятые сутки после инокуля-

фикации МКРЕ-62, так называемого планируе-

ции АКЭ, когда опухолевый узел пальпировался у

мого объема [10, 26, 32].

всех животных. Перед каждым облучением мы-

шей анестезировали внутрибрюшинной инъек-

Расчет дозы в заданном объеме проводили в

цией селективных препаратов ксилазина (Inter-

программе планирования облучения, основан-

chemie, Нидерланды) в дозировке 0.7 мг/кг и зо-

ной на методе Монте-Карло с итеративной дина-

летила 100 (Virbac, Франция) - 3.4 мг/кг.

мической оптимизацией по соотношению

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

994

РОЗАНОВА и др.

Рис. 1. Положение мыши в водном фантоме во время облучения тонким сканирующим пучком протонов.

min/max дозы, которая позволяет получить рав-

ко пальпируемого объема опухоли, поэтому была

номерное распределение дозы. Верификацию по-

облучена вся левая лапа с опухолью. Мощность

ложения каждой мыши при облучении произво-

дозы нейтронов на выходе составила 41·10^-4 Гр/с.

дили с помощью лазерной системы позициони-

Мониторинг непрерывного потока нейтронов

рования и съемки проекций с совмещением

осуществлялся с помощью «Измерителя ней-

текущего положения мишени с исходным с точ-

тронного потока автоматизированного» (ИНПА,

ностью 1 мм (рис. 1). Облучение заданного объе-

разработки ВНИИА им. Н.Л. Духова, Москва).

ма проводили с двух полей ТСПП, энергия про-

Погрешность определения поглощенной дозы

тонов на выходе с направления 0° оставляла 98-

составляла 12-15%.

104 МэВ, с направления 180° - 96-100 МэВ, сиг-

ма пучка на входе в водный фантом составляла

За мышами наблюдали ежедневно на протяже-

2.8-3.6 мм. Среднее значение ЛПЭ, рассчитан-

нии всей их жизни, для выявления опухолевого

ное по программе планирования, в модифициро-

ответа определяли динамику роста АКЭ, реги-

ванном пике было равно 2.5 ± 0.5 кэВ/мкм. Облу-

стрировали продолжительность ремиссии, часто-

чение проходило в импульсном режиме с дли-

ту рецидивов опухолей и СПЖ мышей с рециди-

тельностью импульса 200 мс и цикличностью

вами и полностью «вылеченных». Животных в

1 импульс в 2 с. Контрольное облучение водного

терминальном состоянии подвергали эвтаназии,

фантома осуществляли с установленными в нем

считая этот день датой гибели.

дозиметрами. Дозиметрию протонного облуче-

Динамику роста АКЭ определяли по объему

ния проводили с помощью алмазного детектора

опухоли дважды в неделю в течение месяца. Для

(ИФТП, Россия) и пленки радиационного кон-

вычисления объема опухоли у каждой мыши из-

троля Gafchromic EBT2 (США). Погрешность

меряли три ортогональных диаметра, и объем

определения поглощенной дозы протонов соста-

вила около 5%.

Источником нейтронов служил портативный

нейтронный генератор непрерывного действия

НГ-14 (МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиал НМИРЦ

Минздрава России, Обнинск, Калужская обл.).

Принцип работы генератора заключается в уско-

рении до энергии 100-300 кэВ ионов дейтерия на

тритиевую мишень. В результате реакции

³H(d,n)⁴He образуются нейтроны с энергией

~14 МэВ и потоком нейтронов ~10¹⁰ н/с [33]. Мы-

шей, разделенных на подгруппы по пять живот-

ных в каждой, облучали нейтронами на полиме-

тилметакрилатной платформе. Для локального

облучения АКЭ левые задние лапы мышей

фиксировали в центре платформы на расстоянии

5-6 см от мишени генератора таким образом,

чтобы бедро мыши находилось в поле облучения

(рис. 2). Технические параметры установки не

Рис. 2. Положение мышей во время облучения нейтро-

позволяли проводить локальное облучение толь-

нами на нейтронном генераторе НГ-14.

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

ВЛИЯНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДЕЙСТВИЯ ИЗЛУЧЕНИЙ

995

препараты», Россия) и линиментами или мазями

оксикортом (Тархоминские фармацевтические

заводы Польфа, Польша) и флуцинаром (Jelfa SA,

Польша).

Статистическую оценку различий между груп-

пами, имеющими нормальное распределение,

проводили с помощью критерия Стьюдента; в

остальных случаях использовали непараметриче-

ский U-критерий Манна-Уитни. Показатели вы-

живаемости мышей сравнивали с помощью непа-

раметрических критериев: критерия Гехана-

Вилкоксона для оценки продолжительности жиз-

ни погибших от облучения животных и логранго-

вого критерия для сравнения 30-суточной выжи-

ваемости. Различия считали статистически зна-

чимыми при p ≤ 0.05.

Рис. 3. Динамика роста АКЭ у мышей после облучения

пучком протонов 40 + 40 Гр и их сочетанного воздей-

ствия с нейтронами в дозе 5 Гр. Данные представлены

РЕЗУЛЬТАТЫ

как среднее значение ± SD, p ≤ 0.01по сравнению с кон-

тролем.

На рис. 3 представлены кривые роста АКЭ у

мышей после облучения нейтронами и протона-

ми в разной последовательности. Во всех группах

опухоли в см³ рассчитывали по следующей фор-

как при сочетанном, так и только при протонном

муле [34]:

облучении у всех мышей наблюдалась регрессия

V = π/6·d1·d2·d3,

первичного опухолевого узла через неделю после

облучения и отсутствие вторичного роста опухо-

где d1-d3 - три ортогональных диаметра. Для

ли в течение месяца.

оценки острых кожных реакций после облучения

В группе мышей с АКЭ, облученной только

опухоли, локализованной на бедре левой задней

лапы мыши, использовали шкалу оценки радиа-

нейтронами, у всех животных наблюдался рост

опухоли, но скорость роста по сравнению с необ-

ционной токсичности RTOG/EORTC [35]. За

лученным контролем была значительно ниже.

мышами ежедневно наблюдали с первых по соро-

Время задержки роста опухоли [36], которое вы-

ковые сутки после облучения и оценивали общее

числялось как разница между средним временем

количество животных с кожными реакциями, тип

роста опухоли (время, необходимое для того, что-

и степень повреждений и продолжительность за-

бы опухоль стала в пять раз больше по отноше-

живления. После максимального проявления ре-

нию к исходному объему) в группе нейтронного

акций у мышей повреждения кожи купировали с

облучения и необлученного контроля, составило

помощью консервативной терапии 15% раство-

ром диметилсульфоксида (ОАО «Татхимфарм-

15 суток, затем опухоли увеличивались с одинако-

вой скоростью. На рис. 4 представлена динамика

гибели мышей с АКЭ в группе, облученной ней-

тронами, по сравнению с необлученными мыша-

ми-опухоленосителями. Задержка роста опухо-

лей после нейтронного облучения увеличила

максимальную продолжительность жизни мы-

шей с опухолями до 77 суток по сравнению с кон-

тролем, где она равна 54 суткам, а СПЖ живот-

ных облученной группы увеличилось на 15 суток

(рис. 4).

Одновременно у мышей оценивали тяжесть и

течение острых лучевых поражений кожи в обла-

сти облучения. В связи с тем, что пальпируемый

объем опухоли был соизмерим с размером лапы

животного, и опухолевый узел примыкал к кож-

ным покровам, то при облучении кожа получала

значительную дозу. Время латентного периода

развития повреждений кожи в группе нейтроны

Рис. 4. Динамика гибели мышей-опухоленосителей по-

сле облучения нейтронами в дозе 5 Гр по сравнению с

составило 16 суток, кожные поражения наблюда-

контрольной группой (* - p ≤ 0.05).

лись у 50% мышей и достигали максимальной

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

996

РОЗАНОВА и др.

Таблица 1. Ранние лучевые реакции кожи у мышей после облучения АКЭ нейтронами и протонами по

классификации RTOG/EORTC-95

Развитие лучевых реакций, %

Лучевые реакции

нейтроны

протоны

нейтроны + протоны

протоны + нейтроны

0 - нет проявлений

50%

1 - умеренная эритема, эпиляция,

10%

28.6%

сухой эпидермит

2 - яркая эритема, островковый

4.2%

влажный эпидермит, умеренный отек

3 - сливной влажный эпидермит, отек с

50%

12.5%

57.1%

вдавлением

4 - язва, кровотечение, некроз,

40%

45.8%

87.5%

14.3%

глубокое повреждение тканей

степени у 40% животных к 30 суткам после облу-

группе «нейтроны + протоны» только у 28%, в

чения. В экспериментальных группах протонного

группе «протоны» - у 45% и в группе «протоны +

и сочетанного облучения время латентного пери-

нейтроны» - у 50% мышей. Таким образом, по

ода было одинаковым и составляло 10-12 суток. В

нескольким параметрам, характеризующим по-

группе «нейтроны+протоны» кожные реакции на

вреждение кожи (доля мышей с кожными реак-

13-е сутки наблюдались у 100% мышей, в группе

циями, соотношение разных степеней тяжести,

«протоны» - у 70.8%, а в группе «протоны+ней-

скорости восстановления повреждений), показа-

троны» - только у 43% мышей. Период проявле-

но влияние последовательности облучения раз-

ния выраженных лучевых поражений кожи со-

ными типами излучения, поскольку предвари-

ставлял 5-7 суток для всех групп, однако тяжесть

тельное облучение нейтронами в дозе 5 Гр перед

кожных реакций была различна: в группе «ней-

протонным облучением значительно усиливает

троны+протоны» самая тяжелая четвертая сте-

эту категорию побочных последствий, что приво-

пень поражений, характеризуемая появлением

дит к дополнительной интоксикации мышей,

язв и некрозов, наблюдалась у 87.5%, в группе

связанной с острым и хроническим воспалением,

«протоны» - у 46%, а в группе «протоны + ней-

и может существенно влиять на более отдаленные

троны» - только у 14% мышей. Кроме того, в

последствия.

группе «протоны + нейтроны», в которой наблю-

Далее мы наблюдали за отдаленными лучевы-

дали самую низкую частоту общего количества

ми последствиями только у мышей с полной ре-

кожных реакций, у 29% мышей лучевые пораже-

грессией опухолевых узлов. Через 35-46 суток

ния были легкими и не развивались более первой

после последнего облучения во всех группах на-

степени (умеренная эритема, эпиляция, сухой

блюдали первые случаи возобновления роста

эпидермит) (табл. 1).

опухолей у мышей. Средняя продолжительность

безрецидивного периода в группе «протоны» со-

Облучение опухоли только нейтронами в дозе

ставила 85 суток, а в группах с разной последова-

5 Гр приводило к развитию самой тяжелой степе-

ни кожных повреждений у 40% мышей, почти

тельностью излучений срок ремиссии был ниже и

составлял 43 и 60 суток (табл. 2). СПЖ мышей без

столько же, что и при действии двух фракций по

рецидивов в группах с воздействием нейтронов и

40 Гр протонного излучения, а сочетанное облу-

протонов была достоверно меньше (118 и 124 су-

чение нейтронами до протонов почти в два раза

ток) по сравнению с группой мышей, облученных

увеличивало частоту наиболее тяжелых кожных

реакций по сравнению с одним только протон-

только протонами (278 суток). СПЖ мышей с ре-

цидивами в группе «протоны» составляла 115 су-

ным облучением. Неожиданным оказалось то,

ток после облучения; в группах «нейтроны + про-

что в варианте, где мыши облучались нейтронами

тоны» и «протоны + нейтроны» она была меньше,

после ТСПП, наблюдалась самая благополучная

65 и 80 дней соответственно.

картина лучевых последствий: низкая доля мы-

шей с четвертой степенью поражения кожи, и у

На рис. 5 показана выраженность таких отда-

30% мышей была небольшая степень выраженно-

ленных эффектов, как доля мышей без опухолей,

сти поражений. Длительность репаративного пе-

количество погибших мышей без опухолей и по-

риода повреждений кожи была практически оди-

явление рецидивов на 60-е сутки (рис. 5а) и на

наковой для всех облученных животных, и со-

90-е сутки (рис. 5б) в зависимости от последова-

ставляла

30-35 суток с момента появления

тельности облучения. На 60-е сутки после облу-

первых реакций, но волосяной покров в месте об-

чения количество излеченных животных в группе

лучения опухоли восстановился к 40 суткам в

«протоны» было значительно больше (p ≤ 0.05) по

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

ВЛИЯНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДЕЙСТВИЯ ИЗЛУЧЕНИЙ

997

Таблица 2. Средняя продолжительность безрецидивного периода и СПЖ мышей после сочетанного воздействия

нейтронов и протонов

Время появления

Средняя

СПЖ мышей, сут

первой

продолжительность

Условия облучения

рецидивной

безрецидивного

С рецидивами

Без рецидивов

опухоли, сут

периода, сут

протоны (40+40 Гр)

115

278

нейтроны (5 Гр) +

43*

65*

118*

протоны (40+40 Гр)

протоны (40+40 Гр) +

124*

нейтроны (5 Гр)

Примечание. * - p ≤ 0.05 по сравнению с группой протонного воздействия.

сравнению с таковым в группе «протоны + ней-

43% - соответственно в группах «нейтроны +

троны»; максимальная гибель у мышей наблюда-

+ протоны» и «протоны + нейтроны».

лась в группе «протоны + нейтроны», а количе-

На рис. 7 показано время роста рецидивных

ство рецидивов во всех группах было одинако-

опухолей у мышей после протонного и комбини-

вым. На 90-е сутки после облучения количество

рованного облучения, которое определялось как

погибших животных в группе «протоны + ней-

время, необходимое для пятикратного увеличе-

троны» значительно увеличилось, что не наблю-

далось в других группах. Количество животных с

ния исходного пальпируемого объема (0.47 см³).

рецидивами опухолей в группе «протоны» увели-

Времена роста рецидивов, полученные для всех

чилось почти вдвое, а в группе «протоны + ней-

животных, усредняли по каждой группе и рассчи-

троны» - в полтора раза. У мышей, подвергшихся

тывали время задержки роста опухоли как разни-

комбинированному облучению, все случаи воз-

цу между временем роста рецидивных опухолей

обновления роста опухоли наблюдались в тече-

экспериментальной группы и необлученного

ние пяти-двенадцати недель после облучения, в

контроля [36]. Время задержки роста опухоли в

отличие от мышей, облученных только протона-

группе «протоны» на 13-е сутки отличалось отно-

ми, у которых возобновление роста опухоли на-

сительно контрольной группы, а для групп «ней-

блюдалось в более поздние сроки, через 19-35 не-

троны + протоны» и «протоны + нейтроны» было

дель (рис. 6). На протяжении всего периода на-

таким же, как и в контроле. Таким образом, в

блюдения доля мышей с возобновившимся

группе «протоны» рецидивные опухоли росли

ростом опухоли той же локализации, что и пер-

медленнее, чем в группах комбинированного об-

вичная, составил 36% в группе «протоны» и 50 и

лучения.

Рис. 5. Отдаленные эффекты у мышей с АКЭ после протонного и комбинированного облучения: на 60-e сутки (a) и на

90-е сутки (б).

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

998

РОЗАНОВА и др.

Рис. 6. Динамика появления вторичных опухолей после

облучения пучком протонов 40 + 40 Гр и их сочетанного

Рис. 7. Время роста рецидивных опухолей у мышей

воздействия с нейтронами в дозе 5 Гр.

после протонного и комбинированного облучения.

«Вылеченные» мыши, у которых опухолевый

ции развития опухоли считается достаточно не-

узел не развивался в месте облучения на протяже-

большое количество (обычно всего 1-4%) ОСК,

нии всей жизни, в группах, подвергшихся комби-

обладающих свойствами стволовых клеток: спо-

нированному облучению, гибли раньше, чем в

собностью к самовосстановлению, обновлению и

группе, подвергавшейся только протонному об-

дифференцировке, относительно более высокой

лучению. Максимальная продолжительность

радиорезистентностью и способностью к мета-

жизни в группе «нейтроны + протоны» составила

стазированию. Показано, что количество ОСК в

7 месяцев, в группе протоны + нейтроны - 11 ме-

культурах различных тканей увеличивается после

сяцев, в группе протоны - 21 месяц.

однократного облучения в диапазоне доз 1-10 Гр,

а опухолевые не стволовые клетки погибают при

Таким образом, анализ таких отдаленных по-

увеличении дозы. После фракционированного

следствий облучения, как время ремиссии, часто-

рентгеновского облучения in vivo в суммарной до-

та и скорость роста вторичных опухолей, продол-

зе 10 Гр у всех больных раком верхних дыхатель-

жительность жизни мышей-опухоленосителей

ных путей увеличилось относительное количе-

показал, что дополнительное воздействие ней-

ство ОСК [8]. По сравнению с гамма-излучением

тронов как до, так и после протонного облучения

эквивалентные дозы низкоэнергетических про-

значительно ухудшает эти показатели эффектив-

тонов с энергией 3 МэВ более эффективно сни-

ности терапии.

жали популяцию клеток ОСК-подобной карци-

номы легкого; при этом экспрессия генов, участ-

вующих в клеточной гибели, возрастала в десять

ОБСУЖДЕНИЕ

раз [17]. Эти результаты дают основание для более

По сравнению с фотонным излучением радио-

интенсивных поисков новых путей в адронной

биологическое действие адронов (протонов, ней-

терапии для контроля резистентности новообра-

тронов и ионов углерода) характеризуется индук-

зований к лучевой терапии и снижения частоты

цией преимущественно летальных повреждений

рецидивов, и одним из таких способов, на наш

ДНК и практически не зависит от фазы клеточно-

взгляд, является гипофракционированное высо-

го цикла. Протонное облучение значительно сни-

кодозное протонное облучение [10]. Представля-

жает коэффициент усиления кислорода в ткани,

ется очевидным, что эксперименты на клеточных

сводит к минимуму ускоренную репопуляцию

культурах не позволяют оценить реакцию слож-

опухолевых клеток, подавляет их способность к

ной многофункциональной структуры опухоли,

метастазированию и более эффективно повре-

содержащей клетки с разной чувствительностью

ждает радиорезистентные ОСК, что, как правило,

или даже совершенно противоположными отве-

является причиной возникновения вторичных

тами на одни и те же дозы облучения. Важнейши-

злокачественных новообразований [1, 7]. В на-

ми критериями эффективности современной те-

стоящее время происходит смена классических

рапии онкологических заболеваний являются

представлений о механизмах возникновения, ро-

длительность безрецидивного периода, частота

ста и взаимодействия структурных компонентов

рецидивов и продолжительность жизни больных.

опухоли, метастазирования и рецидива [37]. Это

В связи с этим для разработки новых схем фрак-

объясняется тем, что ключевым звеном в индук-

ционированного облучения при протонной тера-

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

ВЛИЯНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДЕЙСТВИЯ ИЗЛУЧЕНИЙ

999

пии необходимы модели опухолей на животных,

ствии на опухоли частиц с высокими значениями

позволяющие не только оценивать ранние проти-

ЛПЭ, таких как нейтроны, облучению подверга-

воопухолевые эффекты и реакции нормальных

ются и здоровые ткани, что вызывает радиацион-

здоровых тканей, но и отслеживать динамику ре-

ные повреждения в клетках, окружающих опу-

миссии, индукции рецидивов и выживания жи-

холь. В нашей работе мы облучали опухоль, лока-

вотных.

лизованную в бедре мыши, в которой количество

Здесь мы предприняли попытку повысить

миелокариоцитов в семь-восемь раз больше, чем

противоопухолевую эффективность облучения

в голени или предплечье [40]; предположительно,

локальное облучение этой области нейтронами

протонами в сочетании с нейтронным излучени-

способствует дополнительному подавлению вос-

ем в разной последовательности. Показано, что

комбинированное облучение мышей нейтронами

становления кроветворения, что приводит к

в дозе 5 Гр как до, так и после двукратного про-

уменьшению продолжительности жизни после

тонного облучения также, как и при облучении

комбинированного облучения. Кроме того, при

локальном облучении нейтронами в относитель-

только пучком протонов, эффективно подавляло

но небольшой дозе охватывался больший объем

рост солидной АКЭ в течение месяца после воз-

действия. По частоте и тяжести лучевых пораже-

здоровой ткани, окружающей опухоль, чем при

ний кожи, которая служили моделью ответа

высокоточном облучении сканирующим пучком

здоровых тканей, наблюдаемых через 15-40 сут

протонов, что также могло негативно сказывать-

ся на состоянии мышей в отдаленные сроки. Ра-

после радиационной терапии, облучение нейтро-

нее нами при облучении опухоли протонами бы-

нами после протонного облучения приводило к

значительному улучшению этих показателей по

ла показана зависимость СПЖ мышей от объема

сравнению с одним протонным облучением, од-

облучения нормальной ткани, окружающей опу-

нако облучение нейтронами перед протонным

холь [26]. Возможно, негативное влияние комби-

нированного облучения на отдаленные послед-

облучением оказалось более повреждающим, чем

ствия, связано и с тем, что ОБЭ нейтронов при

в других вариантах. В работе [38] было показано,

что воздействие излучения с высокой ЛПЭ (ионы

прохождении возрастает обратно пропорцио-

углерода, нейтроны) перед облучением протона-

нально дозе, что оказывает более сильное повре-

ми приводит к более низкой выживаемости кле-

ждающее действие на нормальные ткани вне опу-

холи [22].

ток китайского хомячка B14-150 (фибросаркома)

по сравнению с облучением сначала протонами.

Полученные результаты свидетельствуют о

Авторы предположили, что повреждения клеток,

том, что регистрация ранних и отдаленных по-

вызванные протонами с низкой ЛПЭ, репариро-

следствий по нескольким критериям, позволяет

вались в промежутке между фракциями, а повре-

более полно оценить эффективность схем облу-

ждения, вызванные частицами с высокой ЛПЭ,

чения и, вероятно, эту информацию следует учи-

были в основном нерепарируемыми. Таким обра-

тывать при выборе терапии той или иной опухоли

зом, порядок воздействия излучениями с низкой

в зависимости от ее локализации, размера, фор-

и высокой ЛПЭ при комбинированном воздей-

мы, близости к критическим органам и возмож-

ствии на клетки имеет значение. В работе [39] от-

ный вклад повреждения кожи в последствия ле-

метили, что последовательность гамма-излуче-

чения. Полученные данные выявили сложные за-

ния и нейтронов при фракционированном облу-

кономерности реакции опухоли и здоровых

чении опухолей у животных и доля нейтронов в

тканей в зависимости от последовательности об-

кумулятивной дозе имеют большое значение, по-

лучения при комбинированном воздействии из-

скольку облучение нейтронным излучением в до-

лучений разного качества. На современном этапе

зе 2.5 Гр следует за фракционированным гамма-

развития протонной терапии становится очевид-

облучением. Облучение в дозе 28 Гр более эффек-

ной необходимость дальнейшего накопления

тивно подавляло рост опухоли и не влияло на

экспериментальных радиобиологических данных

кожные реакции по сравнению с облучением

для корректного определения ОБЭ протонов в те-

нейтронами до гамма-облучения.

рапевтических условиях на моделях опухолей и

При всех последовательностях облучения, ис-

нормальных тканей in vivo методами, аналогич-

пользованных в нашей работе, наблюдалось пол-

ными тем, что применяются для доклинических и

ное подавление опухолевого роста, но реакции

клинических испытаний лекарственных средств.

нормальных тканей сильно различались. У мы-

шей с опухолями, подвергшихся комбинирован-

БЛАГОДАРНОСТИ

ному облучению, такие показатели эффективно-

сти лечения, как продолжительность ремиссии,

Авторы выражают благодарность А.А. Лычаги-

частота повторного роста опухоли и СПЖ были

ну, С.Н. Корякину и Т.С. Хозяшевой - сотрудни-

значительно хуже, чем у животных, облученных

кам отдела радиационной биофизики МРНЦ

только протонами. Из-за специфики распределе-

им. А.Ф. Цыба (филиала НМИЦ радиологии

ния поглощенной энергии в веществе при дей-

Минздрава России, Обнинск) за помощь в орга-

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

1000

РОЗАНОВА и др.

низации и проведении эксперимента по облуче-

11. T. Belyakova, V. Balakin, S. Zaichkina, et al., in Proc.

нию нейтронами на оборудовании Центра.

Int. Conf. on Radiation Applications in Physics, Chemis-

try, Biology, Medical Sciences, Engineering and Environ-

mental Sciences (2019), p. 110.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

12. S. Tran, E. Puric, M. Walser , et al., Br. J. Radiol., 93

Работа выполнена на базе ФТЦ Физическо-

(1107), 20180883 (2020).

го института им. П.Н. Лебедева и ИТЭБ РАН в

13. H. Ghaffari, J. Beik, A. Talebi, et al., Clin. Translat.

рамках выполнения фундаментальных науч-

Oncol., 20 (12), 1502 (2018).

ных исследований по теме ГЗ № 075-00381-21-

14. C. R. Arnold, J. Mangesius, I. I. Skvortsova, et al.,

00 и за счет частичной финансовой поддержки

Front. Oncol., 10, 164 (2020).

из средств договора между ФТЦ ФИАН и

15. S. Chiblak, Z. Tang, B. Campos, et al., Int. J. Radiat.

ИТЭБ РАН № 06/20.

Oncol. Biol. Phys., 95 (1), 112 (2016).

16. E. T. Vitti and J. L. Parsons, Cancers (Basel), 11 (7),

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

946 (2019).

17. H. Narang, A. Kumar, N. Bhat, et al., Mutat. Res.,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

780, 35 (2015).

интересов.

18. M. F. Timoshchuk, P. Dekker, D. S. Hippe, et al., Oral

Oncol., 88, 51 (2019).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

19. H. Cash, R. A. Harbison, N. Futran, et al., Laryngo-

Все применимые международные, националь-

scope. 131 (3),541 (2021).

ные и институциональные принципы ухода и ис-

20. А. Д. Каприн и С. Е. Ульяненко, Медицина: целе-

пользования животных при выполнении работы

вые проекты, 23, 56 (2016).

были соблюдены. Исследования проводили в со-

21. Y. Hirota, S. Masunaga, N. Kondo, et al., J. Radiat.

ответствии с требованиями Федерации европей-

Res., 55 (1), 75 (2014).

ских научных ассоциаций по содержанию и ис-

22. B. Jones, Front. Oncol., 10, 1537 (2020).

пользованию лабораторных животных в научных

23. Е. Е. Бекетов, Е. В. Исаева и С. Н. Корякин, Ради-

исследованиях (Federation of European laboratory

ация и риск, 21 (3), 82 (2012).

animal science association, FELASA). Эксперимен-

24. С. Е. Ульяненко, С. Н. Корякин, Е. В. Исаева и др.,

ты получили одобрение Комиссии по биологиче-

ской безопасности и биоэтике ИТЭБ РАН, все

Радиац. биология. Радиоэкология,

(6),

598

процедуры проводились в соответствии с норма-

(2016).

тивно-правовыми актами по содержанию и ис-

25. Е. В. Исаева, Е. Е. Бекетов, Н. В. Наседкина и др.,

пользованию лабораторных животных (протокол

Радиация и риск, 28 (1), 59 (2019).

№8/2020 от 17.02.2020).

26. В. Е. Балакин, А. Е. Шемяков, C. И. Заичкина

и дp., Биофизика, 62 (1), 161 (2017).

27. C. Peitzsch, A. Tyutyunnykova, K. Pantel, et al., Semi-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

nars Cancer Biol., 44, 10 (2017).

1. P. Blanchard, G. B. Gunn, A. Lin, et al., Semin.

28. J. A. Smith, F. A. van den Broek, J. C. Martorell, et al.,

Radiat. Oncol., 28 (1), 53 (2018).

Laboratory Animals, 41 (2), 143 (2007).

2. S. Baliga, L. Gandola, B. Timmermann, et al., Pediat-

29. S. Mishra, A. Tamta, M. Sarikhani, et al., Sci. Rep., 8

ric Blood Cancer, 9, (2020).

(1), 5599 (2018).

3. F. Tommasino and M. Durante, Cancers (Basel), 7

30. E. V. Isaeva, E. E. Beketov, S. N. Koryakin, et al., Ra-

(1), 353 (2015).

diat. Protection Dosimetry, 161 (1-4), 478 (2014).

4. T. Bortfeld, H. Paganetti, and H. Kooy, Med. Physics,

31. V. E. Balakin, A. L. Bazhan, V. A. Alexandrov, et al., in

32 (6), 2048 (2005).

Proc. 27^th Russian Particle Accelerator Conf. (2021),

5. H. Suit, T. DeLaney, S. Goldberg, et al., Radiother

p. 120.

Oncol., 95 (1), 3 (2010).

32. ICRU Report 62: Prescribing, Recording and Reporting

6. A. Luhr, C. Neubeck, M. Krause, et al., Clin. Translat.

Photon Beam Therapy (International Commission on

Radiat. Oncol., 9, 35 (2018).

Radiation Units and Measurements, Bethesda, 1999).

7. H. Paganetti, E. Blakely, A. Carabe-Fernandez, et al.,

33. С. В. Сыромуков, Р. В. Добров, А. В. Степнов и др.,

Med. Physics 46 (3), 53 (2019).

Атомная энергия, 112 (6), 350 (2014).

8. E. S. Diffenderfer, I. I. Verginadis, M. M. Kim, et al.,

34. B. Sorensen, M. Horsman, J. Alsner, et al., Acta On-

Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 106 (2), 440 (2020).

col., 54 (9), 1623 (2015).

9. Y. Liu, P. Zhang, F. Li, et al., Theranostics, 8 (7), 1824

35. J. D. Cox, J. Stetz, and T. F. Pajak, Int. J. Radiat. On-

(2018).

col. Biol. Phys. 31 (5), 1341 (1995).

10. В. Е. Балакин, А. Е. Шемяков, C. И. Заичкина

36. K. Ando, S. Koike, A. Uzawa, et al., J. Radiat. Res., 46

и дp., Биофизика, 61 (4), 808 (2016).

(1), 51 (2005).

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022

ВЛИЯНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДЕЙСТВИЯ ИЗЛУЧЕНИЙ

1001

37. R. French and S. Pauklin, Int. J. Cancer, 148 (12), 2884

39. G. M. Obaturov, V. A. Sokolov, S. E. Ulyanenko, et al.,

(2021).

Radiat. Biol. Radioecology, 37 (4), 475 (1997).

40. Г. С. Стрелин, Н. К. Шмидт, Н. Н. Сильченко и др.,

38. M. Troshina, E. Koryakina, V. Potetnya, et al., in Proc.

Эффект экранирования части костного мозга при

Eighth international conference on radiation in various

фракционированном облучении организма (Медици-

fields of research (2020), p. 126.

на, Л., 1978).

Early and Remote Sequence Effect of Neutron and Proton Irradiation

on the Tumor Response of Solid Ehrlich Carcinoma and Skin Reactions in Mice

O.M. Rozanova*, E.N. Smirnova*, T.A. Belyakova**, N.S. Strelnikova**,

A.E. Shemyakov*^, **, and A.V. Smirnov**

*Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences,

Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

**Physical-Technical Center of Lebedev Physical Institute, Russian Academy of Sciences,

Akademicheskii proezd 2/110, Protvino, Moscow Region, 142281 Russia

The present study evaluated the sequence effect of proton (at a total dose of 80 Gy) and neutron radiation (at

a dose of 5 Gy) on tumor response and skin reactions in mice bearing solid tumor of Ehrlich ascites carcinoma

exposed to combined radiation. It was shown that neutron radiation used either before or after proton radia-

tion effectively reduces proliferation of solid Ehrlich ascites carcinoma in mice for one month after irradia-

tion. Our work showed that parameter values for the frequency and severity of radiation-induced skin reac-

tions in mice at 15-40 days postirradiation were much better when animals were exposed to neutrons after

proton therapy, as opposed to those obtained after the use of only proton therapy. However, neutron exposure

process before proton irradiation was rather damaging sequence than another one. It was also found that the

tumor relapse rate in the groups of animals exposed to combined radiation was higher, and the overall lifespan

was shorter than that in the group of mice irradiated only with protons.

Keywords: neutrons, protons, Ehrlich ascites carcinoma, radiation-induced skin reaction, tumor relapses, mice

БИОФИЗИКА том 67

№ 5

2022