БИОФИЗИКА, 2023, том 68, № 1, с. 33-40

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 612.111.11: 612.111.15

ИЗУЧЕНИЕ КОНФОРМАЦИИ ГЕМА И ГЛОБИНА

ФРАКЦИОНИРОВАННЫХ ЭРИТРОЦИТОВ КРЫС

С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА СПЕКТРОСКОПИИ КОМБИНАЦИОННОГО

РАССЕЯНИЯ СВЕТА

*Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, ул. Первомайская, 106, Екатеринбург, 620049, Россия

**ГАУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», ул. Карла Маркса, 22а, Екатеринбург, 620026, Россия

***Институт химии твердого тела УрО РАН, ул. Первомайская, 91, Екатеринбург, 620108, Россия

Е-mail: svetlana.brilliant@bk.ru

Поступила в редакцию 10.10.2022 г.

После доработки 10.10.2022 г.

Принята к публикации 07.12.2022 г.

Выявлены конформационные изменения гема и глобина фракционированных эритроцитов крыс с

помощью метода спектроскопии комбинационного рассеяния света. Полученные данные

показывают, что в крови крыс преобладают (более 80%) нормальные (основные) изоформы

гемоглобина, которые выполняют ключевые кислородтранспортную и защитную функции. Однако

наличие тяжелых (3%) и легких изоформ (11%), образующихся в результате полимеризации или

деградации белка, играет важную роль в организме, поскольку они выполняют дополнительные

функции, такие как участие в передаче сигналов и связывание экзогенных лигандов.

Ключевые слова: гемоглобины, метод спектроскопии комбинационного рассеяния света, фракционное

центрифугирование.

DOI: 10.31857/S0006302923010040, EDN: NZMURQ

Гемоглобины состоят из смеси близких по

ства изотипов этого пигмента колеблется в преде-

структуре молекул, которые методом электрофо-

лах 64.5-68 кДа.

реза на различных носителях (бумага, агар, крах-

Если различия между вариантами гемоглоби-

мал, полиакриламид) удается разделить на фрак-

ции. Электрофоретические различия между от-

нов по молекулярной массе и электрофоретиче-

дельными белковыми фракциями гемоглобина

ской активности описаны давно и хорошо извест-

определяются в первую очередь отличиями пер-

ны, то насколько они отличаются по своим струк-

вичной структуры белковой молекулы, следова-

турным характеристикам представляется мало

тельно, фракционный состав гемоглобина нахо-

изученной проблемой, что обусловлено недостат-

дится под строгим генетическим контролем.

ками обычно применяемых для исследования ме-

На данный момент описаны первичные струк-

тодик. Одним из современных методов характе-

туры более 600 вариантов гемоглобинов различ-

ристики структурного состояния гемоглобина

ных организмов [1, 2]. Термин «вариант», а не

может служить метод спектроскопии комбинаци-

«аномальный», является предпочтительным, по-

онного рассеяния света (рамановской спектро-

скольку большинство гемоглобинов не связано с

скопии). В основе этой методики лежит принцип

заболеванием. В крови одного организма опреде-

идентификации колебательного состояния фото-

ляются различные типы гемоглобинов, называе-

мых изоформами. Установлено, что у человека

нов, что позволяет изучить характеристики моле-

выделяются как минимум пять изоформ (Н₁, Н_2,

кул и структурные изменения молекулярных свя-

Н₃, HF, HP), у собаки, лошади, кошки — две, у

зей. Целью исследования являлась оценка разли-

чий структурных характеристик изоформ

крысы — шесть, а по некоторым данным девять,

которые отличаются по своей молекулярной

гемоглобина с помощью метода спектроскопии

структуре [3, 4]. Молекулярная масса большин-

комбинационного рассеяния света.

ЮШКОВ и др.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

копления сигнала с числом шагов, равным трем

за одно измерение. Для каждой точки в автомати-

Объектом исследования служили крысы-сам-

ческом режиме проводили по три измерения с

цы (n = 16, в возрасте 3-3.5 месяца) массой 250 г.

временным интервалом между измерениями 2 с.

Забор крови осуществляли из хвостовой вены

Для каждого образца было проведено четыре не-

животных в объеме 5 мл, используя золетил-кси-

зависимых измерения в разных точках. Фокуси-

лазиновый наркоз. Периферическую кровь ис-

ровку лазерного луча на зернах и поверхностях

пользовали для разделения эритроцитов на фрак-

образцов осуществляли при помощи стереоско-

ции. Для этого 5 мл цельной крови разводили фи-

пической системы (бинокулярные линзы) и си-

зиологическим раствором (ООО

«Гротекс»,

стемы регулировки положения сотовой плиты,

Россия) в соотношении 1 : 1 и центрифугировали

состоящей из двух рукояток- грубой и более тон-

с помощью центрифуги Sigma 3R30 (Россия) в те-

кой настройки, расположенных под сотовой пли-

чение

5 мин

(1-я проба) при

500 об/мин

той. Посредством инструментов, включенных в

(RCF = 19.56 g). Процедуру повторяли 6 раз, уве-

пакет программного обеспечения, обеспечиваю-

личивая время центрифугирования для каждой

щего связь между персональным компьютером и

последующей пробы: 2-я проба - 10 мин, 3-я про-

прибором, была проведена цифровая очистка по-

ба - 15 мин, 4-я - 20 мин, 5-я проба - 25 мин и

лученных спектров от фонового сигнала и шумо-

6-я проба - 30 мин. После шестого центрифуги-

подавление при помощи фильтра Савицкого-Го-

рования эритроциты в надосадочной жидкости

лея (фильтр 7-го порядка, длина кадров - 24).

не выявлялись [5, 6].

Анализируя частоты колебаний и отношения

Изоформы гемоглобина исследовали как в

интенсивностей линий в спектрах комбинацион-

эритроцитах цельной крови, так и в отдельных

ного рассеяния, в геме оценивали различия со-

фракциях клеток. Для этого приготовляли гемо-

стояния пиррольных полуколец

(1170 см^-1,

лизат клеток, а затем проводили разгонку мето-

1355 см^-1, 1375 см^-1, отношения интенсивностей

дом электрофореза в полиакриламидном геле (по

линий I₁₃₇₅/I₁₁₇₂иI₁₃₇₅/I₁₁₂₇), метиновых мостиков

Г. Мауреру). Для рамановской спектроскопии ге-

между пирролами (1550 см^-1, 1580 см^-1), винилов

молизат после каждого центрифугирования вы-

(1620 см^-1), атомов железа (1567 см^-1, 1550 см^-1,

сушивали в термостате при 53.8°С в течение су-

ток. Оценку конформации гема и его белкового

1580 см^-1,

1640 см^-1,

1355 см^-1),

(-С=С-)- и

окружения в глобине осуществляли с помощью

(-С=N-)-групп (1620 см^-1, 1640 см^-1), а в глобине

метода комбинационного рассеяния света [7-11].

в валентных колебаниях аминокислот, симмет-

Для записи спектров комбинационного рассе-

ричном/ассиметричном растяжении СН₃-групп,

яния использовали конфокальный рамановский

колебаниях СН-концевых метиленовых групп

микроскоп inVia Qontor (Renishaw plc, Велико-

аминокислот (2850 см^-1, 2880 см^-1, I₂₉₃₀/I₂₈₅₀), по-

британия), оборудованный двумя полупроводни-

лярном окружении аминокислот

(2930 см^-1,

ковыми твердотельными лазерами - на 532 нм

2940 см^-1) и плотности упаковки белка

(измеряемый диапазон частот от 50 до 4000 см^-1,

(I₂₈₅₀/I₂₈₈₀), отдельно оценивали лигандсвязываю-

200 мВт) и 785 нм (диапазон от 50 до 3500 см^-1,

щую способность гемоглобина (1355 см^-1, 1375 см^-1,

300 мВт) - и ICDD-детектором (оптическая чув-

1618 см^-1, I₁₃₇₅/I_1355,I₁₃₇₅/(I₁₃₅₅+I₁₃₇₅), I₁₆₁₈/(I₁₃₅₅+

ствительность до 1.08 мкм), а также системой ста-

+ I₁₃₇₅), I₁₆₁₈/I1580, I₁₆₈₈/I1580, I₁₃₅₅/(I₁₃₅₅

+ I₁₃₇₅),

билизации положения лазеров и измерительной

I₁₃₅₅/I1550, I₁₃₇₅/I1580, (I₁₃₅₅/I₁₅₅₀)/(I₁₃₇₅/I₁₅₈₀)) [8, 9, 12-

сотовой плиты.

14].

Перед началом работы прибор был откалибро-

ван с использованием кремниевой пластины в ре-

Достоверность отличий в сравниваемых вы-

жиме Static при помощи лазера на 532 нм по поло-

борках оценивали с применением непараметри-

ческого (рангового) U-теста Манна-Уитни. Ста-

жению линии Si (520 см^-1). Порошкообразные

тистическая обработка данных проведена с помо-

образцы были горизонтально размещены на пре-

щью программного пакета SPSS Statistics (версия

паративном стекле, которое при закрытой штор-

17.0). Различия считали статистически значимы-

ке лазера было установлено в пазе сотовой плиты

ми при р < 0.05.

и закреплено пружинным фиксатором. Для съем-

ки был выбран лазер на 785 нм. Съемку проводи-

ли в режиме Extended в диапазоне от 100 до

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3200 см^-1 с автоматической калибровкой по цен-

Полученные данные свидетельствуют, что ес-

тральной частоте 750 см^-1. Для лазера 785 нм (ре-

ли в цельной крови крыс методом электрофореза

жим точечной съемки- Edge) была выбрана ди-

в полиакриламидном геле можно выделить шесть

фракционная решетка 1200 штрихов/мм. При

отличающихся по электрофоретической подвиж-

съемке было задано минимально возможное вре-

ности изоформ гемоглобина, то в каждой отдель-

мя экспозиции 10 с и мощность лазера 10% от

ной фракции клеток всегда содержатся только две

максимальной. Съемку проводили в режиме на-

изоформы - одна более легкая, другая - тяжелая

БИОФИЗИКА том 68

№ 1

2023

ИЗУЧЕНИЕ КОНФОРМАЦИИ ГЕМА И ГЛОБИНА

Таблица 1. Общие характеристики гема и глобина крыс фракционированных эритроцитов

Фракции эритроцитов

Показатели

ФЭ-1

ФЭ-2

ФЭ-3

ФЭ-4

ФЭ-5

ФЭ-6

Варианты

Т + Т

Т + Нт

Нт + Нл

Нл + Л

Л + Л

гемоглобинов

Молекулярная масса,

84.84 ± 1.50

83.32 ± 1.0

71.89 ± 0.57

73.46 ± 1.04

61.70 ± 0.52

59.09 ± 0.75

кДа

74.51 ± 0.84

66.68 ± 0.83

64.04 ± 1.08

64.55 ± 0.46

55.3 ± 0.80

50.76 ± 0.82

Соотношение

46.0%

40.0%

66.7%

56.5%

62.9%

67.1%

вариантов

54.0%

60.0%

33.3%

43.1%

37.1%

32.5%

гемоглобинов, %

Отношения интенсивностей спектральных линий гема в интервале частот 1000-1700 см^-1

«Плоская»

0.7719 ± 0.1582

0.5551 ± 0.1004

0.4767 ± 0.1209

0.4676 ± 0.0431

0.5634 ± 0.0433

0.8403 ± 0.1246

конформация гема,

^I1640/I1375

Нахождение гема в

1.1417 ± 0.2106

0.40701 ± 0.028

1.416 ± 0.1268

1.8565 ± 0.2819

1.2891 ± 0.09805

1.1622 ± 0.0474

плоской

конформации,

^I1640/I1127

«Скрученная»

0.2481 ± 0.0234

0.40701 ± 0.028

0.2532 ± 0.0680

0.1748 ± 0.0420

0.3752 ± 0.110648

0.2529 ± 0.0542

конформация гема,

^I1172/I1375

Жесткость белкового

0.2756 ± 0.0431

0.7725 ± 0.049

0.8029 ± 0.0672

0.6097 ± 0.0669

0.7673 ± 0.2400

0.316 ± 0.1138

окружения гема,

^I1170/I1127

Интенсивность спектральных линий пиррольных колец в интервале частот 1300-1370 см^-1

Ассиметричные

1523.5 ± 169.26

625.25 ± 128.268

864.25 ± 146.6756

656.5 ± 174.2194

2237.75 ± 699.808

1257.25 ± 186.764

колебания

пиррольных

полуколец

оксигемоглобина,

1170см^-1

Симметричные

8360.667 ±

1435.68 ± 382.79

4359 ± 2221.8

5594.6 ± 1514.803

5820.33 ± 873.01

7205.19 ± 497.9538

колебания

1073.034

пиррольных

полуколец в

молекулах

дезоксигемоглобина,

1355 см^-1

Симметричные

6420.25 ± 689.579

1396.333 ±

3999.667 ± 2047.55

5025.5 ± 1827.603

4129.0 ± 1186.021

6604.308 ± 821.6703

колебания

374.2523

пиррольных

полуколец в

молекулах

гемоглобина,

связанного с

лигандами, 1375 см^-1

Выраженность

4.137624 ±

3.979275 ±

4.546194 ±

7.716417 ± 2.89026

2.532694 ± 0.7819806

4.574989 ± 0.96907

симметричных и

0.382869

1.503758

1.149223

ассиметричных

колебаний пирольных

колец, I₁₃₇₅/I₁₁₇₂ -

конформационные

изменения пирролов

Вклад боковых СН₃-

1.33021 ± 0.104345

3.07814 ± 1.168709

1.33021 ± 0.104345

4.2724 ± 1.135425

2.35965 ± 0.350801

1.189855 ± 0.060178

групп колебаний

полуколец пиррола

гема, I₁₃₇₅/I₁₁₂₇

Колебане метиновых

4534.5 ± 928.39

808 ± 160.98

1039.667 ± 227.97

1107.75 ± 288.358

2549.667 ± 390.4367

4927.75 ± 1040.268

радикалов, I₁₁₂₇

БИОФИЗИКА том 68

№ 1

2023

ЮШКОВ и др.

Колебания метиновых

10596.25 ±

1385.67 ± 320.33

2623 ± 767

4185.6 ± 1024.628

6181 ± 841.26

12603.9 ± 1316.547

мостиков между

2854.195

пирролами в молекулах

гемоглобина, в которых

гемопорфирин растянут

и деформирован, I₁₅₅₀

Колебания метиновых

13847.75 ±

2343.625 ±

3283.333 ±

4897.222 ±

6238.625 ± 1270.55

14245.71 ± 1648.57

мостиков между

2511.795

382.093

585.0453

861.4128

пирролами в молекулах

гемоглобина, в которых

гемопорфирин имеет

более компактную

недеформированную

конформацию, I₁₅₈₀

Виниловая полоса -

11015.25 ±

1916.0 ± 493.9167

2457.75 ± 645.1602

3917.25 ± 1240.147

6038.0 ± 650.681

10669.5 ± 2095.529

С=С-, I₁₆₂₀

2201.64

Интенсивность спектральных линий железа

Маркер спинового

13379.02 ±

2324.0 ± 586.0283

3334.0 ± 661.1953

4718.0 ± 1449.671

8005.667 ± 920.884

13329.0 ± 2473.411

состояния, I₁₅₆₇

488.812

Спиновое состояние

10596.25 ±

1385.67 ± 320.33

2623.0 ± 767

4185.6 ± 1024.628

6181 ± 841.26

12603.9 ± 1316.547

железа в дезокси-форме,

2854.195

степень погруженности

атома железа в

плоскость

порфиринового кольца,

^I1550

Спиновое состояние

13847.75 ±

2343.625 ±

3283.33 ± 585.0453

4897.22 ± 861.4128

6238.625 ± 1270.55

14245.71 ± 1648.57

железа в окси-форме,

2511.795

382.093

степень погруженности

атома железа в

плоскость

порфиринового кольца,

^I1580

Зависимость от

5239.5 ± 1500

1111.5 ± 293.057

1486.0 ± 402.9173

2184.5 ± 714.768

2398.5 ± 678.268

5584.75 ± 1036.506

спинового состояния

железа эквивалентное

состоянию оксигенации

анализируемой клетки,

^I1640

Редокс-состояние

8360.667 ±

2739.25 ± 692

4359 ± 2221.8

5594.6 ± 1514.803

5820.33 ± 873.01

7205.19 ± 497.9538

1073.034

железа (Fe²⁺)

присутствие лиганда,

^I1355

(дезоксигемоглобин)

Редокс-состояние

6420.25 ±

2717.25 ± 1347.167

3999.667 ±

5025.5 ± 1827.603

4129.0 ± 1186.021

6604.308 ± 821.6703

689.579

2047.555

железа (Fe²⁺)

присутствие лиганда,

^I1375 ^{(оксигемоглобин)}

Колебание (-С=С-)-

13847.75 ±

2343.625 ±

3283.33 ± 585.0453

4897.22 ± 861.4128

6238.625 ± 1270.55

14245.71 ± 1648.57

связей, I₁₅₈₀

2511.795

382.093

БИОФИЗИКА том 68

№ 1

2023

ИЗУЧЕНИЕ КОНФОРМАЦИИ ГЕМА И ГЛОБИНА

Интенсивность спектральных линий глобина

Симметричное

136.25 ± 26.939

69.57 ± 17.966

113.666 ± 13.990

312.77 ± 86.580

316.125 ± 120.62

117.762 ± 33.126

растяжение СН,

окси- и

дезоксигемоглобина,

^I2850

Ассимметричное

218.95 ± 41.136

171.25 ± 48.370

256.16 ± 52.54

411.11 ± 82.9307

896.875 ± 340.819

166.53 ± 20.701

растяжение СН-,

^I2880

Симметричное

315.644 ± 45.848

324.6 ± 59.825

357.5 ± 64.03

747.22 ± 146.03

766.25 ± 57.379

306.862 ± 35.612

^СН3^{-растяжение}

(оксигемоглобин),

^I2930

Симметричное

202.266 ± 42.776

251.2 ± 53.397

290.166 ± 57.351

396.22 ± 106.25

476.875 ± 79.069

205.0 ± 41.996

^СН3^{-растяжение}

(дезоксигемоглобин),

^I2940

Колебания

2.693 ± 0.611

5.160 ± 0.551

4.325 ± 0.883

3.374 ± 0.76

3.976 ± 0.858

3.485 ± 0.935

Н-метиновых групп

аминокислот,

^I2930/I2850

Плотность упаковки,

0.54 ± 0.062

0.295 ± 0.072

0.412 ± 0.050

0.750 ± 0.119

0.355 ± 0.043

0.701 ± 0.160

^I2850/I2880

Редокс и спиновое

12990.0 ± 1642.103

1917 ± 488.4

2646.33 ± 754.33

4473.4 ± 1093.019

6038 ± 650.628

11610 ± 1256.17

состояние железа,

наличие лиганда,

NO-Гб, I₁₆₁₈

Примечание. ФЭ1-ФЭ6 - фракции эритроцитов с первой по шестую; Т+Т - тяжелые варианты гемоглобина, Т+Нт - нормальные

варианты + тяжелая форма, Нт+Нл - нормальные (основные) варианты гемоглобина; Нл+Л - нормальные варианты + легкая форма,

Л+Л - легкие варианты гемоглобина; a - достоверность изоформ гемоглобина от ФЭ1 (p < 0.05), b - достоверность изоформ гемоглобина

от ФЭ2 (p < 0.05), c - достоверность изоформ гемоглобина от ФЭ3 (p < 0.05), d - достоверность изоформ гемоглобина от ФЭ4 (p < 0.05), e -

достоверность изоформ гемоглобина от ФЭ5 (p < 0.05), f - достоверность изоформ гемоглобина от ФЭ6 (p < 0.05).

(табл. 1). В цельной крови наибольшая доля (65%)

свидетельствуют, что варианты гемоглобинов,

приходится на нормальные изоформы гемогло-

содержащиеся в различных фракциях эритроци-

бина с молекулярной массой 60-70 кДа (в литера-

тов отличаются не только по молекулярной массе

туре чаще указывают диапазон 64-68 кДа), 11%

и электрофоретической подвижности, но и име-

составляют тяжелые (более 70 кДа) и 24% - более

ют ряд структурных особенностей.

легкие (менее 60 кДа) изоформы. Возникновение

Тяжелые и легкие варианты в одинаковой сте-

тяжелых изоформ можно связать с полимериза-

пени отличаются от нормальных по жесткости

цией, а легких - с деградацией белка.

белкового окружения гема - I₁₁₇₀/I₁₁₂₇[15], коле-

В полученных в процессе разделения путем

баниям метиновых мостиков между пирролами в

центрифугирования шести фракциях клеток пер-

молекулах гемоглобина, в которых гемопорфи-

вая содержит исключительно тяжелые варианты

рин растянут и деформирован, - I₁₅₅₀ [16], коле-

гемоглобина (84.84 ± 1.50 кДа - 74.51 ± 0.84 кДа),

баниям метиновых мостиков между пирролами в

вторая

- тяжелую и нормальную изоформы

молекулах гемоглобина, в которых гемопорфи-

(83.32 ± 1.0 кДа - 66.68 ± 0.83 кДа), третья и чет-

рин имеет более компактную недеформирован-

вертая - нормальные в различных сочетаниях

(71.89 ± 0.57 кДа - 64.04 ± 1.08 кДа и 73.46 ±

ную конформацию, - I₁₅₈₀ [12, 16], маркеру спи-

± 1.04 кДа - 64.55 ± 0.46 кДа), пятая - нормаль-

нового состояния - I₁₅₆₇ [12, 16], спиновому со-

ную и легкую (61.70 ± 0.52 кДа - 55.3 ± 0.80 кДа),

стоянию железа в дезокси-форме, степени

шестая

- исключительно легкие изоформы

погруженности атома железа в плоскость порфи-

(59.09 ± 0.75 кДа - 50.76 ± 0.82 кДа).

ринового кольца - I₁₅₅₀ [12, 16], спиновому состо-

Данные спектроскопии комбинационного

янию железа в окси-форме, степени погруженно-

рассеяния света (рамановской спектроскопии) сти атома железа в плоскость порфиринового

БИОФИЗИКА том 68

№ 1

2023

ЮШКОВ и др.

кольца - I₁₅₈₀ [12, 16], колебаниям -С=С-связей

туре описано, что атомы, располагающиеся

I₁₅₈₀ [14, 17], редокс- и спиновому состоянию же-

наиболее близко друг к другу и имеющие тесные

межатомные контакты, будут являться наиболее

леза, наличию лиганда NO-Гб - I₁₆₁₈ [18]. Таким

жесткими (твердыми), что обусловлено заданны-

образом, как увеличение, так и уменьшение мо-

ми ковалентными связями и углами [15].

лекулярной массы гемоглобина одинаково ска-

Легкие варианты гемоглобина (Л+Л) отлича-

зываются на состоянии гема (табл. 1).

ются от смеси «нормальные + легкая форма»

Добавление к нормальному варианту гемогло-

(Нл+Л) большим увеличением колебаний мети-

бина тяжелой формы приводит к увеличению

новых радикалов, возрастанием колебаний мети-

«скрученной» конформации гема I₁₁₇₂/I₁₃₇₅[13],к

новых мостиков между пирролами в молекулах

снижению (замедлению) симметричных колеба-

гемоглобина, в которых гемопорфирин растянут

ний пиррольных полуколец в молекулах дезокси-

и деформирован, - I₁₅₅₀, ростом колебаний мети-

гемоглобина - 1355 см^-1[8, 9] исимметричных

новых мостиков между пирролами в молекулах

колебаний пиррольных полуколец в молекулах

гемоглобина, в которых гемопорфирин имеет бо-

лее компактную недеформированную конформа-

гемоглобина, связанного с лигандами, - 1375 см^-1

цию, - I_1580,изменениями виниловой полосы -

[13], уменьшению колебаний метиновых радика-

лов - I₁₁₂₇[19], уменьшению колебаний метино-

I_1620,спинового состояния железа в дезокси-фор-

вых мостиков между пирролами в молекулах ге-

ме_,ассиметричным растяжением СН- групп -

моглобина, в которых гемопорфирин растянут и

I_2880,симметричным растяжением СН₃-групп -

деформирован, - I₁₅₅₀[14, 17]_.

I_2930,редокс- и спиновым состоянием железа, на-

Добавление к нормальному варианту гемогло-

личием лиганда NO-Гб - I1618 (табл. 1)_.

бина легкой формы приводит к увеличению коле-

Лиганд-связывающая способность. Тяжелые и

баний метиновых мостиков между пирролами в

легкие формы обладают наиболее низкой, по

молекулах гемоглобина, в которых гемопорфи-

сравнению с основными нормальными изофор-

рин имеет более компактную недеформирован-

мами IF3-F4 (Нт+Нл), лиганд-связывающей

ную конформации, - I₁₅₈₀[12, 16]_.Спиновое со-

способностью. В одинаковой степени снижены

стояние железа в дезокси-форме, степень погру-

как относительная способность гемоглобина свя-

женности атома железа в плоскость

зывать лиганды (I₁₃₅₅/I₁₅₅₀), так и его способ-

порфиринового кольца повышается в два раза по

ность выделять их (I₁₃₇₅/I₁₅₈₀). Наиболее зависи-

сравнению с нормальными (основными) изофор-

мыми от изменений молекулярной массы гемо-

мами.

глобина являются такие показатели, как его

Анализ смесей «нормальные + легкая форма»

сродство к лигандам и колебания метиновых мо-

(Нл+Л) и «нормальные + тяжелая форма» (Нт+Т)

стиков в геме.

(табл. 1) показывает, что наибольшие различия

между ними касаются симметричных колебаний

пиррольных полуколец в молекулах оксигемогло-

ОБСУЖДЕНИЕ

бина - 1170 см^-1, симметричных колебаний пир-

Считают, что разнообразие форм гемоглобина

рольных полуколец дезоксигемоглобина

дает определенные преимущества организму в

1355 см^-1, колебаний метиновых радикалов, ко-

процессе его приспособления к условиям среды.

лебаний метиновых мостиков, спинового состоя-

Хорошо известно, что свободный от стромы ге-

ния железа в дезокси-форме, степени погружен-

моглобин очень токсичен из-за воздействия на

ности атома железа в плоскости порфиринового

функции почек, коагуляцию и тонус сосудов.

кольца - I₁₅₈₀, колебаний -С=С- связей, плот-

Токсичность гемоглобина в основном обусловле-

на диамерами и мономерами, вызывающими по-

ности упаковки, редокс и спинового состоянии

чечную недостаточность и экстравазацию гемо-

железа, наличия лиганда NO-Гб - I_1618.

глобина, который связывается с NO, вызывая тя-

Тяжелые варианты гемоглобина (Т+Т) в срав-

желую гипертонию. Увеличение молекулярной

нении с смесью «нормальные + тяжелая форма»

массы путем полимеризации или конъюгации

(Нт+Т) отличаются «скрученной» конформации

уменьшает экстравазацию. Также вязкость прямо

гема, также отмечаются различия между смесью

пропорциональна молекулярной массе гемогло-

«нормальные + тяжелая форма» (Нт+Т) и основ-

бина [20]. Оказывается, что полимеризованные

ными изоформами (Нт+Нл). Жесткость белково-

гемоглобины улучшают показатели гемодинами-

го окружения гема (I₁₁₇₀/I₁₁₂₇) увеличивается в

ки по сравнению с исходной молекулой 64 кДа.

фракциях IF2 (Нт+Т), IF3 и IF4 (Нт+Нл) по срав-

Внеклеточный полимерный дигемоглобин чело-

нению с фракцией IF1 (Т+Т), что, вероятно, обу-

века (130 кДа) менее токсичен для почек и облада-

словлено уменьшением расстояния между кова-

ет меньшей вазоактивностью по сравнению с ге-

лентно связанными атомами (табл. 1). В литера-

моглобином 64 кДа [21].

БИОФИЗИКА том 68

№ 1

2023

ИЗУЧЕНИЕ КОНФОРМАЦИИ ГЕМА И ГЛОБИНА

На кинетику полимеризации гемоглобина сер-

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

повидно-клеточной анемии влияют гемоглобин

Содержание и выведение животных из экспе-

A2 и фетальный гемоглобин. Известно, что у лю-

римента выполняли согласно правилам, описан-

дей сохранение экспрессии фетального гемогло-

ным Международным Советом медицинских на-

бина плода во взрослом возрасте улучшает пато-

учных обществ (CIOMS) в «Международных ре-

логические эффекты серповидноклеточной ане-

комендациях

по

проведению

медико-

мии.

биологических исследований с использованием

Поскольку фетальный гемоглобин при его со-

животных» (1985) и согласно приказу Министер-

держании в цельной крови приблизительно 15-

ства здравоохранения РФ № 708н от 23.08.2010 г.

20% от всего белка ингибирует полимеризацию

«Об утверждении правил лабораторной практи-

гемоглобина серповидно-клеточной анемии, а

ки» (Этический комитет ИИФ УрО РАН, прото-

при 4-15% снижает развитие вазоокклюзионных

кол №01/20 от 8.04.2020 г.).

кризов на 50%, то его повышение в крови с тера-

певтической целью создает условия для улучше-

ния состояния пациентов с серповидноклеточ-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ной анемией.

А. Н. Федяшкина и Г. В. Максимов, Вестн. Мор-

Полученные данные показывают, что в крови

дов. универ., 3 (4), 141 (2013).

крыс преобладают (более 80%) нормальные (ос-

A. Bogdanova, L. Kaesthner, et al., Rev. Artic. Front.

новные) изоформы гемоглобина, которые выпол-

Physiol., 11, 392 (2020).

няют ключевые кислородтранспортную и защит-

И. К. Проскурина и А. В. Титовский, Яросл. педа-

ную функции. Однако наличие тяжелых (3%) и

гогич. вестн., 3 (21), 83 (1999).

легких изоформ (11%), образующихся в результа-

M. Z. Lu, Y. J. Guo, et al., Spectroscopy and Spectral

те полимеризации или деградации белка, играют

Analysis, 34 (2), 439 (2014).

тоже немаловажную роль в организме, поскольку

Б. Г. Юшков и С. А. Бриллиант, Рос. физиол. журн.

выполняют дополнительные функции, такие как:

им. И. М. Сеченова, 106 (10), 1312 (2020)

участвуют в передаче сигналов, связывают экзо-

Б. Г. Юшков и С. А. Бриллиант, Бюл. эксперим.

генные лиганды и т.д.

биологии и медицины, 173 (1), 16 (2022).

Методом спектроскопии комбинационного

П. Кэри, Применения спектроскопии КР и РКР в

рассеяния света в ходе нашего исследования по-

биохимии («Мир», М., 1985).

казано, что изоформы гемоглобина отличаются

О. В. Слатинская, О. Г. Лунева и др. Биофизика, 65

по характеристикам как гема, так и глобина, что

(2), 250 (2020).

отражается на их лиганд-связывающей способно-

О. В. Слатинская и Г. В. Максимов, Актуал. вопр.

сти.

биологии, физики и химии, 4 (2), 283 (2019).

Применение спектроскопии комбинационно-

10.

И. А. Хуторская, В. П. Балашов и др. Вестн. нов.

го рассеяния света для оценки структурно-функ-

мед. техн., 23 (3), 55 (2016).

циональных различий изоформ гемоглобина у

11.

K. Ramser, K. Logg, et al. J. Biomed. Opt., 9, 593

крыс показывает перспективность данного под-

(2004).

хода в изучении заболеваний крови, связанных с

12.

N. A. Brazhe, S. Abdali, A. R. Brazhe, et al., Biophys.

гемоглобином, как в норме, так и при действии на

J., 97 (12), 3206 (2009).

организм экстремальных факторов (или при па-

13.

V. V. Revin, N. V. Gromova, et al., BioMed Res. Int.,

тологии).

973 (2015).

14.

I. V. Syusin, V. V. Revin, et al., Biol. Med., 7, 239

(2015).

БЛАГОДАРНОСТИ

15.

H. Holtje, W. Sippl, et al., Molecular Modeling. Third

Работа выполнена с использованием оборудо-

edition (Wiley-VCH Verlag, Weinheim, 2008).

вания ЦКП ИИФ УрО РАН.

16.

А. И. Юсипович, Н. А. Браже и др., Бюл. эксперим.

биологии и медицины, 155 (2), 201 (2013)

17.

И. В. Сюсин, Дисс. … канд. биол. наук (Мордов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

гос. ун-т им. Н.П. Огарева, Воронеж, 2015).

Работа выполнена в рамках государственного

18.

С. С. Бочкарева, Дисс

канд. биол. наук (МГУ

задания ИИФ УрО РАН (тема № АААА-А21-

имени М.В. Ломоносова, М., 2016).

121012090091-6).

19.

Э. И. Никельшпарг, Дисс. …канд. биол. наук (МГУ

имени М.В. Ломоносова, М., 2019).

20. C. R. Haney and P. W. Buehler, Adv. Drug. Deliv., 40

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

(3), 153 (2000)

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

21. V. Budhiraja and J. D. Hellums, Microvasc. Res., 64

интересов.

(2), 220 (2002).

БИОФИЗИКА том 68

№ 1

2023