БИОФИЗИКА, 2022, том 67, № 6, с. 1089-1092

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 543.429.23, 577.112.5

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОМ ЯМР ¹H ВЛИЯНИЯ трет-БУТИЛОВОГО

СПИРТА НА КОЛЛАГЕН I

*Московский авиационный институт (национальный исследовательский университет),

Волоколамское шоссе, 4, Москва, 125993, Россия

^#E-mail: mnmashkin@yandex.ru

**Московский государственный университет пищевых производств,

Волоколамское шоссе, 11, Москва, Российская Федерация 125080

^##E-mail: vmashkina@yandex.ru

***Институт неорганической химии им. А.В. Николаева СО РАН,

просп. Академика Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090, Россия

****Белгородский государственный технологический университет имени В. Г. Шухова,

ул. Костюкова, 46, Белгород, 308012, Россия

^###E-mail: sgk@niic.nsc.ru

Поступила в редакцию 15.06.2022 г.

После доработки 08.07.2022 г.

Принята к публикации 11.07.2022 г.

На образцах ахиллова сухожилия крупного рогатого скота методом ЯМР ¹H впервые исследовано

влияние трет-бутилового спирта ((CH₃)₃COH) на динамическое состояние макромолекул коллаге-

на I. Это влияние проявляется в изменениях подвижности CH₂-групп, находящихся в составе мак-

ромолекул, и обусловлено взаимодействиями между водной подсистемой и макромолекулами кол-

лагена. Наиболее сильно взаимодействия проявляются при фазовом переходе в системе «трет-бути-

ловый спирт - вода».

Ключевые слова: ахиллово сухожилие, ядерный магнитный резонанс, подвижность CH₂-групп, фазовый

переход.

DOI: 10.31857/S0006302922060059, EDN: LJSBMV

привести не только к изменению подвижности

Структура коллагена соединительно-тканых

молекул воды и макромолекул, но и к фазовым

структур, таких как кожи, сухожилий, аортальной

переходам [6, 7].

стенки и др. относится к типу коллаген I [1]. Во-

локнистая структура коллагена I относится к про-

В настоящей работе методом ядерного магнит-

странственной группе P1 (триклинная, с пара-

ного резонанса (ЯМР ¹H) исследованы измене-

метрами решетки a

= 39.97 Å, b

= 26.95 Å,

ния, происходящие в подвижности макромоле-

c = 667.9 Å; α = 89.24°, β = 94.59°, γ = 105.58°), об-

кул коллагена, в поры которого были внедрены

разована параллельной укладкой стержнеобраз-

молекулы трет-бутилового спирта. Трет-бутило-

ных макромолекул тропоколлагена, представля-

вый спирт ((CH₃)₃COH или 2-метил-2-пропанол)

ющих собой тройную спираль из трех неидентич-

широко используется в фармацевтической про-

ных цепочек по ~1040 аминокислотных остатков

мышленности при синтезе лекарственных суб-

каждая [2, 3]. Пространство между макромолеку-

станций. Он плохо впитывается в кожу человека,

лами (поры), заполнено молекулами воды и (в

но тем не менее вызывает ее раздражение [8].

малых концентрациях) другими веществами, не-

Водный раствор трет-бутилового спирта харак-

обходимыми для роста ткани и поддержания

теризуется сложной фазовой диаграммой [9]. Мы

устойчивого ее состояния в условиях непрерыв-

использовали 65%-й водный раствор, который

ного молекулярного обмена [4, 5]. Изменение

при комнатной температуре является жидкостью,

температуры и состава водной подсистемы может

ниже 4°С происходит образование дигидратов

(CH₃)₃COH в воде, а ниже -5°С возникает фаза

BAT - ахиллово сухожилие крупного рога-

Сокращение:

того скота (Bovine Achilles Тendon).

льда с дигидратами (CH₃)₃COH.

1089

1090

МАШКИН и др.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Формы спектров ЯМР ¹H в образцах BAT1 и

BAT2 являются подобными, состоят из широкого

компонента, обусловленного протонами CH₂-,

CH- и NH-групп макромолекул, а также узкого

компонента, обусловленного протонами H₂O и

(CH₃)₃COH в жидком состоянии (рис. 1). В ши-

роком компоненте полученных спектров невоз-

можно четко выделить спектр от CH₂-, CH-, NH-

групп и других водородсодержащих групп макро-

молекул коллагена, тем не менее видно, что наи-

большим удельным весом среди протонсодержа-

щих структурных единиц обладают CH₂-группы,

так как форма их ЯМР ¹H спектров совпадает с

характерным дублетом Пейка для CH₂-групп c

полушириной ΔB ~ 1 мТл [10].

Поскольку макромолекулы в структуре колла-

гена имеют некоторую кристаллическую упоря-

доченность, преобладающий вклад CH₂ групп

приводит к ориентационной зависимости пей-

Рис. 1. Производные спектров поглощения ЯМР ¹H

ковского дублета, которая описывается соотно-

образца BAT2: Θ - угол между ориентацией внешнего

шением для дублетного расщепления за счет ди-

магнитного поля и направлением волокон образца

поль-дипольного взаимодействия между ядерны-

BAT2, ΔB - полуширина широкой составляющей

ми магнитными моментами атомов водорода в

спектра.

CH₂-группе [10-12]:

ΔB = 3·(μ/r³)·|(3×cos²ϑ - 1)|,

(1)

ОБРАЗЦЫ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ

где μ - магнитный момент ядра атома водорода,

МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ

-группе и ϑ - угол

r - расстояние (H-H) в CH₂

Образцы. В исследованиях использовали об-

между внешним магнитным полем и осью r.

разцы (массой 0.3 г) ахиллова сухожилия крупно-

Температурные зависимости полуширины

го рогатого скота (BAT - Bovine Achilles Тendon)

спектра широкого компонента (ΔB) BAT1 и BAT2

трехлетнего возраста. Образец BAT1 являлся ис-

при различных ориентациях представлены соот-

ходным (нативным) образцом и до проведения

ветственно на рис. 2 и 3.

экспериментов находился в воде. Образец BAT2

находился в 65%-м водном растворе трет-бути-

лового спирта. Время пребывания образцов в

ОБСУЖДЕНИЕ

жидкостях составило 26 ч при температуре 25°С.

Объем жидкости в десять раз превышал объем

Полученные температурные зависимости ΔB

каждого образца.

указывают на подвижность CH₂-групп и отлича-

ются при разных ориентациях волокон ВАТ по

ЯМР ¹H исследование. ЯМР-эксперименты

отношению к внешнему магнитному полю. Вид-

были проведены на модифицированном приборе

но, что значения ΔB в образцах BAT1 и BAT2 при

JNM-4H100 (Jeol, Япония), предназначенном для

Θ = 0^о с понижением температуры меняются не-

регистрации спектров широких линий ЯМР ¹H.

значительно (рис. 2 и 3). Этот результат можно

Регистрировали производные спектров поглоще-

объяснить тем, что (H-H)-вектора при тепловых

ния на частоте резонанса 23МГц при изменении

движениях для большинства CH₂-групп остаются

внешнего магнитного поля. Образцы BAT1 и

перпендикулярными к направлению внешнего

BAT2 помещали в ампулы так, чтобы в экспери-

поля и их колебания при такой ориентации не

ментах можно было бы реализовать две ориента-

приводят к изменениям ΔB (см. уравнение (1)).

ции волокон ахиллова сухожилия по отношению

Значения ΔB в образце BAT1 при ориентации

к внешнему магнитному полю: под углом Θ = 0° и

90°, где Θ - угол между направлением магнитно-

Θ = 90^о резко меняются в области от -1 до -6°С.

го поля и направлениями волокон ахиллова сухо-

Резкое уширение спектров ЯМР при понижении

жилия. Температуру образцов изменяли в интер-

температуры как правило объясняется «вымерза-

вале от 20 до -10°С продувкой паров газообразно-

нием» или торможением подвижности. Актива-

го азота через криостат спектрометра.

ционный барьер этой подвижности можно оце-

БИОФИЗИКА том 67

№ 6

2022

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОМ ЯМР ¹H ВЛИЯНИЯ трет-БУТИЛОВОГО СПИРТА

1091

Рис. 3. Зависимость полуширины ΔB широкого ком-

понента спектра ЯМР ¹H в образце BAT2 при различ-

ных углах ориентации Θ - 0° (1) и 90° (2).

Рис. 2. Зависимость полуширины ΔB широкого ком-

понента спектра ЯМР ¹H в образце BAT1 при различ-

ных углах ориентации Θ - 0° (1) и 90° (2).

малию, которая локализуется в области темпера-

тур от 4°С до 16°С и имеет максимум при 9°С.

нить исходя из следующей формулы (уравнение

Можно полагать, что эта аномалия связана с фа-

Уо-Федина [13]):

зовым переходом. Основанием для этого предпо-

ложения является то, что в 65%-м водном раство-

Ua = 37Tx^{= 9.9 ккал/мол,}

ре трет-бутилового спирта фазовый переход

где T_x = 267 K (-6°С) температура начала сужения

происходит при 4°С с образованием комплексов

широкого компонента спектра. Значения ΔB в

дигидрата трет-бутилового спирта [9]. Образова-

образце BAT2 при Θ = 90° также начинают

ние комплексов дигидрата возможно и в порах

сужаться при T_x = 267 K. Следовательно, актива-

коллагена I, но структура и размер этих пор явля-

ются неоднородными [6, 7]. Молекулы в водной

ционный барьер для подвижности макромолекул

в образце остался прежним. Следует отметить,

подсистеме взаимодействуют с макромолекула-

что полученное значение U_a по величине согласу-

ми, но это взаимодействие из-за неоднородных

пор и сложной структуры макромолекул не может

ется со значениями активационного барьера вы-

мерзания подвижности водной подсистемы в су-

быть регулярным, что, по-видимому, и приводит

к наблюдаемому температурному размытию об-

хожилии крысиного хвоста разного возраста [14].

разования комплексов дигидрата (CH₃)₃COH.

Сравнительный анализ спектральных полос

при комнатной температуре и Θ = 90° показыва-

ет, что значения ΔB в образце BAT2 превосходят

значения ΔB в образце BAT1 на 0.1 мТл. Посколь-

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ку активационные барьеры для обоих образцов

одинаковы, то обнаруживаемое различие может

Впервые на образцах ахиллова сухожилия

быть связано с изменениями в предэкспоненци-

крупного рогатого скота методом ЯМР ¹H выяв-

альном факторе (_a) активационного движения,

лено влияние молекул (CH3)₃COH на подвиж-

описываемого законом

ность коллагена I. Это влияние обнаруживается в

изменениях предэкспоненциального фактора ак-

 = _a·exp(-U_a/kT),

тивационного движения CH₂-групп макромоле-

где k - константа Больцмана, T - температура и

кул. Выявленное влияние еще раз доказывает су-

 - частота движения. Поскольку _a характеризу-

ществование взаимодействия между водной под-

системой и макромолекулами коллагена I. Это

ется частотами 10¹⁰-10¹² Гц, то изменения в по-

движности CH₂-групп можно ожидать и в колеба-

взаимодействие проявляется наиболее заметно

при фазовом переходе в системе «(CH₃)₃COH-

тельной спектроскопии. Отметим, что некоторое

превышение значений ΔB в образце BAT2 над

H₂O». Полученные данные могут быть полезны

значениями ΔB в образце BAT1 сохраняется по

при исследовании воздействия трет-бутилового

всему температурному интервалу от +20 до -5°С

спирта на кожу человека, а также при проектиро-

(рис. 2 и 3).

вании оборудования и разработки технологий для

На рис. 3 видно, что температурная зависи-

механохимических процессов обработки колла-

мость ΔB в образце BAT2 при Θ = 90° имеет ано-

генсодержащих сырья и материалов [15, 16].

БИОФИЗИКА том 67

№ 6

2022

1092

МАШКИН и др.

БЛАГОДАРНОСТИ

3. J. P. Orgel, A. Miller, T. C. Irving, and T. J. Wess, Fibre

Diffraction Rev., 10, 40 (2002).

Авторы благодарят профессора С. П. Габуду за

4. S. Lees, Int. J. Biol. Macromol., 8, 66 (1986).

постановку задачи при изучении взаимодействий

5. S. Lees, Biophys J.,

(1),

204

(2003). DOI:

в биологических соединительных тканях.

10.1016/S0006-3495(03)74466-X

6. S. P. Gabuda, A. A. Gaidash, V. A. Drebushchak, and

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

S. G. Kozlova, JETP Lett. 82, 613 (2005). DOI:

10.1134/1.2161292

Работа выполнена при финансовой поддержке

7. S. P. Gabuda, A. A. Gaidash, V. A. Drebushchak, and

Министерства науки и высшего образования

S. G. Kozlova, J. Struct. Chem., 46, 1131 (2005). DOI:

Российской

Федерации

(Госзадание

10.1007/s10947-006-0257-0

№ 121031700313-8).

8. D. McGregor, Crit. Rev. Toxicol., 40 (8), 697 (2010).

DOI: 10.3109/10408444.2010.494249

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

9. K. Kasraian and P. P. DeLuca, Pharm. Res., 12 (4),

484 (1995).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

10. А. Леше, Ядерная индукция (ИЛ, М., 1963).

интересов.

11. G. E. Pake, J. Chem. Phys., 16, 327 (1948).

12. С. П. Габуда и А. Г. Лундин, Внутренняя подвиж-

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

ность в твердом теле (Наука, Новосибирск, 1986).

Настоящая статья не содержит каких-либо ис-

13. Дж. Уо и Э. И. Федин, Физика твердого тела, 4 (6),

следований с участием людей или животных в ка-

2233 (1962).

честве объектов исследований.

14. S. P. Gabuda, A. A. Gaidash, and E. A. Vyazovaya,

Biophysics, 50 (2), 226 (2005).

15. С. А. Комиссаров, В. А. Машкина, М. Н. Машкин

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

и др., Кожевенно-обувная промышленность, № 3,

1. Collagen I-IV, Ed. by M. E. Nimni (CRS Press, Boca

30 (2000).

Raton, FL, 1988).

16. Аппарат для непрерывной поштучной жидкостной

2. J. P. Orgel, A. Miller, T. C. Irving, et al., Structure, 9,

обработки кожевенного сырья и полуфабриката,

1061 (2001).

Патент МПК C14C15/00 (1989).

A ¹H NMR Study of the Effect of tert-Butyl Alcohol on Collagen I

M.N. Mashkin*, V.A. Mashkina**, and S.G. Kozlova***^, ****

*Moscow Aviation Institute (National Research University), Volokolamskoe shosse 4, Moscow, 125993 Russia

**Moscow State University of Food Production, Volokolamskoe shosse 11, Moscow, 125080 Russia

***Nikolaev Institute of Inorganic Chemistry, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences,

prosp. Akademika Lavrentyeva 3, Novosibirsk, 630090 Russia

****Belgorod State Technological University named after V.G. Shukhov, ul. Kostukova 46, Belgorod, 308012 Russia

The effect of tert-butyl alcohol ((CH₃)₃COH) on dynamic states of collagen I macromolecules in bovine

Achilles tendon was studied for the first time using ¹H NMR spectroscopy. It appears that being exposed to

(CH₃)₃COH can cause changes in the mobility of CH₂-groups that are part of macromolecules and this effect

is due to interactions between the aqueous subsystem and collagen macromolecules. The interactions are

most strongly manifested during phase transition in the (CH₃)₃COH/H₂O system.

Keywords: Achilles tendon, nuclear magnetic resonance, mobility of CH₂-groups, phase transition

БИОФИЗИКА том 67

№ 6

2022