БИОФИЗИКА, 2022, том 67, № 6, с. 1158-1162

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 577.3

МЕХАНИЗМ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИАКРИЛАТА

ЗОЛОТА НА ЛИМФОЦИТЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

*Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, ул. Косыгина, 4, Москва, 119334, Россия

^#Е-mail: larros@list.ru

Поступила в редакцию 23.08.2022 г.

После доработки 23.08.2022 г.

Принята к публикации 02.09.2022 г.

Проведено исследование механизма действия полиакрилата золота (аурумакрила) на лимфоциты

крови человека, включающее оценку влияния препарата на жизнеспособность клеток, структуру

ДНК и способность к генерации активных форм кислорода. Установлено, что аурумакрил обладает

доза- и экспозиционно- зависимым цитотоксическим действием, индуцирует однонитевые

разрывы ДНК и вызывает генерацию внутриклеточных активных форм кислорода.

Ключевые слова: полиакрилат золота (аурумакрил), лимфоциты человека, цитотоксичность, однони-

тевые разрывы ДНК, активные формы кислорода.

DOI: 10.31857/S0006302922060126, EDN: LKICKI

ствие аурумакрила приводило к накоплению

Препарат полиакрилата золота (аурумакрил),

клеток в фазе пролиферативного покоя G₀,сни-

как было показано ранее, проявляет значитель-

ную противоопухолевую активность на моделях

жению доли делящихся клеток и к утрате выжив-

солидных опухолей животных (карцинома легких

шими клетками репродуктивной способности [3].

Льюис, аденокарцинома Акатол, аденокарцино-

Наряду с этим необходимо отметить, что золо-

ма Са-755) in vivo, а также обладает цитотоксиче-

тосодержащие соединения, согласно литератур-

ской эффективностью в отношении клеточных

ным данным, относят к потенциальным противо-

линий опухолей человека (рак молочной железы

опухолевым агентам с мультитаргетным механиз-

MCF-7, рак легкого А-549, рак толстой кишки

мом действия, способным не только влиять на

HCT116, меланома Mel Me) in vitro [1-5].

структуру ДНК и пролиферативные процессы в

Важной особенностью действия препарата яв-

опухолевых клетках, но и вызывать значительные

ляется обнаруженное нами в экспериментах с

изменения в антиоксидантном статусе опухоли

культурой клеток опухоли человека MCF-7 отсут-

[8, 9].

ствие перекрестной резистентности между ауру-

В продолжение исследования механизма дей-

макрилом и такими широко применяемыми в

ствия аурумакрила проведено изучение цитоток-

клинической практике средствами как цисплати-

сической активности препарата в отношении

на и доксорубицин [6].

лимфоцитов крови человека, а также его влияния

Исследование механизма действия аурумак-

на структуру ДНК (однонитевые разрывы) и гене-

рила на опухолевые клетки (культура MCF-7) по-

рацию внутриклеточных активных форм кисло-

казало, что апоптоз не является доминирующим

рода (АФК).

механизмом в индуцированной препаратом гибе-

ли клеток [7].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Установлено, что ДНК опухолевых клеток яв-

Препарат. Исследовавшийся препарат ауру-

ляется одной из основных мишеней для аурумак-

макрил - это неполная золотая соль полиакрило-

рила, вызывающего структурные изменения мак-

вой кислоты, содержащая 8 масс. % ионов метал-

ромолекулы в виде сшивок [7].

ла и отвечающая общей формуле (-CH₂-CH-

Препарат вызывает также значительные изме-

COOH-)_n(-CH₂CHCOOAuCl₃H-)_m, где n

нения в кинетике клеточной пролиферации

выжившей фракции опухолевых клеток. Воздей-

= 12000-35000, m = 1650-6650. Молекулярная

масса полимера составляет 100-300 кДа. ИК-

Сокращение:

АФК - активные формы кислорода.

спектры препарата содержат полосы поглощения

1158

МЕХАНИЗМ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИАКРИЛАТА ЗОЛОТА

1159

карбоксильной и карбоксилатной групп соответ-

лочному электрофорезу (раствор для электрофо-

реза: 300 ммоль/л NaOH, 1 ммоль/л Na₂ЭДТА,

ственно при 1720 и 1570 см^-1. Субстанция препа-

рата представляет собой стекловидные пластин-

рН

13, стабилизация по напряжению

ки золотистого цвета, хорошо растворимые в воде

0.75 В/см, 20 мин при 4°С) с последующей ней-

[1]. Оценка эффектов препарата in vitro проведена

трализацией (3-5 мин в 0.4 моль/л трис-HCl-бу-

при его применении в концентрациях от 1 до

фере при 4°С).

1000 мкг/мл.

Для окраски ДНК использовали акридиновый

Культура лимфоцитов крови человека. В экспе-

оранжевый (2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфе-

риментах использована гепаринизированная

ре, рН 7.4).

кровь здоровых доноров в возрасте 20-30 лет,

Визуализацию и документирование ДНК-ко-

давших информированное согласие на проведе-

мет проводили на люминесцентном микроскопе

ние исследования.

Eclipse Ni-U (Nikon, Япония), оснащенным ви-

Выделение лимфоцитов из крови проводили

деокамерой ProgRes CFcool (Jenoptik AG, Герма-

путем центрифугирования в градиенте плотности

ния). Для анализа и обработки микрофотоизоб-

фикол-верографина (Histopaque-1077, Sigma-Al-

ражений ДНК-комет использовали программу

drich, США) в соответствии с приложенной ин-

CASP 1.2.2 (СASPlab, Польша).

струкцией.

Оценка генерации активных форм кислорода.

После выделения из крови отмытые лимфоци-

Для оценки генерации АФК использовали краси-

ты ресуспендировали в фосфатно-солевом буфе-

тель

5(6)-хлорометил-2',7'-дихлордигидрофлуо-

ресцеин диацетат (Invitrogen, США), который

ре (рН 7.4) до конечной концентрации 1×10⁶ кле-

легко проникает через клеточную мембрану и

ток/мл. Суспензию свежевыделенных лимфоци-

гидролизуется в клетке эстеразами с последую-

тов инкубировали с аурумакрилом, при-

щим окислением до флуоресцирующего ком-

мененным в указанных выше концентрациях,

плекса. Окисленный краситель хорошо удержи-

при 37°С в течение 1, 6 и 24 ч.

вается клетками и считается маркером внутри-

Оценка цитотоксического эффекта. Исследова-

клеточных АФК [10].

ние цитотоксичности аурумакрила в отношении

Контрольные или обработанные полиакрила-

лимфоцитов крови человека проведено в тесте с

том золота клетки инкубировали при 37°С в фос-

использованием 0.4% раствора трипанового си-

фатном буфере (рН

7.4)

с красителем

него, восприимчивость к которому характеризует

(2 мкмоль/л) в течение 60 мин и измеряли интен-

жизнеспособность клеток. Клеточную суспензию

сивность их флуоресценции на флуориметре Qu-

смешивали в равных пропорциях с раствором

bit (Invitrogen, США) при длине волны возбужде-

0.4% трипанового синего, далее ресуспендирова-

ния 480-490 нм и длине волны излучения 520-

ли и непосредственно после этого оценивали кле-

530 нм.

точную гибель путем подсчета окрашенных (по-

Статистическая обработка полученных ре-

гибших) клеток в камере Горяева при анализе

зультатов проведена с помощью программы Sta-

500 клеток для каждой точки.

tistica 7.0. Результаты экспериментов представле-

Полученные данные представлены в виде кри-

ны в виде средних значений для пяти независи-

вых, характеризующих изменение доли погибших

мых измерений с учетом стандартной ошибки.

после воздействия аурумакрила клеток по отно-

шению к контролю в зависимости от концентра-

ции препарата.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ однонитевых разрывов ДНК. Для анали-

Исследование механизма действия аурумак-

за однонитевых разрывов ДНК, индуцированных

рила на лимфоциты крови человека включало

аурумакрилом, использовали метод электрофо-

оценку влияния препарата на жизнеспособность

реза единичных клеток в щелочных условиях (ме-

клеток, структуру ДНК и способность к генера-

тод ДНК-комет).

ции АФК.

Суспензию контрольных или обработанных

Цитотоксичность аурумакрила. Влияние ауру-

аурумакрилом клеток смешивали с 1%-м раство-

макрила на жизнеспособность лимфоцитов ха-

ром легкоплавкой агарозы при 37.5°С (1:1) и на-

рактеризуют данные, представленные на рис. 1.

носили по 70 мкл на предметные стекла, предва-

Как видно из представленных данных, цито-

рительно покрытые 1%-м раствором нормоплав-

токсичность аурумакрила для лимфоцитов крови

кой агарозы, после чего накрывали покровным

человека существенным образом зависит от кон-

стеклом и выдерживали при 4°С в течение 10 мин.

центрации и главным образом от времени воздей-

Затем в течение 1 ч клетки подвергали лизису

ствия препарата на клетки. Так, при инкубации

при 4°С (лизирующий буфер: 2.5 моль/л NaCl,

препарата с клетками в течение 1 ч гибель клеток

20 ммоль/л трис-HCl, 100 ммоль/л Na₂ЭДТА,

с возрастанием концентрации препарата не уве-

10% диметилсульфоксида, 1% Triton-X100) и ще-

личивается и находится практически на уровне

БИОФИЗИКА том 67

№ 6

2022

1160

ЧИГАСОВА и др.

Рис. 1. Изменение доли погибших лимфоцитов крови

Рис. 2. Изменение доли ДНК в хвосте ДНК-комет

человека в зависимости от концентрации и времени

лимфоцитов крови человека в зависимости от

воздействия аурумакрила. Время: 1 - 1 ч, 2 - 6 ч, 3 - 24 ч.

концентрации и времени воздействия аурумакрила.

Время: 1 - 1 ч, 2 - 6 ч, 3 - 24 ч.

контроля (рис. 1, кривая 1). С увеличением вре-

мени инкубации до 6 и 24 ч гибель лимфоцитов

называемый «хвост» ДНК-комет, регистрируется

линейно возрастает с повышением концентрации

путем оценки показателя электрофоретической

аурумакрила, достигая максимума - гибели при-

подвижности ДНК.

мерно 50% клеток - при воздействии препарата в

Изменение доли фрагментированной ДНК в

концентрации 1000 мкг/мл в течение как 6 ч, так

хвосте ДНК-комет в зависимости от концентра-

и 24 ч (рис. 1, кривые 2 и 3). Иными словами, мак-

ции аурумакрила и времени воздействия препа-

симальный цитотоксический эффект препарата

рата охарактеризовано кривыми, представленны-

наблюдается при воздействии в концентрации

ми на рис. 2.

1000 мкг/мл в течение 6 ч. Дальнейшее увеличе-

Приведенные данные свидетельствуют о том,

ние экспозиции до 24 ч не приводит к повыше-

что доля фрагментированной ДНК в хвосте ДНК-

нию цитотоксического эффекта аурумакрила в

комет зависит от концентрации аурумакрила, но

отношении лимфоцитарных клеток крови чело-

в большей степени - от времени воздействия пре-

века.

парата. Видно, что при экспозиции лимфоцитов с

Таким образом, показано, что расчетная доза

аурумакрилом в течение 1 ч доля фрагментиро-

препарата, летальная для 50% лимфоцитов (IC₅₀),

ванной ДНК практически не отличается от кон-

составляет 1000 мкг/мл (80 мкг/мл в пересчете на

трольного уровня, колеблющегося в пределах от

содержание золота) как при инкубации с ауру-

6 до 10%, при использовании всех концентраций

макрилом в течение 6 ч, так и при инкубации в те-

в изученном диапазоне (рис.

2, кривая

1).

чение 24 ч.

Доля фрагментированной ДНК в хвосте ДНК-

комет увеличивается до 22% при удлинении экс-

Отметим, что показатель цитотоксичности ау-

позиции до 6 ч, а при воздействии препарата в те-

румакрила IC₅₀для опухолевых клеток (MCF-7),

чение 24 ч - до 48% при применении препарата в

определенный в тесте с использованием красите-

концентрации 1000 мкг/мл, то есть в 2.2 и 4.8 раза

ля трипановый синий, составляет для аурумакри-

по сравнению с контролем (рис. 2, кривые 2 и 3

ла 720 мкг/мл (58 мкг/мл в пересчете на содержа-

соответственно).

ние золота).

Полученные данные свидетельствуют о суще-

Приведенные данные свидетельствуют о более

ственном влиянии аурумакрила на структуру

высокой цитотоксичности аурумакрила в отно-

ДНК лимфоцитов, выражающемся в увеличении

шении опухолевых клеток (культура MCF-7) по

доли фрагментированной ДНК, мигрирующей в

сравнению с нормальными клетками (лимфоци-

хвост ДНК-кометы, что может быть истолковано

ты крови) человека.

как способность препарата индуцировать одно-

Индукция аурумакрилом однонитевых разрывов

нитевые разрывы ДНК. При этом наибольший

ДНК. Известно, что при анализе структурных из-

эффект - увеличение доли фрагментированной

менений ДНК методом ДНК-комет доля фраг-

ДНК в лимфоцитах крови человека до 48% - на-

ментированной (получившей однонитевые раз-

блюдается при воздействии препарата в макси-

рывы) ДНК, мигрирующей во время электрофо-

мальной

из

изученных

концентраций

реза в геле агарозы к аноду и создающей так

1000 мкг/мл в течение 24 ч.

БИОФИЗИКА том 67

№ 6

2022

МЕХАНИЗМ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИАКРИЛАТА ЗОЛОТА

1161

Генерация аурумакрилом активных форм кисло-

рода. Содержание внутриклеточных АФК приня-

то оценивать в соответствии с показателем интен-

сивности флуоресценции клеток, обработанных

специфическим красителем

(5(6)-хлорометил-

2',7'-дихлордигидрофлуоресцеин

диацетатом)

[10].

Изменение интенсивности флуоресценции

лимфоцитов в зависимости от концентрации и

времени воздействия аурумакрила показано на

рис. 3.

Представленные данные свидетельствуют о

способности аурумакрила вызывать генерацию

внутриклеточных АФК. Причем выраженность

этого эффекта зависит как от концентрации пре-

парата, так и в большей степени от времени его

Рис. 3. Генерация активных форм кислорода в лимфо-

воздействия на клетки.

цитах крови человека под влиянием аурумакрила. Из-

Как видно, уровень АФК при инкубации лим-

менение интенсивности флюоресценции клеток в зави-

симости от концентрации и времени воздействия пре-

фоцитов с аурумакрилом в течение 1 ч и 6 ч дости-

парата. Время: 1 - 1 ч, 2 - 6 ч, 3 - 24 ч. По оси абсцисс -

гает максимальных значений, равных

0.70 и

концентрация аурумакрила, по оси ординат - интен-

0.85 отн. ед. соответственно, при применении

сивность флуоресценции лимфоцитов.

препарата в наибольшей из изученных концен-

траций (1000 мкг/мл) (рис. 3, кривые 1 и 2 соот-

ветственно).

влиянием препарата (1000 мкг/мл, инкубация

При инкубации лимфоцитов с аурумакрилом,

24 ч) в 4.8 раза по сравнению с контролем.

примененным в той же максимальной концен-

Аурумакрил обладает способностью вызывать

трации (1000 мкг/мл) в течение 24 ч уровень АФК

генерацию внутриклеточных АФК. Воздействие

достигает значения, равного 1.78 отн. ед. (рис. 3,

препарата (1000 мкг/мл, инкубация 24 ч) приво-

кривая 3).

дит к увеличению содержания АФК в лимфоци-

Значения показателя АФК в контроле колеб-

тах крови человека в шесть раз по сравнению с

лются в узком диапазоне, равном 0.27-0.30 отн.

контролем.

ед. (рис. 3).

При рассмотрении представленных результа-

Таким образом, показано, что воздействие ау-

тов необходимо подчеркнуть, что данные, полу-

румакрила (1000 мкг/мл) в течение 1, 6 и 24 ч

ченные с использованием культуры лимфоцитов

приводит к увеличению содержания АФК в лим-

крови человека, не могут быть однозначно истол-

фоцитах крови человека в 2.3, 2.8 и 6.0 раз соот-

кованы как свидетельство нежелательного токси-

ветственно, что является убедительным свиде-

ческого действия аурумакрила на нормальные

тельством влияния препарата на окислительно-

клетки.

восстановительные процессы в клетке.

В связи с вышесказанным уместно упомянуть

Анализируя результаты проведенного иссле-

о детальном обсуждении данного аспекта дей-

дования, отметим следующие экспериментально

ствия противоопухолевых препаратов, проведен-

установленные факты.

ном нами ранее по поводу обнаружения цитоток-

сического эффекта аурумакрила в отношении

Аурумакрил обладает определенным дозо- и

фибробластов кожи человека линии hFB-hTERT6

экспозиционно-зависимым цитотоксическим

[11].

действием на лимфоциты крови человека, менее

выраженным, однако, чем его летальный эффект

Отмечалось, что цитотоксичность по отноше-

в отношении опухолевых клеток. IC₅₀препарата

нию к нормальным клеткам свойственна многим

составляет 1000 мкг/мл (80 мкг/мл в пересчете на

конвенциальным противоопухолевым препара-

содержание золота) для лимфоцитов и 720 мкг/мл

там, что не явилась препятствием для внедрения в

(58 мкг/мл в пересчете на содержание золота) для

широкую клиническую практику эффективных

опухолевых клеток (MCF-7).

противоопухолевых средств, таких, в частности,

как цисплатина и доксорубицин.

Аурумакрил оказывает деструктивное дей-

ствие на ДНК лимфоцитов крови человека, инду-

Согласно существующим представлениям не

цируя однонитевые разрывы в структуре макро-

следует рассматривать выявляемую в опытах

молекулы. Доля фрагментированной ДНК, опре-

in vitro непосредственную цитотоксичность в от-

деленная методом ДНК-комет, возрастает под

ношении нормальных клеток в качестве указания

БИОФИЗИКА том 67

№ 6

2022

1162

ЧИГАСОВА и др.

на отсутствие селективности действия препарата

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

по отношению к опухоли in vivo.

1. Л. А. Островская, Д. Б. Корман, Н. В. Блюхтерова

При этом естественно вопрос о клинической

и др., Хим. физика, 38 (12), 64 (2019).

безопасности препарата может быть решен толь-

2. Л. А. Островская, Д. Б. Корман, Н. В. Блюхтерова

ко после проведения стандартного доклиниче-

и др., Рос. биотерапевтич. журн., 19 (4), 74 (2020).

ского токсикологического изучения в специаль-

3. Л. А. Островская, Д. Б. Корман, А. К. Грехова и др.,

ных экспериментах.

Биофизика,

(3),

598

(2017).

DOI:

10.1134/S0006350917030150

В заключение отметим, что полученные в про-

веденном исследовании результаты расширяют

4. Л. А. Островская, Д. Б. Корман, Е. И. Некрасова

представление о механизме действия аурумакри-

и др., Биофизика,

(5),

978

(2021). DOI:

ла как потенциального противоопухолевого пре-

10.31857/S0006302921050161

парата и имеют определенное значение для пони-

5. Л. А. Островская, Д. Б. Корман, Е. И. Некрасова и

мания механизма действия биологически актив-

др., Биофизика,

(1),

(2022). DOI:

ных золотосодержащих соединений в целом.

10.31857/S0006302922010070

6. Л. А. Островская, Д. Б. Корман, Е. И. Некрасова

и др., Биофизика 67 (5), 947 (2022).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

7. А. К. Чигасова, Л. А. Островская и Д. Б. Корман,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

Биофизика, 67 (6), (2022).

интересов.

8. Д. Б. Корман, Л. А. Островская и В. А. Кузьмин,

Вопр. онкологии, 64 (6), 697 (2018).

9. Д. Б. Корман, Л. А. Островская, Н. В. Блюхтерова

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

и др., Биофизика,

(6)

1229

(2021). DOI:

10.31857/S000630292106020X

Исследование было проведено без риска для

здоровья людей с соблюдением всех принципов

10. Y. Nakajima, K. Tsuruma, M. Shimazawa, et al., BMC

гуманности и этических норм (Хельсинкская де-

Complement Altern. Med., 9, 4 (2009).

кларация WMA, 2013 г.). От всех участников экс-

11. Д. Б. Корман, Е. И. Некрасова, Л. А. Островская и

периментов было получено информированное

др., Биофизика,

(6),

1093

(2020). DOI:

согласие на проведение исследования.

10.31857/S0006302920060071

Mechanism of Cytotoxic Activity of Aurum Polyacrylate

against Human Blood Lymphocytes

A.K. Chigasova*, L.A. Ostrovskaya*, and D.B. Korman*

*Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, ul. Kosygina 4, Moscow, 119334 Russia

This study focused on an exploration of the mechanism of action of aurum polyacrylate (aurumacryl) on hu-

man blood lymphocytes, including an assessment of the effect of the drug on cell viability, DNA structure

and the ability of the drug to induce reactive oxygen species. It was found that aurumacryl exhibited a dose-

and exposure-dependent cytotoxic activity, caused single-stranded DNA breaks and induced generation of

intracellular reactive oxygen species.

Keywords: aurum polyacrylate (aurumacryl), human lymphocytes, cytotoxicity, single-stranded DNA breaks, re-

active oxygen species

БИОФИЗИКА том 67

№ 6

2022