БИОФИЗИКА, 2023, том 68, № 1, с. 11-19

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.3

ИНДУКЦИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ СТРУКТУРЫ ДНК ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

ПОЛИАКРИЛАТОМ ЗОЛОТА

*Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, ул. Косыгина, 4, Москва, 119334, Россия

^#Е-mail: larros@list.ru

Поступила в редакцию 14.10.2022 г.

После доработки 14.10.2022 г.

Принята к публикации 18.10.2022 г.

Изучена способность полиакрилата золота (аурумакрила) вызывать изменения в структуре ДНК

опухолевых клеток (на примере культуры клеток карциномы молочной железы человека MCF-7).

Установлено, что молекулярный механизм действия аурумакрила на опухолевые клетки связан с

индукцией однонитевых разрывов и сшивок в молекуле ДНК. Наряду с этим показана способность

аурумакрила снижать число спонтанных либо индуцированных облучением двухнитевых разрывов

ДНК в опухолевых клетках MCF-7.

Ключевые слова: полиакрилат золота (аурумакрил), культура клеток MCF-7, однонитевые разрывы

ДНК, двухнитевые разрывы ДНК, сшивки ДНК.

DOI: 10.31857/S0006302923010027, EDN: NYQIWK

Современные подходы к разработке и изуче-

Полученные результаты указывают на необхо-

нию новых противоопухолевых препаратов

димость исследования механизмов действия ау-

включают в себя обязательное установление ми-

румакрила и установление мишеней, взаимодей-

шеней, на которые направлено действие изучае-

ствие с которыми включает эти механизмы.

мого соединения, а также механизмов этого дей-

Одной из ключевых внутриклеточных мише-

ствия.

ней, воздействие на которую может приводить к

В последние годы внимание исследователей,

гибели опухолевых клеток, является ДНК, что

разрабатывающих инновационные подходы к ле-

подтверждает многолетний клинический опыт

карственному лечению злокачественных опухо-

использования алкилирующих противоопухоле-

лей, привлекают комплексные соединения благо-

вых препаратов, до сих пор входящих в арсенал

родных металлов, в первую очередь, золотосодер-

основных лекарственных средств, применяемых

жащие соединения, для многих из которых

для лечения разнообразных опухолей [7].

установлена существенная цитотоксичность и

Известно, что в результате структурных повре-

противоопухолевая активность, свидетельствую-

ждений ДНК, могут возникать одно- и двухните-

щие о перспективности изучения такого рода ве-

вые разрывы ДНК, а также ДНК-сшивки, кото-

ществ в качестве лекарственных средств для лече-

рые в случае отсутствия или дефектности репара-

ния злокачественных опухолей. В то же время

ции этих повреждений ведут к гибели клетки.

сведения о мишенях и механизмах действия этих

Целью настоящего исследования было изуче-

препаратов пока достаточно противоречивы, что

ние способности аурумакрила индуцировать раз-

указывает на необходимость проведения иссле-

рывы ДНК и образование ДНК-сшивок в опухо-

дований в данном направлении [1, 2].

левых клетках (культура клеток карциномы мо-

Ранее нами было установлено, что, оригиналь-

лочной железы человека MCF-7).

ное золотосодержащее соединение - полиакри-

лат золота (аурумакрил) - представляющее собой

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

золотосодержащий полимер, оказывает выра-

женное цитотоксическое действие на культуры

Препарат. Исследовавшийся препарат ауру-

клеток ряда опухолей человека in vitro и обладает

макрила представляет собой неполную

противоопухолевой активностью, зарегистриро-

золотую соль полиакриловой кислоты, содержа-

щую 8 массовых процентов (8 масс. %) ионов ме-

ванной на нескольких штаммах перевиваемых

опухолей мышей in vivo [3-6].

талла, отвечает общей формуле

(-CH₂-CH-

ЧИГАСОВА и др.

COOH-)_n(-CH₂CHCOOAuCl₃H-)_m, где n

4°С в течение 10 мин. Затем в течение 60 мин

= 12000-35000, m = 1650-6650. Молекулярная

клетки подвергали лизису при 4°С (лизирующий

масса полимера составляет 100-300 кДа. ИК-

буфер: 2.5 моль/л NaCl, 20 ммоль/л трис-HCl,

спектры препарата содержат полосы поглощения

100 ммоль/л Na₂ЭДТА, 10% диметилсульфокси-

карбоксильной и карбоксилатной групп при 1720

да, 1% Triton X100) и щелочному электрофорезу

(раствор для электрофореза: 300 ммоль/л NaOH,

и 1570 см^-1 соответственно. Субстанция препара-

1 ммоль/л Na₂ЭДТА, рН >13; стабилизация по

та представляет собой стекловидные пластинки

золотистого цвета, хорошо растворимые в воде.

напряжению - 0.75 В/см; 20 мин при 4°С) с даль-

Оценка эффектов препарата in vitro проведена

нейшей нейтрализацией в течение 3-5 мин в

при его применении в концентрациях, изменяю-

0.4 моль/л трис-HCl-буфере при 4°С. Для окрас-

щихся в диапазоне от 1 до 1000 мкг/мл.

ки ДНК использовали краситель акридиновый

оранжевый (2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфе-

Культура клеток. Эксперименты проведены с

ре, рН 7.4). Визуализацию и документирование

использованием культуры клеток рецептор-по-

ДНК-комет проводили на люминесцентном мик-

ложительной карциномы молочной железы чело-

роскопе Eclipse Ni-U (Nikon, Япония), оснащен-

века MCF-7, полученной из банка опухолей ФГ-

ном видеокамерой ProgRes CFcool (Jenoptik AG,

БУ НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина.

Германия). Для анализа и обработки микрофото-

Культивирование клеток проводили в стан-

изображений ДНК-комет использовали програм-

дартной культуральной среде DMEM/F12 (Life

му CASP 1.2.2 (СASPlab, Польша).

Technologies Thermo Fisher Scientific, США) с до-

Образование однонитевых разрывов в струк-

бавлением 2 мM L-глутамина («ПанЭко», Рос-

туре ДНК определяли по уровню миграции ДНК

сия), 100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрепто-

в геле агарозы, используя показатель «процент

мицина («ПанЭко», Россия) и 10% FBS (Life

ДНК в хвосте ДНК-комет». Влияние аурумакри-

Technologies Thermo Fisher Scientific, США) пу-

ла на образование однонитевых разрывов ДНК

тем термостатирования при 37°C в 5% CO₂ (MCO-

оценивали, сравнивая показатель «процент ДНК

18AC, Sanyo, Япония). В дальнейшем клетки сни-

в хвосте ДНК-комет» в обработанных препаратом

мали с поверхности флаконов 0.25%-м раствором

золота клетках с аналогичным показателем в кон-

трипсина-ЭДТА («ПанЭко», Россия) и пассиро-

трольных клетках. Превышение этого показателя

вали с плотностью 200 кл/см² в той же культу-

в клетках, инкубированных с арумакрилом, по

ральной среде. Пассирование клеток проводили

сравнению с контрольными клетками свидетель-

при достижении культурой 80-90% монослоя.

ствует о том, что аурумакрил в исследуемой кон-

Замену среды осуществляли каждые четверо

центрации индуцирует однонитевые разрывы.

суток.

Анализ двухнитевых разрывов ДНК. Для выяс-

нения способности аурумакрила индуцировать

Экспериментальное изучение аурумакрила

двухнитевые разрывы ДНК использовали имму-

проведено на клетках, находящихся в фазе экспо-

ноцитохимический метод определения в клетках

ненциального роста (плотность клеточной попу-

фокусов фосфорилированного гистона H2AX

ляции ~70-80%). Клетки снимали с пластика

(γН2АХ), детектирующего двухнитевой разрыв

раствором трипсина-ЭДТА с последующей инак-

ДНК. Полагают, что один фокус Н2АХ соответ-

тивацией трипсина и отмывкой клеток в полной

ствует сайту репарации одного двухнитевого раз-

среде. Клетки пассировали в 35 мм чашки Петри,

рыва ДНК.

содержащие покровные стекла (SPL Lifesciences,

Южная Корея). Действие аурумакрила в различ-

Количественный анализ фокусов γH2AX в на-

ных концентрациях (1, 10, 100 и 1000 мкг/мл) изу-

стоящее время широко используется для изуче-

чено при инкубации клеток с препаратом при

ния радиационно-индуцированных двухнитевых

37°С в течение 1, 6 и 24 ч при параллельном инку-

разрывов ДНК, образующихся в большом коли-

бировании интактных клеток в качестве контроля

честве в клетках после облучения.

[8].

В ряде экспериментов по изучению способно-

Анализ однонитевых разрывов ДНК. Для анали-

сти аурумакрила влиять на двухнитевые разрывы

за однонитевых разрывов ДНК, индуцированных

ДНК нами было использовано облучение клеток

в качестве фактора, индуцирующего образование

аурумакрилом, использовали метод электрофо-

большого числа двухнитевых разрывов ДНК.

реза единичных клеток в щелочных условиях (ме-

тод ДНК-комет). Суспензию контрольных или

Для этого клетки, находящиеся в фазе экспо-

обработанных аурумакрилом клеток MCF-7 сме-

ненциального роста, предварительно инкубиро-

шивали с 1%-м раствором легкоплавкой агарозы

ванные с аурумакрилом в концентрациях 10, 50,

при 37.5°С (1:1) и наносили по 70 мкл на предмет-

100, 500 и 1000 мкг/мл при 37°С в течение 24 ч, об-

ные стекла, предварительно покрытые 1%-м рас-

лучали на рентгеновской биологической установ-

твором нормоплавкой агарозы, после чего на-

ке «РУСТ-М1» (ООО «Диагностика-М», Рос-

крывали покровным стеклом и выдерживали при

сия), оснащенной двумя рентгеновскими излуча-

БИОФИЗИКА том 68

№ 1

2023

ИНДУКЦИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ СТРУКТУРЫ ДНК

телями, в дозе 5 Гр (мощность дозы 0.85 Гр/мин,

пользованием метода ДНК-комет в щелочных

напряжение 100 кВ, ток 0.8 мА, фильтр 1.5 мм Al)

условиях.

при температуре 4°C (для охлаждения использо-

Клетки инкубировали с аурумакрилом в диа-

вались термогранулы «LAB ARMOR BEADS»,

пазоне концентраций от 1 до 500 мкг/мл в течение

Life Technologies Thermo Fisher Scientific, США).

часа при 37°С. Затем клетки дважды отмывали от

Погрешность отпускаемой дозы не превышала

среды фосфатно-солевым буфером (рН 7.4), сни-

15%. Облученные клетки инкубировали в стан-

мали с чашек раствором трипсина-ЭДТА и пере-

дартных условиях в СO₂-инкубаторе (37°C, 5%

водили в суспензию, содержащую 1·10⁶ клеток в

CO₂) в течение 24 ч с параллельной инкубацией

1 мл. Суспензию контрольных или обработанных

интактных клеток в качестве контроля, после че-

полиакрилатом золота клеток смешивали с 1%-м

го определяли уровень фокусов γН2АХ в соответ-

раствором легкоплавкой агарозы при 37.5°С (1 : 1)

ствии с приводимой ниже методикой.

и наносили по 70 мкл на предметные стекла,

Интактные и облученные клетки МСF-7 фик-

предварительно покрытые 1%-м раствором нор-

сировали на покровных стеклах параформальде-

моплавкой агарозы, после чего накрывали по-

гидом (4% в фосфатно-солевом буфере, рН 7.4) в

кровным стеклом и выдерживали 10 мин при 4°С.

течение 15 мин при комнатной температуре, по-

Затем в течение часа клетки подвергали лизису

сле чего дважды промывали фосфатно-солевым

при 4°С (лизирующий буфер: 2.5 моль/л NaCl,

буфером (рН 7.4) и пермеабилизировали 0.3%-м

20 ммоль/л трис-HCl, 100 ммоль/л Na2ЭДТА,

Тритон X100 в фосфатно-солевом буфере

10% диметилсульфоксида, 1% Triton X100) и ще-

(рН 7.4), содержащем 2% бычьего сывороточного

лочной денатурации с последующим проведени-

альбумина для блокирования неспецифического

ем электрофореза (раствор для щелочной денату-

связывания.

рации и электрофореза: 100 ммоль/л NaOH,

При проведении иммуноцитохимического

1 ммоль/л Na₂ЭДТА, рН 12.5; стабилизация по

окрашивания слайды инкубировали в течение ча-

напряжению - 2 В/см, 20 мин при 4°С) и с даль-

са при комнатной температуре с первичными ан-

нейшей нейтрализацией в течение 3-5 мин в

тителами к белку γН2АХ (разведение 1/200, клон

0.4 моль/л трис-HCl-буфере при 4°С. Для окрас-

EP854(2)Y, Merck-Millipore, США) в фосфатно-

ки ДНК использовали краситель акридиновый

солевом буфере (рН 7.4), содержащем 1% бычьего

оранжевый (2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфе-

сывороточного альбумина. Затем промывали

ре, рН 7.4). Визуализацию и документирование

фосфатно-солевым буфером (рН 7.4) и инкубиро-

ДНК-комет проводили на люминесцентном мик-

вали при комнатной температуре в течение часа с

роскопе Eclipse Ni-U (Nikon, Япония), оснащен-

вторичными антителами IgG (H + L), конъюги-

ном видеокамерой ProgRes CFcool (Jenoptik AG,

рованными с флуорохромами (антитела козы к

Германия). Для анализа и обработки микрофото-

белкам кролика, конъюгированные с Rhodamine

изображений ДНК-комет использовали програм-

(Merck-Millipore, США), в разведении 1/400) в

му CASP 1.2.2 (СASPlab, Польша).

фосфатно-солевом буфере (рН 7.4), содержащем

Статистическую обработку полученных ре-

1% бычьего сывороточного альбумина. Для

зультатов проводили с помощью программы Sta-

окраски ДНК и предотвращения фотовыцвета-

tistica 8.0. Результаты представлены как среднее

ния использовали содержащую DAPI заключаю-

из пяти независимых результатов ± стандартная

щую среду ProLong Gold (Life Technologies,

ошибка.

США).

Визуализацию, документирование и обработ-

РЕЗУЛЬТАТЫ

ку иммунноцитохимических микроизображений

осуществляли на люминесцентном микроскопе

Проведенное экспериментальное исследова-

Eclipse Ni-U (Nikon, Япония), оснащенном ви-

ние влияния аурумакрила на структуру ДНК кле-

деокамерой высокого разрешения ProgRes MF-

ток рака молочной железы человека MCF-7

cool (Jenoptik AG, Германия) с использованием

включает в себя оценку способности препарата

наборов светофильтров UV-2E/C (340-380 нм -

индуцировать одно- и двухнитевые разрывы, а

возбуждение и 435-485 нм - эмиссия), B-2E/C

также сшивки ДНК.

(465-495 нм - возбуждение и 515-555 нм - эмис-

Однонитевые разрывы ДНК. Влияние ауру-

сия) и Y-2E/C (540-580 нм - возбуждение и 600-

макрила на образование однонитевых разрывов

660 нм - эмиссия).

ДНК в клетках MCF-7 характеризуют данные,

Анализировали не менее 200 клеток на точку.

представленные на рис. 1.

Для подсчета количества фокусов γH2AX исполь-

Как видно, аурумакрил индуцирует образова-

зовали программу DARFI.

ние однонитевых разрывов ДНК при примене-

Анализ ДНК-сшивок. Изучение влияния ауру-

нии только в наибольшей из изученных концен-

макрила на ДНК опухолевых клеток MCF-7 про-

траций (1000 мкг/мл), причем этот эффект прак-

водили путем детектирования сшивок ДНК с ис-

тически не зависит от сроков инкубирования

БИОФИЗИКА том 68

№ 1

2023

ЧИГАСОВА и др.

долей ДНК в хвосте ДНК-комет более 20% увели-

чилось после 6 ч культивирования с аурумакри-

лом с ~ 3% в контроле до 47%. Примерно такое же

соотношение между числом клеток в хвосте

ДНК-комет для интактных и обработанных ауру-

макрилом клеток зарегистрировано и после ин-

кубирования в течение 24 ч - 6% и 47% соответ-

ственно (рис. 2).

Таким образом, очевидно, что аурумакрил в

концентрации 1000 мкг/мл индуцирует образова-

ние в опухолевых клетках линии MCF-7 однони-

тевых разрывов ДНК, число которых возрастает в

3.0-4.5 раза по сравнению со спонтанным уров-

нем разрывов ДНК, наблюдаемых в контроле,

уже через 1 ч инкубации и сохраняется на протя-

жении 24 ч культивирования клеток.

Двухнитевые разрывы ДНК. Способность ауру-

Рис. 1. Влияние аурумакрила на образование одноните-

макрила вызывать двухнитевые разрывы

вых разрывов ДНК в клетках MCF-7: изменение доли

ДНК охарактеризована в соответствии с показа-

ДНК в хвосте ДНК-комет в зависимости от концентра-

телем уровня фокусов фосфорилированного ги-

ции аурумакрила при различных сроках инкубации

стона H2AX (γН2АХ), регистрируемого в клетках

(кривая 1 - 1 ч, кривая 2 - 6 ч, кривая 3 - 24 ч).

MCF-7, подвергавшихся воздействию препарата,

по сравнению с контролем.

клеток с препаратом. Так, доля ДНК в хвосте ко-

Изменение уровня фокусов γН2АХ в ДНК

мет через 1, 6 и 24 ч инкубации клеток с препара-

опухолевых клеток после инкубации с различны-

том составляет 22, 24 и 26% соответственно, уве-

ми концентрациями аурумакрила в течение 24 и

личиваясь в 2.4, 4.7 и 4.5 раза по сравнению с кон-

48 ч показано на рис. 3.

тролем (рис. 1).

Как видно, культивирование клеток MCF-7 в

Этот эффект также наглядно иллюстрируют

течение 24 и 48 ч приводит к спонтанному образо-

данные диаграммы распределения клеток MCF-7

ванию двухнитевых разрывов ДНК, при котором

в соответствии с долей ДНК, содержащейся в

уровень фокусов γН2АХ имеет значения, равные

хвосте ДНК-комет, в контроле и при воздействии

1.92 и 2.17 соответственно (рис. 3).

аурумакрила (рис. 2). Как видно из представлен-

Влияние аурумакрила на уровень фокусов

ных на диаграмме данных, количество клеток с γН2АХ (двухнитевые разрывы ДНК), имеет дозо-

Рис. 2. Диаграмма распределения клеток MCF-7 в соответствии с долей ДНК, содержащейся в хвосте ДНК-комет, в

контроле (а) и при воздействии аурумакрила в концентрации 1 мг/мл (б) в зависимости от сроков инкубирования клеток с

препаратом.

БИОФИЗИКА том 68

№ 1

2023

ИНДУКЦИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ СТРУКТУРЫ ДНК

Рис. 3. Влияние аурумакрила на образование двухните-

Рис. 4. Влияние аурумакрила на уровень двухнитевых

вых разрывов ДНК в клетках MCF-7: изменение числа

разрывов ДНК, индуцированных облучением, в клетках

фокусов фосфорилированного гистона H2AX (γН2АХ)

MCF-7: изменение уровня фокусов фосфорилирован-

в зависимости от концентрации аурумакрила при инку-

ного гистона H2AX (γН2АХ) в зависимости от концен-

бации клеток в течение 24 ч (кривая 1) и 48 ч (кривая 2).

трации аурумакрила.

зависимый характер. При воздействии аурумак-

В то же время характер влияния аурумакрила

рила в концентрации 100 мкг/мл спонтанный

на количество фокусов γН2АХ в облученных

уровень двухнитевых разрывов ДНК практически

клетках практически не отличался от наблюдае-

не изменяется. Однако при увеличении концен-

мого в интактных клетках. Применение аурумак-

трации препарата до 500 и 1000 мкг/мл уровень

рила в концентрации 100 мкг/мл достоверно не

фокусов γН2АХ снижается до значений, состав-

изменило уровень фокусов γН2АХ в облученных

ляющих соответственно 0.7-0.8 и 0.1, при инку-

клетках при сохранении тенденции к увеличению

бации как в течение 24 ч, так и 48 ч (рис. 3).

этого параметра. Применение более высоких

концентраций аурумакрила (500 и 1000 мг/мл)

Иными словами, аурумакрил через 48 ч инку-

привело к резкому снижению уровня фокусов

бации с опухолевыми клетками вызывает сниже-

γН2АХ в облученных клетках до значений, со-

ние уровня спонтанных двухнитевых разрывов в

ставляющих 0.75 и 0.12 соответственно (рис. 4).

21 раз при применении в концентрациях как 500,

так и 1000 мкг/мл (рис. 3).

Таким образом, показано, что предваритель-

ное (до облучения) воздействие аурумакрила

Для того чтобы подтвердить способность ауру-

приводит к значительному снижению числа двух-

макрила снижать уровень двухнитевых разрывов

нитевых разрывов ДНК, индуцируемых облуче-

ДНК, нами были проведены эксперименты с ис-

нием. Уровень фокусов γН2АХ в облученных

пользованием облучения клеток в качестве фак-

клетках при применении аурумакрила в концен-

тора, индуцирующего образование большого

трациях 500 и 1000 мкг/мл снижается в 12.7 и

числа двухнитевых разрывов ДНК.

80 раз соответственно.

С этой целью клетки, предварительно инкуби-

Приведенные данные убедительно свидетель-

рованные в течение 24 ч с различными концен-

ствуют о способности аурумакрила снижать чис-

трациями аурумакрила, облучали на рентгенов-

ло спонтанных, либо индуцированных облучени-

ской биологической установке и определяли ко-

ем, двухнитевых разрывов ДНК в опухолевых

личество фокусов γН2АХ спустя 24 ч после

клетках MCF-7.

облучения.

ДНК-сшивки. Известно, что при использова-

Как видно из данных, приведенных на рис. 4,

нии метода ДНК-комет ДНК, мигрирующая во

облучение, действительно привело к значитель-

время электрофореза в геле агарозы к аноду, со-

ному возрастанию уровня двухнитевых разрывов

здает так называемый «хвост» ДНК-комет, кото-

ДНК. Количество фокусов γН2АХ в облученных

рый может содержать, в зависимости от условий

клетках, не подвергавшихся воздействию ауру-

проведения электрофореза, только фрагментиро-

макрила, составило 9.56, что примерно в 5 раз

ванную ДНК (одно- и двухнитевые разрывы

превышает спонтанный уровень двухнитевых

ДНК) или одновременно фрагментированную и

разрывов (равный ~2), возникающих в процессе

неповрежденную ДНК. В последнем случае доля

культивирования клеток (рис. 3 и 4).

ДНК, остающаяся в «голове» ДНК-кометы, ха-

БИОФИЗИКА том 68

№ 1

2023

ЧИГАСОВА и др.

ся воздействию аурумакрила. Соответственно,

возрастает доля «сшитой» ДНК, остающейся в го-

лове ДНК-кометы и не мигрирующей к аноду

(рис. 5).

Полученные данные свидетельствуют о выра-

женном влиянии аурумакрила на структуру ДНК

опухолевых клеток, выражающемся в индуциро-

вании препаратом сшивок ДНК.

Этот эффект наглядно иллюстрирует диаграм-

ма распределения клеток MCF-7 в соответствии с

долей ДНК, содержащейся в хвосте ДНК-комет

через 1 ч после инкубации с аурумакрилом, пока-

занная на рис. 6.

Как видно, около 70% интактных клеток кар-

циномы MCF-7 в контроле после проведения

электрофореза содержали более 25% ДНК в хво-

сте ДНК-комет.

Рис. 5. Влияние аурумакрила на образование сшивок

ДНК в клетках MCF-7: изменение доли ДНК в хвосте

Аналогичное распределение клеток в соответ-

ДНК-комет клеток MCF-7 в зависимости от

ствии с содержанием ДНК в хвосте ДНК-комет

концентрации аурумакрила.

наблюдается для клеток, подвергавшихся в тече-

ние часа воздействию аурумакрила в концентра-

циях 10, 50 и 100 мкг/мл.

рактеризует уровень ДНК-сшивок в анализиро-

ванных клетках.

Иное распределение клеток наблюдается при

воздействии аурумакрила в концентрации

Как видно из данных, представленных на

500 мкг/мл. Показано, что около 60% клеток со-

рис. 5, воздействие аурумакрила в течение часа

держали менее 5% ДНК в хвосте ДНК-комет, что

приводит к дозозависимому снижению доли не-

свидетельствует о выраженной способности ауру-

поврежденной и фрагментированной ДНК в

макрила вызывать сшивки в молекуле ДНК опу-

«хвосте» ДНК-комет. Доля ДНК в хвосте ДНК-

холевых клеток (рис. 6).

комет под влиянием препарата, примененного в

Очевидно, что представленные данные свиде-

концентрациях, не превышающих 100 мкг/мл,

тельствует о выраженной способности аурумак-

практически не отличается от контроля. В то же

рила вызывать сшивки в молекуле ДНК опухоле-

время в клетках, подвергавшихся воздействию

вых клеток.

аурумакрила в концентрации 500 мкг/мл, доля

ДНК в хвосте ДНК-комет снижается в ~ 4 раза -

Таким образом, в результате исследования

с 31.2%, регистрируемых в контрольном образце,

влияния аурумакрила на структуру ДНК клеток

до 7.4%, определяемых в клетках, подвергавших-

карциномы молочной железы человека MCF-7

Рис. 6. Распределение клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7 в соответствии с содержанием ДНК в хвосте

ДНК-комет после воздействия аурумакрила в различных концентрациях (время инкубации 1 ч).

БИОФИЗИКА том 68

№ 1

2023

ИНДУКЦИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ СТРУКТУРЫ ДНК

установлено, что молекулярный механизм дей-

Влияние золотосодержащих комплексов на

ствия аурумакрила на опухолевые клетки связан с

структуру ДНК изучено гораздо меньше, полу-

индукцией однонитевых разрывов и сшивок в

ченные результаты весьма противоречивы.

молекуле ДНК. Наряду с этим показана способ-

В большинстве исследований влияние золото-

ность аурумакрила снижать число спонтанных,

содержащих комплексов на структуру ДНК вы-

либо индуцированных облучением, двухнитевых

полнены в модельных экспериментах с изолиро-

разрывов ДНК в опухолевых клетках MCF-7.

ванной ДНК тимуса теленка.

Показано, что комплексы одно- и трехвалент-

ного золота с различными лигандами слабо свя-

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

зываются с ДНК, при этом связь по природе не

Исследования механизмов действия золотосо-

ковалентная, а электростатическая и обратимая

держащих комплексных соединений, обладаю-

[10]. Так, показано, что в ДНК опухолевых кле-

щих цитостатической и противоопухолевой ак-

ток, инкубированных с комплексами трехвалент-

тивностью, показывают, что эти соединения

ного золота с терпиридинами в качестве лиган-

могут рассматриваться как мультитаргетные пре-

дов, ион золота связывается с нуклеотидами в со-

параты.

отношении

6400 и

4900. При этом

интенсивность электростатического связывания

Установлено, что мишенями для действия зо-

золота с ДНК зависела от стерических особенно-

лотосодержащих комплексов могут быть клеточ-

стей лигандов и коррелировала с цитотоксично-

ные органеллы (митохондрии, протеосома 26S,

стью комплексов [11].

эндоплазматический ретикулум), различные

внутриклеточные молекулы, играющие важную

В ряде иследований показана способность не-

роль в опухолевом росте (тиоредоксинредуктаза;

которых комплексов трехвалентного золота с раз-

деубиквитиназы UCHL5 и USP14; протеосомы

ными лигандами (алкинилы, пиразин-дипиразо-

26S; белки внутриклеточных сигнальных путей

лы, инертные доноры NO) интеркалировать ДНК

MARK, PI3K/AKT, TOR, JAK2, STAT3, EKR1/2;

[12]. В то же время при исследовании двух ком-

специфический ингибитор транскрипционного

плексов трехвалентного золота с тиосемикарба-

фактора FOXO3 - IKKB; рецептор эпидермаль-

зонатными лигандами интеркаляции ДНК не за-

ного фактора роста - EGFR; фактор роста эндо-

регистрировано [13].

телия сосудов - VEGF; топоизомераза I). Меха-

В экспериментах с изолированной ДНК плаз-

низм действия разных комплексов, также как их

миды pBR322 установлено связывание с ДНК

различная цитототоксичность, во многом опре-

комплексов одно- и трехвалентного золота с раз-

деляются природой лигандов, соединенных с од-

ными лигандами с образованием межнитевых

но- или трехвалентным золотом в структуре кон-

ДНК-сшивок. Показано, что на способность

кретного комплекса [2].

комплексов образовывать сшивки не влияет сте-

пень окисленности золота; более эффективны

Практически для всех изученных золотосодер-

комплексы, в которых имеется два или более ли-

жащих комплексов показано, что их цитотокси-

ческий эффект во многом опосредован воздей-

гандов, слабо координированных с ионами золо-

ствием на ферментную систему антиоксидантной

та [14].

защиты - систему «тиоредоксин-тиоредоксин-

Обнаружено в опытах in vitro с разными лини-

редуктаза», регулирующую уровень активных

ями опухолевых клеток (HeLa, MCF-7, HCT11),

форм кислорода в митохондриях и цитозоле. Ин-

что комплекс одновалентного золота с парацик-

гибирование золотосодержащими соединениями

лофаном, обладающий значительной цитоток-

тиоредоксинредуктазы, обусловленное высокой

сичностью (IC₅₀ колебался в пределах от 3.5 мкМ

аффинностью золота к селену, входящему в селе-

до 38 мкМ), способен индуцировать двухнитевые

ноцистеин в активном центре фермента, с обра-

разрывы ДНК [15].

зованием связей Au-Se, ведет к повышению уров-

Следует заметить, что для комплексного со-

ня окисленного тиоредоксина и тем самым лиша-

единения двухвалентной платины (противоопу-

ет тиоредоксин антиоксидантной активности. В

холевый препарат цисплатин - дихлордиамино-

результате меняется внутриклеточный окисли-

платина) основной внутриклеточной мишенью

тельно- восстановительный баланс, что ведет к

является ДНК. Возникающий в результате внут-

увеличению интрацеллюлярного уровня актив-

риклеточного гидролиза исходного соединения

ных форм кислорода, развитию оксидативного

платиносодержащий ион образует аддукты с

стресса и апоптотической гибели клеток [2].

ДНК путем формирования координационных

Следует отметить, что индукция разными спо-

связей между атомом платины и двумя основани-

собами оксидативного стресса, рассматривается

ями ДНК (преимущественно гуанином). В ре-

как одно из перспективных направлений в поис-

зультате образуются плохо репарируемые и дли-

ках средств для противоопухолевой лекарствен-

тельно существующие внутри- и межнитевые

ной терапии [9].

сшивки ДНК [7].

БИОФИЗИКА том 68

№ 1

2023

ЧИГАСОВА и др.

Как показано в проведенном нами исследова-

ДНК может рассматриваться в качестве одной из

нии, молекулярный механизм действия полиа-

мишеней для реализации цитотоксического дей-

крилата золота (аурумакрил), представляющего

ствия полиакрилата золота.

собой, в отличие от всех изученных золотосодер-

жащих комплексов, золотосодержащий полимер,

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

связан с воздействием на ДНК опухолевых

клеток.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

Так, аурумакрил способен дозозависимо инду-

интересов.

цировать образование однонитевых разрывов

ДНК в опухолевых клетках линии MCF-7. Под

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

влиянием препарата (1000 мкг/мл) число однони-

тевых разрывов ДНК в клетках возрастает в 3.0-

Настоящая работа не содержит каких-либо ис-

4.5 раза по сравнению со спонтанным уровнем

следований с участием людей или животных в ка-

разрывов ДНК, наблюдаемых в контроле, уже че-

честве объектов исследований.

рез час инкубации и сохраняется на протяжении

24 ч культивирования клеток.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Следует отметить, что максимальный цито-

Д. Б. Корман, Л. А. Островская, Н. В. Блюхтерова

токсический эффект аурумакрила в отношении

и др., Биофизика,

(6),

1229

(2021). DOI:

клеток MCF-7 отмечался также при концентра-

10.31857/S000630292106020X

ции препарата, равной 1000 мкг/мл [5, 6].

Д. Б. Корман, Л. А. Островская и В. А. Кузьмин,

В то же время увеличение двухнитевых разры-

Вопр. онкологии, 64 (6) 697 (2018).

вов ДНК под влиянием аурумакрила не отмечено.

Более того, показана способность препарата сни-

Л. А. Островская, Д. Б. Корман, Н. В. Блюхтерова

жать число как спонтанных, так и индуцирован-

и др., Хим. физика, 38 (12), 64 (2019).

ных облучением двухнитевых разрывов ДНК в

Л. А. Островская, Д. Б. Корман, Н. В. Блюхтерова

опухолевых клетках MCF-7.

и др., Росс. биотерапевтич. журн., 19 (4), 74 (2020).

Так, 24-хчасовая инкубация клеток c аурумак-

Л. А. Островская, Д. Б. Корман, Е. И. Некрасова

рилом (500-1000 мкг/мл) приводит к снижению

и др., Биофизика,

(5),

978

(2021). DOI:

уровня спонтанных двухнитевых разрывов ДНК

10.31857/S0006302921050161

(регистрировался по количеству фокусов ΓН2АХ)

Л. А. Островская, Д. Б. Корман, Е. И. Некрасова

в два-три раза, а после 48-часовой инкубации

и др., Биофизика,

(1),

(2022). DOI:

уровень γН2АХ снижается на порядок по сравне-

10.31857/S0006302922010070

нию с контролем. В облученных клетках MCF-7,

Д. Б. Корман. Мишени и механизмы действия про-

предварительно в течение 24 ч инкубированных с

тивоопухолевых препаратов (Практическая меди-

аурумакрилом, уровень фокусов γН2АХ, реги-

цина, М., 2014).

стрируемый через 24 ч после облучения, снизился

Л. А. Островская, Д. Б. Корман, А. К. Грехова и др.,

на порядок по сравнению с наблюдаемым в облу-

Биофизика,

(3),

598

(2017).

DOI:

ченных клетках, не подвергавшихся воздействию

10.1134/S0006350917030150

аурумакрила.

Д. Б. Корман, Л. А. Островская и В. А. Кузьмин,

Показано, что аурумакрил способен вызывать

Биофизика,

(3),

552

(2019).

DOI:

сшивки в молекуле ДНК опухолевых клеток. Так,

10.1134/S0006350919030102

уже после часовой инкубации клеток MCF-7 с ау-

10.

L. Messori, P. Orioli, C. Tempi, et al., Biochem. Bio-

румакрилом (500 мкг/мл) уровень сшивок ДНК в

phys. Res. Commun.,

221,

852

(2001). DOI:

клетках увеличился примерно в четыре раза.

10.1006/bbrc.2001.4348

Экспериментально обнаруженный факт

11.

P. Shi, Q. Jiceng, Y. Zhao, et al., J. Biol. Inorg. Chem.,

уменьшения в клетках под влиянием аурумакри-

11, 745 (2006). DOI: 10.1007/s00755-006-0120-y

ла уровня двухнитевых разрывов ДНК требует для

12.

M. S. Alsaeedi, B. A. Babgi, M. A. Hussein, et al., Mol-

своего объяснения специального изучения и

ecules, 25, 1933 (2020). DOI: 10.3390/j.molecules

предположительно может быть связан с ранним

25051033

образованием ДНК-сшивок. Характер образую-

щихся ДНК-сшивок (ДНК-ДНК или/и ДНК-

13.

B. Possato, L. R. Dalmolin, L. M. Pereira, et al., Eur.

белок) остается неясным. Ответ на это вопрос яв-

J. Pharm. Sci.,

162,

105834

(2021). DOI:

ляется задачей последующих исследований.

10.1016/j.ejps.2021.105834

Основываясь на полученных данных следует

14.

C. K. Mirabelli, J. B. Zimmerman, H. R. Bartus, et al.,

констатировать, что препарат аурумакрил спосо-

Biochem. Pharmacol.,

35,

1435

(1986). DOI:

бен изменять структуру ДНК опухолевых клеток,

10.1016/0006-2952(86)90107-3

индуцируя образование однонитевых разрывов

15.

S. Bestgen, C. Seide, T. Wiesher, et al., Chemistry, 23,

ДНК и сшивок ДНК. Таким образом, молекула

6315 (2017). DOI: 10.1002/chem.201605337

БИОФИЗИКА том 68

№ 1

2023