БИОФИЗИКА, 2022, том 67, № 6, с. 1185-1191

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 577.3

МЕХАНИЗМ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИАКРИЛАТА

ЗОЛОТА НА ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ

*Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, ул. Косыгина, 4, Москва, 119334, Россия

^#Е-mail: larros@list.ru

Поступила в редакцию 12.08.2022 г.

После доработки 12.08.2022 г.

Принята к публикации 22.08.2022 г.

Проведено исследование роли апоптоза в индуцируемом полиакрилатом золота (аурумакрилом)

процессе гибели опухолевых клеток, а также изучение влияния препарата на структуру ДНК клеток

карциномы молочной железы человека MCF-7. Установлено, что аурумакрил, будучи активным

цитотоксическим агентом, вызывает гибель клеток, изменение их морфологической структуры,

индуцирует сшивки в молекуле ДНК. Показано, что апоптоз не является доминирующим

механизмом в индуцированной аурумакрилом гибели клеток.

Ключевые слова: полиакрилат золота (аурумакрил), культура клеток MCF-7 цитотоксичность,

апоптоз, сшивки ДНК.

DOI: 10.31857/S0006302922060151, EDN: LKVLQG

Металлоцены, содержащие благородные ме-

Согласно существующим представлениям зо-

таллы - золото и серебро, - весьма широко ис-

лотосодержащие соединения относят к потенци-

следуются в последние годы в качестве веществ,

альным противоопухолевым агентам с мульти-

проявляющих разностороннюю биологическую,

таргетным механизмом действия, способным вы-

в том числе противоопухолевую активность [1, 2].

зывать как некротическую, так и апоптотическую

Особое место среди такого рода веществ зани-

гибель клеток, влиять на пролиферативные и

мает полиакрилат золота (аурумакрил), представ-

окислительно-восстановительные процессы в

ляющий собой единственное из изученных пре-

опухоли, воздействуя на ДНК и антиоксидантные

паратов соединение на полимерной основе, со-

ферменты (тиоредоксин редуктаза) в опухолевых

держащее наноструктурированное золото [3, 4].

клетках [1, 2].

Показано, что аурумакрил проявляет значи-

Ранее нами было установлено, что аурумак-

тельную противоопухолевую активность на моде-

рил, обладая выраженным цитотоксическим эф-

лях солидных опухолей животных (карцинома

фектом, вызывает также значительные измене-

легких Льюис, аденокарцинома Акатол, адено-

ния в кинетике клеточной пролиферации выжив-

карцинома Са-755) in vivo, а также обладает цито-

шей фракции опухолевых клеток. Воздействие

токсической эффективностью в отношении кле-

аурумакрила приводило к накоплению клеток в

точных линий опухолей человека (рак молочной

фазе пролиферативного покоя G₀,снижению до-

железы MCF-7, рак легкого А-549, рак толстой

ли делящихся клеток и к утрате выжившими клет-

кишки HCT116, меланома Mel Me) in vitro [5-9].

ками репродуктивной способности [7].

Принципиальные отличия в физико-химиче-

Задача представленной работы состояла в

ской структуре аурумакрила от других широко ис-

оценке роли апоптоза в индуцируемом аурумак-

следуемых металлокомплексов дают основания

рилом процессе гибели опухолевых клеток и в

полагать, что, возможно, мишени и механизмы

изучении влияния препарата на структуру ДНК

реализации противоопухолевого эффекта ауру-

клеток карциномы молочной железы человека

макрила иные, чем у ряда известных лекарствен-

MCF-7.

ных средств, в частности, таких как цисплатина.

Экспериментальным подтверждением такого ро-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

да соображений могут служить полученные нами

данные об отсутствии перекрестной резистентно-

Препарат. Исследовавшийся препарат ауру-

сти между аурумакрилом и цисплатиной [10].

макрил представляет собой неполную золотую

1185

1186

ЧИГАСОВА и др.

соль полиакриловой кислоты, содержащую

зию. Затем в равных пропорциях смешивали рас-

8 масс. % ионов металла, отвечает общей формуле

твор 0.4%-го трипанового синего и клеточной

(-CH₂-CHCOOH-)_n(-CH₂CHCOOAuCl₃H-)_m,

суспензии, смесь ресуспендировали и непосред-

где n = 12000-35000, m = 1650-6650. Молекуляр-

ственно после этого оценивали клеточную гибель

ная масса полимера составляет 100-300 кДа. ИК-

путем подсчета окрашенных (погибших) клеток в

спектры препарата содержат полосы поглощения

камере Горяева при анализе 500 клеток для каж-

карбоксильной и карбоксилатной групп при 1720

дой точки [7].

и 1570 см^-1. Субстанция препарата представляют

Полученные данные представлены в виде кри-

собой стекловидные пластинки золотистого цве-

вых, характеризующих изменение доли погибших

та, хорошо растворимые в воде [3]. Оценка эф-

после воздействия аурумакрила клеток по отно-

шению к контролю в зависимости от концентра-

фектов препарата in vitro проведена при его при-

менении в концентрациях, изменяющихся в диа-

ции препарата.

пазоне от 1 до 1000 мкг/мл.

Морфологический анализ клеток. Морфологи-

ческие изменения клеток MCF-7 под влиянием

Культура клеток. Эксперименты проведены с

аурумакрила фиксировали на микрофотоизобра-

использованием культуры клеток рецептор-по-

жениях клеток, полученных с помощью инверти-

ложительной карциномы молочной железы чело-

рованного микроскопа СКХ 41 SF (Olympus, Япо-

века MCF-7, полученной из банка опухолей

ния), оснащенного CCD камерой Infinity 3-1 и

НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина (Москва).

объективом 20× (Lumenera Corp., Канада).

Культивирование клеток проводили в стан-

Анализ апоптотической гибели клеток. Для

дартной культуральной среде DMEM/F12 (Life

определения пути гибели клеток линии MCF-7

Technologies Thermo Fisher Scientific, США) с до-

под влиянием аурумакрила использовали метод

бавлением 2 мM L-глутамина («ПанЭко», Рос-

оценки доли апоптотических клеток среди всех

сия), 100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрепто-

погибших клеток с помощью ДНК-связывающе-

мицина («ПанЭко», Россия) и 10% фосфатно-со-

го флуоресцентного красителя YO-PRO-1, кото-

левого буфера (Life Technologies Thermo Fisher

рый избирательно проникает через мембрану

Scientific, США) путем термостатирования при

только апоптотических клеток.

37°C в 5% CO₂ (CO₂-инкубатор MCO-18AC, San-

Данный метод основан на представлениях о

yo, Япония). В дальнейшем клетки снимали с по-

том, что в период апоптоза активируется рецеп-

верхности флаконов 0.25%-м раствором трипси-

тор P2X7 неселективного катионного канала

на-ЭДТА («ПанЭко», Россия) и пассировали с

P2X7R, управляемого аденозинтрифосфатом, что

плотностью 200 клеток/см² в той же культураль-

приводит к превращению этого канала в цитоли-

ной среде. Пассирование клеток проводили при

тическую пору [11]. Некоторые красители, такие

достижении культурой 80-90% монослоя. Замену

как флуоресцентный краситель YO-PRO-1, могут

среды осуществляли каждые четверо суток.

проникать внутрь этих пор, после чего клетки на-

Экспериментальное изучение аурумакрила

чинают флуоресцировать в зеленой области спек-

проведено на клетках, находящихся в фазе экспо-

тра, тогда как другие красители, такие как йоди-

ненциального роста (плотность клеточной попу-

стый пропидий, не обладают этим свойством в

ляции ~ 80%). Клетки снимали с пластика раство-

данных условиях. Таким образом, YO-PRO-1 мо-

ром трипсина-ЭДТА с последующей инактива-

жет служить ранним маркером апоптотической

цией трипсина и отмывкой клеток в полной

гибели клеток [12]. Добавление йодистого пропи-

среде. Клетки пассировали в чашки Петри диа-

дия позволяет дифференцировано окрасить по-

метром 35 мм, содержащие покровные стекла

гибшие клетки, флуоресцирующие после окраски

(SPL Lifesciences, Южная Корея). Действие ауру-

в красной области спектра. Через мембрану жи-

макрила в различных концентрациях (1, 10, 100 и

вых клеток эти красители не проникают.

1000 мкг/мл) изучено при инкубации клеток с

Оценку доли клеток на ранней стадии апопто-

препаратом при 37°С в течение 1, 6 и 24 ч, при па-

за проводили с использованием коммерческого

раллельном инкубировании интактных клеток в

набора Vybrant Apoptosis Assay Kit № 4 с флуорес-

качестве контроля [7].

центными красителями YO-PRO-1 и йодистым

Оценка цитотоксического эффекта. Исследова-

пропидием (Invitrogen, США). Клетки окрашива-

ние цитотоксичности аурумакрила в отношении

ли в соответствии с протоколом производителя.

клеток MCF-7 проведено в тесте с использовани-

В исследуемые временные точки (через 1, 6 и

ем 0.4%-го раствора трипанового синего, воспри-

24 ч после воздействия аурумакрила) клетки два-

имчивость к которому характеризует жизнеспо-

жды промывали раствором Хенкса и снимали их с

собность клеток.

поверхности чашек 0.25%-м раствором трипси-

Клетки дважды отмывали от среды фосфатно-

на-ЭДТА. Затем к 1 мл клеточной суспензии в

солевым буфером (рН 7.4), снимали с чашек рас-

растворе Хенкса добавляли по 1 мкл раствора YO-

твором трипсина-ЭДТА и переводили в суспен-

PRO-1 и йодистого пропидия из упомянутого

БИОФИЗИКА том 67

№ 6

2022

МЕХАНИЗМ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИАКРИЛАТА ЗОЛОТА

1187

фореза (раствор для щелочной денатурации и

электрофореза: NaOH

100

ммоль/л,

Na₂ЭДТА - 1 ммоль/л, рН 12.5; стабилизация по

напряжению - 2 В/см; 20 мин при 4°С) и с даль-

нейшей нейтрализацией в течение 3-5 мин в

0.4 моль/л трис-HCl-буфере при 4°С. Для окрас-

ки ДНК использовали акридиновый оранжевый

(2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, рН 7.4).

Визуализацию и документирование ДНК-комет

проводили на люминесцентном микроскопе

Eclipse Ni-U (Nikon, Япония), оснащенным ви-

деокамерой ProgRes CFcool (Jenoptik AG, Герма-

ния). Для анализа и обработки микрофотоизоб-

ражений ДНК-комет использовали программу

CASP 1.2.2 (СASPlab, Польша).

Статистическую обработку полученных ре-

Рис. 1. Изменение доли погибших опухолевых клеток

зультатов проводили с помощью программы Sta-

культуры MCF-7 в зависимости от концентрации и

tistica 7.0. Результаты представлены как среднее

времени воздействия аурумакрила: 1 - инкубация 1 ч,

2 - инкубация 6 ч, 3 - инкубация 24 ч.

из пяти независимых результатов ± стандартная

ошибка.

коммерческого набора. Клетки инкубировали

20 мин при 4°С, ресуспендировали и помещали в

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

камеру Горяева для подсчета апоптотических

В продолжение исследования механизма дей-

клеток. Подсчет клеток в апоптозе проводили с

ствия аурумакрила в данной работе представлены

помощью люминеcцентного микpоcкопа Eclipse

результаты изучения влияния препарата на жиз-

Ni-U (Nikon, Япония) со следующими cвето-

неспособность и морфологию клеток карциномы

фильтpами: B-2E/C с излучением зеленой флуо-

молочной железы человека MCF-7, их апоптоти-

ресценции для YO-PRO-1 (возбуждение на 465-

ческую гибель и структуру ДНК.

495 нм и эмиccия на 515-555 нм) и Y-2E/C с ис-

пусканием красной флуоресценции для йодисто-

Цитотоксичность аурумакрила. Установлено,

го пропидия (возбуждение на 540-580 нм и эмиc-

что аурумакрил обладает цитотоксическим дей-

cия на 600-660 нм). Анализировали по 300 клеток

ствием на опухолевые клетки, вызывая их гибель,

для каждой точки.

выраженность которой зависит от времени воз-

действия препарата и его концентрации. Макси-

Анализ сшивок ДНК. Изучение влияния ауру-

мальный эффект - гибель 61% клеток - наблюда-

макрила на ДНК опухолевых клеток MCF-7 про-

ется через 24 ч после воздействия аурумакрила в

водили путем детектирования сшивок ДНК с ис-

концентрации 1000 мкг/мл (рис. 1)

пользованием метода ДНК-комет в щелочных

Расчетная доза, летальная для 50% опухолевых

условиях.

), определенная в тесте с использова-

клеток (IC₅₀

Клетки инкубировали с аурумакилом в диапа-

нием красителя трипановый синий, составляет

зоне концентраций от 1 до 500 мкг/мл в течение

для аурумакрила 720 мкг/мл (58 мкг/мл в пересче-

1 ч при 37°С. Затем клетки дважды отмывали от

те на содержание золота).

среды фосфатно-солевым буфером (рН 7.4), сни-

мали с чашек раствором трипсина-ЭДТА и пере-

Следует отметить, что ранее при оценке цито-

токсичности аурумакрила с помощью МТТ-теста

водили в суспензию, содержащую 1×10⁶ клеток в

было установлено, что коэффициент IC₅₀препа-

1 мл. Суспензию контрольных или обработанных

рата составляет 125 мкг/мл (10 мкг/мл в пересчете

полиакрилатом золота клеток смешивали с 1%-м

на содержание золота) [12].

раствором легкоплавкой агарозы при 37.5°С (1:1)

и наносили по 75 мкл на предметные стекла,

Можно полагать, что столь существенные от-

предварительно покрытые 1%-м раствором нор-

личия в показателях цитотоксического эффекта

моплавкой агарозы, после чего накрывали по-

препарата отражают разницу в чувствительности

кровным стеклом и выдерживали 10 мин при 4°С.

примененных методов оценки гибели клеток, в

Затем в течение 1 ч клетки подвергали лизису при

основе которых лежит использование различных

4°С (лизирующий буфер: NaCl - 2.5 моль/л, трис-

реагентов - трипанового синего и МТТ, и не ока-

HCl - 20 ммоль/л, Na₂ЭДТА - 100 ммоль/л,

зывают принципиального влияния на оценку ау-

ДМСО - 10%, Triton-X100 - 1%) и щелочной де-

румакрила как высокоактивного цитотоксиче-

натурации с последующим проведением электро-

ского агента.

БИОФИЗИКА том 67

№ 6

2022

1188

ЧИГАСОВА и др.

Рис. 2. Микрофотографии клеток MCF-7 после инкубации с аурумакрилом (1000 мкг/мл) в течение 1 ч (а), 6 ч (б) и 24 ч (в).

Влияние аурумакрила на морфологическую

клеток среди общего числа погибших клеток для

структуру клеток. Воздействие аурумакила в кон-

всех изученных концентраций препарата. Наибо-

центрации 1000 мкг/мл вызывает изменения в

лее значительное снижение доли апоптотических

морфологической структуре клеток MCF-7.

клеток отмечено при 24-хчасовой инкубации,

при которой регистрировалась наибольшая ги-

Как видно из представленных на рис. 2 микро-

бель клеток.

фотографий, уже через 6 ч инкубации с препара-

том клетки приобретают несвойственную им

Полученные данные позволяют предполо-

округлую форму (рис. 2б), а через 24 ч - сжима-

жить, что гибель клеток, индуцированная ауру-

ются и уменьшаются в размерах (рис. 2в).

макрилом, происходит не благодаря развитию

апоптоза, а является следствием других процес-

Механизм гибели клеток под влиянием аурумак-

сов, возможно, связанных с нарушением митоти-

рила. Изменения доли апоптотических клеток

ческого цикла клеток, о чем упоминалось ранее

среди погибших клеток в зависимости от концен-

трации и времени воздействия аурумакрила ха-

[7].

рактеризуют данные, представленные на рис. 3.

Известно, что одним из механизмов цитоток-

Как видно, при увеличении времени инкуба-

сичности наночастиц золота может быть блок

ции клеток с аурумакрилом с 1 до 24 ч наблюдает-

клеточного цикла. В ряде исследований показано

ся закономерное снижение доли апоптотических

блокирование клеток в G₁-фазе, накопление кле-

Рис. 3. Изменение доли апоптотических клеток среди общего числа погибших клеток MCF-7 в зависимости от

концентрации и времени воздействия аурумакрила.

БИОФИЗИКА том 67

№ 6

2022

МЕХАНИЗМ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИАКРИЛАТА ЗОЛОТА

1189

ле агарозы к аноду и создающей так называемый

«хвост» ДНК-комет, регистрируется путем оцен-

ки показателя электрофоретической подвижно-

сти ДНК.

Как видно из данных, представленных на

рис. 4, воздействие аурумакрила в концентрации

500 мкг/мл приводит к снижению доли неповре-

жденной и фрагментированной ДНК в хвосте ко-

меты. Доля ДНК в хвосте ДНК-комет под влия-

нием препарата снижается примерно в четыре ра-

за - с 31.2%, регистрируемых в контрольном

образце, до 7.4%, определяемых в клетках, под-

вергавшихся воздействию аурумакрила в концен-

трации 500 мкг/мл (рис. 4). Соответственно воз-

растает доля «сшитой» ДНК, остающейся в голо-

Рис. 4. Изменение доли ДНК в хвосте ДНК-комет

ве ДНК-кометы и не мигрирующей к аноду.

клеток MCF-7 в зависимости от концентрации

аурумакрила.

Полученные данные свидетельствуют о выра-

женном влиянии аурумакрила на структуру ДНК

опухолевых клеток, выражающемся в индуциро-

ток в фазе G₀/G₁и уменьшение содержания кле-

вании препаратом сшивок ДНК.

ток в S- и G₂/M-фазах под влиянием золотосо-

Морфологические изменения, происходящие

держащих препаратов [1, 2].

с клетками MFC-7 под влиянием аурумакрила,

наглядно иллюстрируют микрофотографии

Нами, в частности, было показано, что ауру-

ДНК-комет (рис. 5).

макрил вызывает значительные изменения в кле-

точной кинетике опухоли. Так, доля «покоящих-

В контроле отчетливо виден «хвост» ДНК-ко-

ся» клеток через 24 ч инкубации с аурумакрилом

меты, содержащий неповрежденную ДНК, выход

возрастает с 40%, наблюдающихся в контроле, до

которой составляет более 30% (рис. 5а), в то время

93%, регистрируемых на этот срок при воздей-

как после воздействия аурумакрила наблюдается

ствии препарата в дозе 1000 мкг/мл. Наряду с

практически полное исчезновение

«хвостов»

этим среди выживших клеток наблюдается

ДНК-комет и сжимание, уменьшение в размерах

уменьшение под влиянием аурумакрила доли де-

ядер у основного количества клеток (рис. 5б).

лящихся клеток с 60%, регистрируемых в это вре-

Распределение клеток карциномы молочной

мя в контроле, до 7%, что было расценено как ре-

железы MFC-7 в соответствии с долей ДНК, со-

продуктивная гибель клеток [7].

держащейся в хвосте ДНК-комет через 1 ч после

инкубации с аурумакрилом (500 мкг/мл), показа-

Индукция сшивок ДНК аурумакрилом. Извест-

но на рис. 6.

но, что при анализе структурных изменений ДНК

методом ДНК-комет доля фрагментированной

Как видно, около 70% клеток карциномы мо-

ДНК, мигрирующей во время электрофореза в ге-

лочной железы MFC-7 в контроле после проведе-

Рис. 5. Микрофотографии ДНК-комет клеток карциномы молочной железы MFC-7: (а) - контроль, (б) - аурумакрил

(500 мкг/мл, инкубация 1 ч). Напряженность электрического поля 2.0 В/см.

БИОФИЗИКА том 67

№ 6

2022

1190

ЧИГАСОВА и др.

Рис. 6. Распределение клеток аденокарциномы молочной железы MFC-7 в соответствии с содержанием ДНК в хвосте

ДНК-комет после воздействия аурумакрила в различных концентрациях (инкубация 1 ч).

ния электрофореза содержали более 25% ДНК в

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

хвосте ДНК-комет.

Настоящая статья не содержит каких-либо ис-

следований с участием людей или животных в ка-

Аналогичное распределение клеток в соответ-

честве объектов исследований.

ствии с содержанием ДНК в хвосте ДНК-комет

наблюдается для клеток, подвергавшихся в тече-

ние часа воздействию аурумакрила в концентра-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

циях 10, 50 и 100 мкг/мл.

1. Д. Б. Корман, Л. А. Островская, Н. В. Блюхтерова

и др., Биофизика,

(6),

1229

(2021). DOI:

Иное распределение клеток наблюдается при

10.31857/S000630292106020X

воздействии аурумакрила в концентрации

2. Д. Б. Корман, Л.А. Островская и В. А. Кузьмин,

500 мкг/мл. Показано, что среди 60% проанали-

Вопр. онкологии, 64 (6), 697 (2018).

зированных клеток менее 5% клеток содержали

ДНК в хвосте ДНК-комет, что свидетельствует о

3. Л. А. Островская, Д. Б. Корман, Н. В. Блюхтерова

и др., Хим. физика, 38 (12), 64 (2019).

выраженной способности аурумакрила вызывать

сшивки в молекуле ДНК опухолевых клеток

4. Л. А. Островская, Д. Б. Корман, Н. В. Блюхтерова

(рис. 6).

и др., Рос. биотерапевтич. журн., 19 (4), 74 (2020).

5. L. A. Ostrovskaya, M. G. Voronkov, D. B. Korman,

Таким образом, в результате исследования

et al., J. Cancer Therapy, 1 (2), 59 (2010). DOI:

влияния аурумакрила на клетки карциномы мо-

10.4236/jct.2010.12010

лочной железы MFC-7 человека установлено:

6. Л. А. Островская, Д. Б. Корман, А. К. Грехова и др.,

Изв. РАН. Сер. хим., 66 (12), 2333 (2017).

- аурумакрил, будучи активным цитотоксиче-

ским агентом, вызывает гибель клеток и измене-

7. Л. А. Островская, Д. Б. Корман, А. К. Грехова и др.,

Биофизика,

(3),

598

(2017).

DOI:

ние их морфологической структуры;

10.1134/S0006350917030150

- апоптоз не является доминирующим меха-

8. Л. А. Островская, Д. Б. Корман, Е. И. Некрасова

низмом в индуцированной аурумакрилом гибели

и др., Биофизика,

(5),

978

(2021). DOI:

клеток;

10.31857/S0006302921050161

9. Л. А. Островская, Д. Б. Корман, Е. И. Некрасова

- молекулярный механизм действия аурумак-

и др., Биофизика,

(1),

(2022). DOI:

рила на опухолевые клетки связан с индукцией

10.31857/S0006302922010070

сшивок в молекуле ДНК.

10. Л.А. Островская, Д.Б. Корман, Е.И. Некрасова

и др., Биофизика, 67 (5), 951 (2022).

11. R. Kopp, A. Krautloher, A. Ramírez-Fernández, et al.,

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Front. Mol. Neurosci., 12, 183 (2019).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

12. S. Fujisawa, Y. Romin, A. Barlas, et al., Cytotechnolo-

интересов.

gy, 66, 259 (2013).

БИОФИЗИКА том 67

№ 6

2022