БИОФИЗИКА, 2023, том 68, № 2, с. 213-217

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.3

АЛАНИН: ОБЫЧНОЕ И НЕОЖИДАННОЕ

И.Ю. Тоpшин***, Н.Г. Есипова*

*Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгаpдта PАН, ул. Вавилова, 32, Москва, 119991, Россия

**Моcковcкий физико-технический институт,

Институтский пер., 9, Долгопрудный Моcковcкой области, 141700, Россия

***Вычислительный центр им. А.А. Дородницина Федерального исследовательского центра

«Информатика и управление» PАН, ул. Вавилова, 40, Москва, 119333, Россия

^#E-mail: vgt450@yandex.ru

Поступила в редакцию 14.11.2022 г.

После доработки 11.12.2022 г.

Принята к публикации 14.12.2022 г.

На основании экспериментальных данных можно говорить об аномально большом вкладе аланина

в стабилизацию альфа-спирали и других белковых конформаций. Независимые (в том числе экспе-

риментальные) данные свидетельствуют об особо большом вкладе аланина в стабилизацию альфа-

спирали. При этом выявляются позитивные вклады, как в энтропию системы, так и в энтальпию.

Высокий вклад аланина в энтальпию образования альфа-спирали противоречит общепринятому

взгляду: энтропия должна падать при образовании регулярных структур в белках. Аланин стабили-

зирует два типа вторичной структуры из трех: альфа-спираль и левую спираль типа «полипролин

II», а если говорить о фибриллярных белках, то аланин стабилизирует и бета-структуру. Стабилизи-

рующий эффект аланина на структуру альфа-спирали распространяется и на нативно-развернутые

белки, и на коньюгаты «альфа-спираль-подложка». Словом, не будет преувеличением сказать, что

проблема формирования вторичной структуры белка сводится к проблеме аланина. Вскрытые про-

тиворечия носят парадоксальных характер и их интерпретация (прежде всего, обоснование вклада

аланина в энтальпию плавления в терминах фундаментальной физики) на сегодняшний день отсут-

ствует. Между тем представленные в работе данные и комментарии позволяют надеяться на про-

гресс в разрешении выявленных противоречий.

Ключевые слова: аланин, конформационно стабильные/лабильные сегменты белка, локальная структура

белка, конформационный анализ, статистический анализ, ЯМР, молекулярная динамика.

DOI: 10.31857/S0006302923020011, EDN: BZIYPK

Если задаться вопросом, какая аминокислота

несмотря на простоту химической формулы, ала-

может рассматриваться как самый типичный

нин эффективен в качестве лекарства и прописы-

представитель соответствующего класса соедине-

вается как средство от дегидратации при диарее,

ний, отражающий свойства других аминокислот

при гипертрофии предстательной железы, при

(здесь и далее мы имеем в виду так называемые

стрессе, шизофрении и т.д. (см. https://www.drug-

кодируемые аминокислоты), то ответ может быть

bank.ca/drugs/DB00160). Хотя спектр применения

только один: аланин. Действительно, аланин

его в качестве лекарственного средства достаточ-

имеет простое химическое строение, но сохраня-

но широк, почти нет данных о механизмах, стоя-

ет ряд свойств более сложных аминокислот. Про-

щих за терапевтическим эффектом аланина.

ще аланина только глицин, но глицин вообще

В качестве примера применения аланина в об-

представляет собой исключение - это единствен-

ласти материаловедения можно привести связан-

ная ахиральная аминокислота из общего списка

ную с проблемой защиты окружающей среды ра-

из 20 аминокислот.

боту [1], в которой показано, что аланин может

Чтобы охарактеризовать вовлеченность ала-

окислять оксид графена без катализатора или ис-

нина в науку и технику приведем только по одно-

пользования щелочной среды.

му примеру из области медицины и технологии.

Физико-химические свойства аланина не но-

Уже то, что аланин влияет на уровень сахара в

сят крайнего характера; в группе гидрофобных

крови, позволяет предположить, что он может

алифатических аминокислот (Ala, Val, Ley, Ile)

найти применение в медицине. И действительно,

аланин, имея в качестве бокового радикала ме-

213

214

ТУМАНЯН и др.

тильную группу, обладает наименьшей гидро-

рианте фибриллярных белков аланин способ-

фобностью и наибольшей растворимостью. Ала-

ствует формированию также и бета-структуры.

нин широко распространен в белках, и во многих

Аномалия аланина всплывает уже при анализе

белках это наиболее представленная аминокис-

обобщающих обширную экспериментальную ин-

лота. Это наиболее, если можно так выразиться,

формацию данных по статистике расстояний

замещающая и замещаемая аминокислота. Со-

Сα-Сα, используемых с целью построения

гласно генетическим данным по аминокислот-

knowledge-based потенциалов. Эти данные позво-

ным заменам аланин относится к наиболее легко

ляют обнаружить, что взаимодействия между

заменяемым аминокислотам, он делит второе и

Сα-атомами аланинов особенно велики [4].

третье места по «заменимости». Другими слова-

ми, это наиболее толерантная к заменам амино-

кислота [2]. На первом месте находится метио-

СТАБИЛИЗАЦИЯ АЛЬФА-СПИРАЛИ

нин, содержание которого всегда незначительно,

ПО ДАННЫМ БИОИНФОРМАТИКИ

а на последнем (максимальная незаменимость) -

Методы биоинформатики, носящие как пра-

пролин.

вило статистический характер, позволяют обна-

Ввиду перечисленных свойств аланина ис-

ружить определенные закономерности, напри-

пользование этой аминокислоты в качестве моде-

мер, найти, какие остатки стабилизируют или де-

ли в теоретических и экспериментальных иссле-

стабилизируют вторичную или локальную

дованиях представляется наилучшим выбором,

структуру белка. Далее в лучшем случае получен-

можно привести многочисленные примеры работ

ные тенденции интерпретируются исходя из

такого плана.

представлений физической химии и молекуляр-

ной биофизики, а обычно остаются просто сред-

Так, аланин часто используют как упрощен-

ством для предсказаний.

ную модель других аминокислот (кроме глици-

на). В экспериментах «host-guest» он может вы-

Что касается данных по аминокислотному со-

полнять как роль «гостя», так и «хозяина».

ставу, то обширный статистический материал

свидетельствует о том, что остатки MALEK име-

Замены на аланин, как правило, ведут к повы-

ют предпочтение для вхождения в альфа-спираль

шению стабильности альфа-спиральных host-

и полипептидная цепь в местах скопления этих

пептидов.

остатков с большой вероятностью примет струк-

Наконец, широко востребована процедура

туру альфа-спирали.

аланинового сканирования: в эксперименталь-

Можно считать, что наибольший спираль-об-

ном варианте и в варианте in silico, когда амино-

разующий вклад вносит аланин. Больший вклад

кислоты в цепи белка с первой до последней за-

можно приписать только метионину, но метио-

мещаются на аланин. Оба варианта, эксперимен-

нин находится среди наиболее редко встречаю-

тальный и расчетный, дополняют друг друга.

щихся аминокислот (тогда как аланин - среди са-

Все эти процедуры не свободны от эффекта

мых распространенных). Поэтому вряд ли имеет

контекста. Типичным примером может служить

смысл говорить о заметной суммарной стабили-

работа [3], в которой содержание альфа-спирали

зирующей роли метионина.

в пептиде-хозяине оценивалось спектроскопиче-

Аминокислоты, избегающие альфа-спираль, -

скими методами при замещениях на все 20 ами-

это Pro и Ser. Обращает на себя внимание то, что

нокислот (гость) и при этом учитывался кон-

в группу стабилизирующих альфа-спираль ами-

текст. Оценка свободной энергии позволила ав-

нокислот входят остатки, не имеющие ничего об-

торам прийти к выводу (не бесспорному), что

щего в их структуре и свойствах. Действительно,

только Ala и Glu доказательно являются спираль-

E и K несут заряд разного знака, A, M и L вообще

стабилизирующими, тогда как все остальные бо-

не имеют заряда и сильно различаются друг от

ковые цепи являются нейтральными или деста-

друга. Невозможно, по крайней мере, на первый

билизирующими.

взгляд, найти общее свойство этих остатков, ко-

Тем более неожиданными представляются об-

торое можно было бы считать ответственным за

наруженные в результате исследований факты,

формирование и/или стабилизацию альфа-спи-

которые не вяжутся с ролью аланина как некого

рали, да и вообще найти общее свойство этих

среднего представителя аминокислотного ряда,

остатков. Более того, объяснить способность об-

факты, которые не согласуются с данными о

разовывать спираль трудно даже для отдельных

структуре и свойствах этой молекулы.

остатков из этой группы и, пожалуй, особенно

трудно это сделать для аланина.

Соответствующие данные, представляющиеся

неожиданными, могут быть объединены под об-

В попытках объяснения свойств аланина са-

щей рубрикой: стабилизирующий вклад аланина.

мое естественное начать со свойств CH₃-группы.

При этом речь идет о стабилизации альфа-спира-

Поскольку боковая цепь аланина представляет

ли и левой спирали типа «полипролин II», а в ва-

собой метильную группу, в этом случае боковой

БИОФИЗИКА том 68

№ 2

2023

АЛАНИН: ОБЫЧНОЕ И НЕОЖИДАННОЕ

215

радикал имеет самый простой набор конформе-

дартных альфа-спиралях и в коньюгатах «под-

ров (+гош-, -гош- и транс-конформеры). Пред-

ложка-пептид» что позволяет, как утверждают

ставляется естественным соотносить свойства

авторы работы [8], говорить о внутренне прису-

CH₃-группы со свойствами всей аминокислоты,

щей этой аминокислоте спираль-образующей

тем более, что метильная группа сама по себе об-

тенденции.

ладает целым набором оригинальных свойств.

Особую роль при исследованиях таких по-

Так, существенная разница в динамике нуклеи-

движных групп, как CH₃-группа, очевидно, игра-

новых кислот и белков, как полагают, обусловле-

ет метод ЯМР. Работа [9] дает представление о

на свойствами метильных групп при почти пол-

тенденциях в исследованиях белков методом

ном отсутствии таковых в нуклеиновых кислотах

ЯМР-спектроскопии. На примере SH3-домена

и большом их содержании в белках. По мнению

альфа-спектрина авторы оценили энергию акти-

авторов работы [5] метильная группа служит пла-

вации барьеров вращения метильных групп. Для

стификатором и обеспечивает молекулярную

33 метильных групп SH3-домена средняя высота

гибкость. Метильные группы в ряде ферментов

барьера составила 0.9 ккал/моль. Эта величина

располагаются вокруг таких центров динамики

варьирует, в соответствии с моделью «жидкой»

как гибкие шарниры или активные центры. Эти

гидрофобной сердцевины белка, в зависимости

группы нельзя игнорировать при рассмотрении

от контактов с окружающими атомами. Но поря-

таких явлений как гидрофобность, фолдинг, эн-

док, который привел бы к систематическому по-

тропия. Авторы работы [5] полагают, что может

вышению (понижению) барьеров, отсутствует.

иметь место отбор числа и положения метильных

Для сравнения: молекулярная динамика приво-

групп в ходе эволюции биополимеров, что, на

дит к величине барьера от 3.1 до 3.5 ккал/моль.

наш взгляд, представляется спорным. Что бес-

Иногда изменение высоты барьера связано со

спорно, так это вовлеченность метильных групп в

слишком быстрым «отжигом» к температуре 0 К.

процессы гидратации и дегидратации. В белках

В нескольких случаях барьеры выше 10 ккал/моль

динамика строго координирована с раствори-

служат индикатором возмущения ван-дер-вааль-

телем.

совых контактов. Авторы констатируют, что

Оригинальные свойства аланина в аспекте

таким образом может быть проложен мостик

гидратации привлекают специалистов, владею-

между структурными и динамическими исследо-

щих самыми современными методами исследова-

ваниями.

ния. Так, ячейка гидратации аланина была

промоделирована с использованием квантовой

МИКРОКАЛОРИМЕТРИЯ

молекулярной динамики [6], что позволило ис-

следовать тонкие эффекты в ЯМР-химических

Теперь мы подходим к самой важной инфор-

сдвигах и непрямых спин-спиновых парных кон-

мации - результатам физических экспериментов.

стант для разных ионных форм этого соединения.

С помощью прямых определений термодинами-

Обнаружено существенное различие в радиаль-

ческих параметров методом микрокалориметрии

ных и угловых распределениях молекул воды во-

был оценен вклад аланина в энтальпию перехода

круг растворенного вещества. Авторы работы [6]

«спираль-клубок» в альфа-спирали по сравне-

утверждают, что использование столь сложных

нию с другими аминокислотными остатками (ра-

методов является необходимым для исследова-

зумеется, при нормировании на количество ато-

ния не только свойств молекулы, но и ее взаимо-

мов в остатке). Был обнаружен аномально боль-

действий с окружающей средой, включая раство-

шой вклад аланина в энтальпию плавления

ритель и подложку.

альфа-спирального пептида, а также в энтропию.

Интересно, что аланин стабилизирует кон-

Высокий вклад аланина в энтальпию образо-

формацию типа «полипролин II» также и в так на-

вания альфа-спирали противоречит общеприня-

зываемых развернутых или неупорядоченных

тому взгляду, согласно которому энтропия долж-

белках, что убедительно доказано в работе [7].

на падать при образовании регулярных структур в

Между тем, свойства других аминокислот в на-

белках. Остановимся на этом моменте более по-

тивной глобуле и в развернутом состоянии могут

дробно.

существенно различаться. Таким образом, эти

Как известно, различные аминокислотные

белки не столь уж неупорядоченные, если при-

остатки по-разному влияют на термодинамиче-

нять во внимание превалирование конформации

скую стабильность альфа-спирали, что объясня-

типа «полипролин II», особенно в присутствии в

ют различием в потере конфигурационной энтро-

первичной структуре аланина.

пии боковой цепи при образовании спирали. В

Это постоянство в оригинальном свойстве

работе [10] на основании калориметрических ре-

проявляется не только в одинаковом эффекте

зультатов для двенадцати пептидов было обнару-

аланина в обычных и развернутых белках, но и,

жено, что имеют место существенные различия в

например, при сравнении его действия в стан-

энтальпии перехода «спираль-клубок» для раз-

БИОФИЗИКА том 68

№ 2

2023

216

ТУМАНЯН и др.

личных аминокислотных остатков. Конечно, тот

методом ЯМР, что, безусловно, влияет на гидра-

факт, что остатки аланина влияют на стабиль-

тацию и динамику.

ность альфа-спирали, был известен достаточно

В свете вышеизложенного мы приходим к за-

давно [11], но важны количественные оценки.

ключению о необходимости дальнейшего выяс-

Аланин в альфа-спирали стабилизирует спираль

нения роли аланина в контексте структуры,

по сравнению с Gly на 0.4 - 2.0 ккал/моль.

свойств и функции белка, при этом немалую роль

играет переосмысление полученных ранее дан-

Как отмечают многие авторы, аланин благо-

ных. Вскрытые противоречия носят парадоксаль-

приятным в смысле свободной энергии образом

ный характер и их интерпретация (прежде всего,

встраивается в альфа-спираль из-за энтропийно-

обоснование вклада аланина в энтальпию плавле-

го фактора. Действительно, для других аминокис-

ния в терминах фундаментальной физики) на се-

лот (кроме пролина и глицина) вхождение в аль-

годняшний день отсутствует. Между тем пред-

фа-спираль означает ограничение более или ме-

ставленные в работе данные и комментарии поз-

нее свободного вращения бокового радикала в

воляют надеяться на прогресс в разрешении

конформации клубка. По реалистичным оцен-

выявленных противоречий.

кам, потеря конформационной энтропии, пре-

пятствующая вхождению боковой цепи в альфа-

спираль, соответствует в среднем 1.11 ккал/моль^-1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для аланина эта потеря, естественно, отсутствует.

Основной результат работы заключается в де-

Как ротамерное напряжение, так и χ-напряжение

монстрации уникальных свойств аланина в кон-

для аланина равны нулю, что является дополни-

тексте участия этой аминокислоты в структуро-

тельным к энтропийному фактором, способству-

образовании белков и стабилизации их струк-

ющим формированию альфа-спирали аланин-

туры.

содержащими цепями, и суммарный эффектив-

ный выигрыш для аланина по сравнению с други-

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

ми аминокислотами составляет 1.08 ккал/моль^-1,

если принять оценки, приведенные в работе [12].

Работа выполнена при финансовой поддержке

Российского научного фонда (проект № 22-24-

00936).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

Какие же объяснения доминирующей роли

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

аланина в формировании альфа-спирали можно

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

представить с точки зрения современной физи-

интересов.

ко-химии белка?

Прежде всего, трудно говорить о стабилизиру-

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

ющих ван-дер-ваальсовых контактах остатка ала-

нина с атомами остова полипепидной цепи. Вза-

Настоящая статья не содержит каких-либо ис-

имодействия типа «остаток-остаток» для алани-

следований с участием людей или животных в ка-

на весьма редки, а на участках скопления

честве объектов исследований.

аланинов исключены, между тем, эффект алани-

на носит аддитивный характер. Точно также труд-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

но делать выводы о благоприятном вкладе элек-

тростатики, поскольку парциальные заряды на

1. J. Wang, E. C. Salihi, and L. Šiller, Mater. Sci. Engi-

атомах водородов метильной группы весьма ма-

neer., 72 (2), 1 (2017).

лы. Очевидно, что исключены и водородные свя-

2. V. E. Gray, R. J. Hause, and D. M. Fowler, Genetics,

зи. Исследователи, изучающие роль квантово-хи-

207, 53 (2017).

мических эффектов для разных конформаций

3. J. Yang, E. J. Spek, Y. Gong, et al., Prot. Sci., 6, 1264

остова полипептидной цепи, не отмечают каких-

(1997).

либо особенностей, связанных с аланином. На-

4. Y. Wu, M. Lu, M. Chen, et al., Prot. Sci., 16, 1449

конец, трудно привлечь для объяснения роли ала-

(2007).

нина данные о гидратации альфа-спирали. Учи-

5. J. D. Nickels, J. E. Curtis, H. O’Neill, and A. P. So-

тывая внешнее расположение остатка аланина в

kolov, J. Biol. Phys. 38, 497 (2012).

альфа-спирали и скорее гидрофобный характер

6. M. Dracınsky, J. Kaminsky, and P. Bour, J. Phys.

этого остатка, нет оснований предполагать суще-

Chem. B, 113, 14698 (2009).

ственную разницу в характере гидратации алани-

7. S. Toal and R. Schweitzer-Stenner, Biomolecules, 4,

на в альфа-спирали и в денатурированной форме

725 (2014).

белка. Последнее, что можно представить, - это

8. C. A. Rohl, W. Fiori, and R. L. Baldwin, Proc. Natl.

быстрое вращение CH₃-группы, детектируемое

Acad. Sci. USA, 96, 3682 (1999).

БИОФИЗИКА том 68

№ 2

2023

АЛАНИН: ОБЫЧНОЕ И НЕОЖИДАННОЕ

217

9. Y. Xue, M. S. Pavlova, Y. E. Ryabov, et al., J. Am.

11. L. Serrano, J. L. Neira, J. Sancho, and A. R. Fersht,

Chem. Soc., 129, 6827 (2007).

Nature, 356 (6368), 453 (1992).

10. J. M. Richardson, M. M. Lopez, and G. I. Makhata-

12. S. Penel and A. J. Doig, J. Mol. Biol., 305 (4), 961

dze, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102 (5), 1413 (2005).

(2001).

Alanine: from the Usual to the Unexpected

V.G. Tumanyan*, A.A. Anashkina*, I.V. Filatov**, K.V. Smirnov*,

I.Yu. Torshin***, and N.G. Esipova*

*Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, ul. Vavilova 32, Moscow, 119991 Russia

**Moscow Institute of Physics and Technology, Institutskiy per. 9, Dolgoprudny, Moscow Region, 141700 Russia

***Dorodnicyn Computing Centre, Russian Academy of Sciences, ul. Vavilova 40, Moscow, 119333 Russia

Data from the experiments provides a possibility to talk about anomalously large contribution of alanine to

the stability of an alpha-helix and other protein conformations. Independent data (and also experimental

ones) suggest that alanine plays an especially big role in stabilization of the alpha-helix. This can be seen

through the positive contribution of alanine both to the entropy of the system and to the enthalpy. The high

contribution of alanine to the enthalpy of formation of the alpha helix contradicts the generally accepted view

that the entropy should decrease during the formation of regular structures in proteins. Among three types of

helices in proteins, alanine stabilizes two secondary structures: the alpha helix and the left helix of polyproline

II, and in the case of fibrillar proteins, alanine also stabilizes the beta sheet. The stabilizing effect of alanine

on the alpha helix structure extends to both natively unfolded proteins and alpha helix-support conjugates.

Thus, it is no exaggeration to say that formation of secondary structure relies on alanine. The revealed con-

tradictions are of paradoxical nature and yet there is no interpretation of the above-mentioned findings (first

of all, substantiation of the contribution of alanine to the enthalpy of fusion in terms of fundamental physics)

so far to resolve them. Meanwhile, the data and comments presented in this work hold out the promise of

progress in resolving the revealed contradictions.

Keywords: alanine, conformationally stable/labile protein segments, local protein structure, conformational anal-

ysis, statistical analysis, NMR, molecular dynamics

БИОФИЗИКА том 68

№ 2

2023