БИОФИЗИКА, 2023, том 68, № 2, с. 320-333

БИОФИЗИКА КЛЕТКИ

УДК 611.822.5:576.311.332:57.086.3

ДВА СУБКОМПАРТМЕНТА ГЛАДКОГО ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО

РЕТИКУЛУМА В ПЕРИСИНАПТИЧЕСКИХ ОТРОСТКАХ АСТРОЦИТОВ:

УЛЬТРАСТРУКТУРА И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ В СИНАПСАХ ГИППОКАМПА

И НЕОКОРТЕКСА

*Институт биофизики клетки РАН - обособленное подразделение ФИЦ «Пущинский научный центр биологических

исследований РАН», Институтская ул., 3, Пущино Московской области, 142290, Россия

^#E-mail: ckpem.icb.ras@gmail.com

Поступила в редакцию 03.02.2023 г.

После доработки 03.02.2023 г.

Принята к публикации 17.02.2023 г.

Перисинаптические отростки астроцитов, участвуя в работе трехчастного синапса, отвечают на его

активацию локальной деполяризацией с высвобождением ионов кальция из внутриклеточных депо

в узлах ветвления отростков и проявляют локальные или генерализованные кальциевые события.

Однако по результатам первых электронно-микроскопических исследований сформировалось

мнение, что терминальные ламеллы астроцитов лишены каких-либо органелл, включая основное

депо ионов кальция астроцитов - цистерны гладкого эндоплазматического ретикулума (sER).

Анализ цистерн гладкого эндоплазматического ретикулума действительно может быть ограничен

их слабым электронным контрастом, исследованием астроцитарных отростков на одиночных

срезах и недостаточным оптическим разрешением используемых приборов. В данной работе с

использованием просвечивающей электронной микроскопии и 3D-реконструкции на серийных

срезах мы провели анализ отростков астроцитов в синапсах гиппокампа и коры мозга мыши. В

результате усиления контраста элементарных мембран впервые показано, что перисинаптические

отростки астроцитов с морфологией тонких веточек содержат два типа цистерн гладкого

эндоплазматического ретикулума и микровезикулы. В отличие от веточек, мембранные органеллы

в терминальных ламеллах представлены лишь короткими фрагментами тонких цистерн гладкого

эндоплазматического ретикулума и микровезикулами, группы которых имеют тенденцию

располагаться в непосредственной близости от активных зон наиболее активных синапсов. В работе

обсуждается вопрос адекватности применения альтернативных методов электронной микроскопии

в исследованиях астроцитарного микроокружения синапсов и структурно-функциональные

аспекты компартментализации цистерн гладкой эндоплазматической сети в перисинаптических

отростках астроцитов.

Ключевые слова: перисинаптические и терминальные отростки астроцитов, гладкий эндоплазматиче-

ский ретикулум, гликоген, просвечивающая электронная микроскопия, сканирующая электронная мик-

роскопия, 3D-реконструкция.

DOI: 10.31857/S0006302923020126, EDN: CAZEOI

синапсами не только методами высокоразрешаю-

Наиболее поразительной особенностью уль-

щей световой, но и электронной микроскопии

траструктуры астроцитов, в отличие от нейронов,

[1]. Дистальный отдел отростков представлен

является чрезвычайно сложная пространствен-

контактирующими с синапсами периферически-

ная организация их разветвленных и взаимосвя-

ми отростками и узлами их ветвления [2, 3], в ко-

занных отростков, что накладывает существен-

торых наблюдаются спонтанные Ca²⁺-события

ные ограничения на анализ их взаимодействия с

или фокусы локальной деполяризации со значи-

тельной Са²⁺-компонентой в ответ на электриче-

Сокращения: sER - гладкий эндоплазматический ретику-

скую стимуляцию входящих аксонов [4]. Резуль-

лум, PAP - перисинаптические отростки астроцитов,

TAP - терминальные отростки астроцитов, SEM - скани- таты этих электрофизиологических и имиджин-

рующая электронная микроскопия, 3D - трехмерный, говых экспериментов предполагают наличие в

IP3R - рецептор инозитол трифосфата, RyR - рецептор

периферических отростках депо ионов Ca²⁺.

рианодина, PSD - постсинаптическое уплотнение..

320

ДВА СУБКОМПАРТМЕНТА ГЛАДКОГО ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА

321

Но если в нейронах гладкая эндоплазматиче-

нием астроцитарных отростков на одиночных

ская сеть достаточно подробно описана [5-7], то

срезах или недостаточным оптическим разреше-

ультраструктура и распределение органелл в пе-

нием используемых приборов. Данная работа от-

рисинаптических отростках астроцитов до сих

части заполняет этот пробел.

пор не изучены в должной мере [1]. Тем не менее,

В литературе присутствует довольно широкая

на иллюстрациях в ряде работ можно видеть ци-

терминология отростков астроцитов [1], в кото-

стерны гладкого эндоплазматического ретикулу-

рой наибольшую путаницу вносят два термина:

ма (sER) в перисинаптических отростках в непо-

«перисинаптические астроцитарные отростки» и

средственной близости от интерфейсов «аксон-

«периферические астроцитарные отростки» с

шипик» (с использованием просвечивающей

одинаковой аббревиатурой РАР. Поскольку

электронной микроскопии - рис. 31 в работе [8],

en passant отростки или веточки, проходящие ря-

рис. 2, 5 и 7 в работе [9], рис. 1 и 5 в работе [10],

дом с синапсами, также можно считать периси-

рис. 2 и 5 в работе [11], рис. 2 и 3 в работе [12],

наптическими, то для большей ясности здесь и

рис. 1 и 5 в работе [13], рис. 4 в работе [14]; с

далее мы будем именовать дистальные отростки

использованием серийного сканирования по-

астроцитов в целом как перисинаптические

верхности блока (SBF-SEM) - рис. 5 в работе

(РАР), будь то en passant или оканчивающиеся

[15]). Наряду с цистернами sER в перисинаптиче-

вблизи синапсов, и терминальные (TAP), кото-

ских отростках было показано наличие иммуно-

рые оканчиваются, как будет видно по ходу изло-

меченных на глиотрансмиттеры и их транспорте-

жения, в значительной части вблизи активных

ры слабоконтрастных микровезикул, сходных с

зон синапсов. В данной работе мы сфокусирова-

синаптическими [16, 17]. Однако, поскольку кла-

лись главным образом на анализе TAP, но содер-

стеры этих микровезикул невозможно было обна-

жащим протяженные цистерны sER веточкам

ружить в периферических отростках, существует

также уделили внимание.

серьезный скептицизм в отношении Са²⁺-зави-

С использованием просвечивающей элек-

симого высвобождения глиотрансмиттеров [1].

тронной микроскопии серийных ультратонких

Более десяти лет назад была акцентирована

срезов мы провели анализ отростков астроцитов в

необходимость анализа ультраструктуры нейрон-

синапсах гиппокампа и слоя I сенсомоторной ко-

глиального взаимодействия с применением

ры мозга мыши с применением 3D-реконструк-

сложных и затратных по времени методов трех-

ции синапсов. Вследствие усиления контраста

мерной (3D) реконструкции с высоким простран-

элементарных мембран путем двойного осмиро-

ственным разрешением [1]. Первая попытка ана-

вания с феррицианидом калия в значительной

лиза sER в астроцитарных отростках с примене-

степени возрастает и электронная плотность гра-

нием 3D-реконструкции была предпринята на

нул гликогена, богато представленных в PAP аст-

серии негативов, полученных при увеличении

роцитов слоя I коры [23]. Во избежание интерфе-

×6K и отсканированных с разрешением 1200 dpi

ренции изображений поперечных сечений ци-

[18], что дает финальное разрешение изображе-

стерн sER, имеющих сходные диаметры с

ния 3.4 нм/пиксель и приблизительно соответ-

β-гранулами гликогена, мы воспользовались фе-

ствует порядку разрешений сканирующей элек-

номеном быстрой посттравматической разборки

тронной микроскопии с сфокусированным ион-

гликогена в результате эвтаназии путем церви-

ным пучком (FIB-SEM) - 8-4 нм/пиксель (см.,

кальной дислокации. Остающиеся в PAP мало-

например, работу [7]). В работе [18] авторы не ис-

размерные органеллы на малых увеличениях по

пользовали такие усилители контраста как фер-

морфологии и размерам были сходны с гранула-

ри- или ферроцианид калия или тиокарбогидра-

ми гликогена. Однако при разрешениях изобра-

зид [19, 20], поэтому, как и в пионерской работе

жений, в 10-15 раз превышающих достижимые

на одиночных срезах [21], так и в результате ана-

разрешения в сканирующей электронной микро-

лиза серийных срезов, органеллы в перифериче-

скопии (SEM), становится очевидно, что эти ор-

ских отростках обнаружены не были. В результа-

ганеллы имеют мембранную природу.

те, несмотря на ряд приведенных выше фактов

наличия органелл в перисинаптических отрост-

Анализ свободных от гранул гликогена PAP на

ках, закрепилось устойчивое мнение, что пери-

серийных срезах показывает, что PAP астроцитов

ферические отростки астроцитов лишены каких-

с морфологией тонких веточек содержат микро-

либо органелл, включая элементы эндоплазмати-

везикулы и два типа цистерн sER. Изменение

ческой сети, поэтому астроцитарные отростки по

морфологии от одного типа sER к другому по ходу

настоящее время классифицируют на ветви, со-

одной цистерны предполагает взаимосвязан-

держащие органеллы, и свободные от органелл

ность двух компартментов sER. Как сужение ци-

листочки или ламеллы [2, 22]. Обнаружение орга-

стерн до диаметра ~20 нм и менее, так и наличие

нелл и, в частности, цистерн sER в отростках аст-

в отростках коротких тонких фрагментов sER

роцитов действительно может быть ограничено

предполагает фрагментацию sER с отщеплением

их слабым электронным контрастом, исследова-

от расширенных цистерн тонких коротких фраг-

БИОФИЗИКА том 68

№ 2

2023

322

ШИШКОВА, РОГАЧЕВСКИЙ

ментов. В отличие от тонких веточек мембранные

становленного с феррицианидом калия OsO₄ на

органеллы в TAP представлены лишь короткими

0.1 М какодилатном буфере, содержащем 0.01%

тонкими цистернами sER и микровезикулами.

K₂Cr₂O₇ и 50 мМ сахарозы. 1.5% феррицианида

Результаты

3D-реконструкции обнаруживают

калия (K₃[Fe(CN)₆]) добавляли непосредственно

нестохастическое распределение микровезикул и

перед использованием. Далее образцы были от-

фрагментов тонких цистерн в PAP; цистерны sER

мыты деионизированной водой в течение ночи.

и группы микровезикул имеют тенденцию распо-

Затем образцы фиксировали в 1%-м растворе

лагаться в непосредственной близости от актив-

OsO₄ на деионизированной воде с 0.01% K₂Cr₂O₇

ных зон наиболее активных синапсов.

также в течение 3.5 ч при комнатной температуре.

Сопоставление с данными иммуноэлектрон-

Далее образцы были отмыты деионизированной

ной микроскопии [16, 17] позволяет считать тон-

водой и оставлены в ней на сутки при 4°С. После

кие sER как ультраструктурной основой и пер-

этого ткань обезвоживали в возрастающих кон-

вичным звеном развития спонтанных и индуци-

центрациях этанола, в 100%-м этаноле и 100%-м

рованных Ca²⁺-событий в TAP, так и

ацетоне и пропитывали смесью смол со 100%-м

необходимым условием для Са²⁺-зависимого ве-

ацетоном в объемном отношении 1:1 в течение

зикулярного высвобождения глиотрансмиттеров

суток при

4°С (соотношение смесей смол

вблизи активных синапсов.

EMBed812/NMA и EMBed812/DDSA составляло

3:7). Образцы переносили в смесь смол без ацето-

на и полимеризовали 24 ч при 37°С, а затем - 48 ч

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

при 60°С.

Фиксация ткани мозга. В эксперименте ис-

Приготовление и контрастирование срезов. Для

пользованы самцы мышей линии C57BL/6 (воз-

получения ультратонких срезов на поверхности

раст 3 месяца, масса 26-31 г). Одно животное ане-

отвержденных блоков с тканью затачивали пира-

стезировали изофлураном до снижения частоты

мидки в области слоев I и II-III сенсомоторной

дыхательных движений. Эвтаназию другого про-

коры и в дистальной относительно сом нейронов

водили путем цервикальной дислокации. После

зоне слоя Str. radiatum в CA1-области гиппокампа.

декапитации мозг извлекали и к 110-140 с после

Срезы номинальной толщиной 50-70 нм получа-

декапитации получали готовые слайсы толщиной

ли при помощи алмазного ножа на ультрамикро-

~0.5 мм при помощи ручного триммера ориги-

томе EM UC6 (Leica, Германия). Срезы монтиро-

нальной конструкции с частотой движения лез-

вали на гидрофилизированные в тлеющем разря-

вия 80-90 Гц. Получение коронарных срезов

де медные бленды с пленкой-подложкой из

проводили на охлажденной силиконовой под-

пиолоформа, укрепленной аморфным углеродом.

ложке непосредственно в капле предоблученного

Контрастировали срезы последовательно солями

в микроволновой печи фиксатора с температурой

лантаноидов (UranyLess [24]) и модифицирован-

4°С, содержащего 3% формалина и 1.25% глута-

ным тройным свинцовым красителем Сато [25].

рового альдегида на 0.1 M натрий-какодилатном

Получение, обработка и анализ изображений.

буфере, содержащем 2 мМ CaCl₂, 4 мМ MgCl₂ и

Изображения серийных срезов слоев I и II-III

50 мМ сахарозы. Временной диапазон между де-

коры мозга фотографировали на фотопленку в

капитацией и погружением трех-пяти срезов тка-

режиме монтажа из 2×3 взаимно перекрываю-

ни во флакон с тем же фиксатором не превышал

щихся кадров при прямом увеличении ×12K на

2.5 мин. Флаконы с тканью, содержащие 5 мл то-

просвечивающем электронном микроскопе JEM-

го же фиксатора с исходной температурой 4°С,

1200EX (Jeol, Япония). Микрофотографии оди-

облучали микроволнами при мощности магне-

ночных срезов получали при прямом увеличении

трона 100 Вт в холодной точке микроволновой пе-

×6-30K. Вращением сеточки серийные срезы

чи в режиме 20 с вкл./20 с охлаждение/20 с вкл.;

ориентировали так, чтобы длинная сторона каж-

температура фиксатора после облучения по дан-

дого отдельного среза в серии располагалась па-

ным точечного термометра не превышала 30°С.

раллельно длинной стороне негатива (условная

Спустя 6 ч хранения срезов ткани в фиксаторе

ось X), что позволяло в последующем оценить

при 4°С последний был заменен на вторичный

степень поперечного сжатия срезов, происходя-

фиксатор без формалина, но содержащий 2.5%

щего в процессе их получения (по условной

глутарового альдегида. Срезы во вторичном фик-

оси Y). Полученные негативы оцифровывали с

саторе были обработаны микроволнами, как опи-

использованием сканера Perfection V700 (Epson,

сано выше, и оставлены в фиксаторе при 4°С.

Япония) с разрешением 2400 dpi. Значения фак-

Спустя сутки образцы были трижды отмыты в вы-

тического увеличения получали на основе калиб-

шеуказанном буфере при помощи микроволн.

ровочной реплики (2160 линий на 1 мм; SPI

Постфиксация и заключение ткани в смолы. Об-

02902-AB), отснятой на тех же увеличениях. В ре-

разцы постфиксировали дважды. Сначала - 3.5 ч

зультате фактическое разрешение одного пиксе-

при комнатной температуре в 1%-м растворе вос-

ля изображения, полученного при ×6, ×12, ×15 и

БИОФИЗИКА том 68

№ 2

2023

ДВА СУБКОМПАРТМЕНТА ГЛАДКОГО ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА

323

Рис. 1. Ультраструктура органелл астроцитарных отростков в нейропиле слоя I сенсомоторной коры мыши. (а) -

Декапитация после глубокой анестезии; (б)-(г) - декапитация после цервикальной дислокации, без анестезии.

Звездочками помечены профили сечений перисинаптических астроцитарных отростков. На изображении нейропиля

анестезированного животного на панели (а) почти во всех профилях астроцитарных отростков можно наблюдать

одиночные гранулы гликогена или их скопления. Стоит обратить внимание на полное отсутствие гранул гликогена на

панелях (б)-(г). Условные обозначения и сокращения: i и ii - области, представленные на большем увеличении; а -

сечения немиелинизированных аксонов; г - гликоген (β- и γ-частицы); гЭР - гладкий эндоплазматический ретикулум;

Д - дендриты; М - митохондрия; мт - микротрубочки; СВ - синаптические везикулы; Ш - головка дендритного

шипика. Номинальная толщина среза на панели (а) - 70 нм, на панелях (б)-(г) - 50-60 нм. Шкалы на основных

панелях - 250 нм, на врезках i и ii - 100 нм, на врезках панелей (в) и (г) - 50 нм.

×30K, составляло 1.7, 0.85, 0.67 и 0.34 нм соответ-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ственно. Эластичную сшивку отдельных кадров в

Выбор метода эвтаназии для демаскирования

бесшовный монтаж и сборку серий монтажей в

цистерн sER. Для лучшей визуализации цистерн

стек взаимовыровненных изображений проводи-

sER после глутаральдегидной фиксации ткани мы

ли при помощи плагина TrakEM2 для ImageJ [26].

использовали двойное осмирование с феррициа-

Для оценки средних значений поперечного сжа-

нидом калия и контрастирование срезов с ура-

тия срезов измеряли диаметры не менее 300 си-

нилацетатом, лантаноидами или танинами и со-

наптических везикул в возбуждающих синапсах

лями свинца. Но независимо от способа окраски

по осям X и Y по 100 везикул в начале, в середине

ультратонких срезов усиление контраста мембран

и в конце серии. Вычисленную степень сжатия

в процессе фиксации с K₃[Fe(CN)₆] значительно

срезов использовали для пропорционального

усиливает и контраст гликогеновых гранул [29-

растяжения изображений по оси Y. После ниве-

31].

лирования сжатия срезов рассчитывали фактиче-

На рис. 1а представлен фрагмент нейропиля

скую среднюю толщину срезов в серии методом

слоя I сенсомоторной коры мозга мыши в состо-

измерения диаметров цилиндрических структур

янии глубокой анестезии. Ранее было отмечено,

[27]. Качественный анализ, 3D-реконструкцию и

что среди слоев коры в слое I концентрация гра-

измерения диаметров цистерн sER проводили в

нул гликогена максимальна [23]. В светлых про-

программе Reconstruct 1.1.0.1 [28], визуализацию

филях сечений астроцитарных отростков отчет-

3D-объектов - в программе 3ds Max (Autodesk

ливо наблюдается большое число бета-гранул

Inc., США).

гликогена. Гранулы с диаметрами порядка 20-

БИОФИЗИКА том 68

№ 2

2023

324

ШИШКОВА, РОГАЧЕВСКИЙ

30 нм имеют типичную для них морфологию с на-

путем иммерсии и последующей микроволновой

личием рассеянных по профилю высоко элек-

обработки, которая, как известно, обеспечивает

тронно-плотных белковых гамма-частиц (увели-

превосходную сохранность ультраструктуры [56-

ченная область i) размером ~3-5 нм [32-35]. В от-

58].

дельных профилях астроцитов среди гранул

Перисинаптические отростки астроцитов содер-

гликогена можно наблюдать фрагменты цистерн

жат два типа контрастных цистерн sER. В резуль-

sER, сходные по диаметрам и электронной плот-

тате вышеописанных процедур мы получили пре-

ности с гранулами гликогена (увеличенная об-

параты ткани мозга с астроцитарными отростка-

ласть ii). Однако по периферии элементарной

ми, свободными от гранул гликогена. На рис. 1б

мембраны цистерн на цитоплазматическом и лю-

представлен астроцитарный отросток, изолирую-

минальном листе бислоя, как и в люмене ци-

щий синапс, дендритный шипик и пресинапти-

стерн, также можно видеть частицы с высокой

ческий бутон, от окружающего нейропиля. В про-

электронной плотностью, сходные по размерам с

светленной цитоплазме астроцитарных отрост-

гамма-частицами гликогена, что делает их попе-

ков можно наблюдать лишь три типа органелл:

речные сечения практически неотличимыми от

митохондрию в расширенном профиле отростка;

гликогена. В богатых гликогеном тканях, в гепа-

тангенциальные сечения цистерн sER с диамет-

тоцитах и миоцитах, бета-гранулы гликогена

рами 30-60 нм, сходные по ширине с цистернами

плотно ассоциированы с цистернами эндоплаз-

sER в дендритах, а также органеллы сходные по

матического ретикулума [36-39]. По-видимому,

размерам сечений с тонкими «нитевидными» ци-

сходная ультраструктурная организация гликоге-

стернами sER немиелинизированных аксонов.

нолитического комплекса свойственна и отрост-

Такие органеллы имеют чуть меньший диаметр

кам астроцитов [35, 40]. Так, в центре левой части

(около 10-30 нм, врезка ii на рис. 1б) и электрон-

рис.1а расположено плотное скопление гранул,

ную плотность, по сравнению с нитевидными ци-

среди которых присутствуют поперечные сечения

стернами в аксонах (врезка i на рис. 1б).

цистерн ретикулума, но ввиду сходства их морфо-

логии с гранулами гликогена идентифицировать

При анализе даже большого поля изображения

их чрезвычайно сложно.

расширенные цистерны sER в периферических

астроцитарных отростках встречаются редко, но

Демаскировать цистерны sER можно, выбрав

иногда их можно наблюдать не только рядом с го-

соответствующий метод эвтаназии и химической

ловками дендритных шипиков (рис. 1б), но и в

фиксации, которые сами по себе могут вносить

непосредственной близости от синаптической

значительный вклад в экспериментальные дан-

щели или интерфейса аксон-шипик (рис. 1в,г).

ные [41-43]. Так, если анестезия в течение часа не

Но в результате предварительного анализа серий-

меняет количество гликогена в мозге или печени

ных срезов создается впечатление, что такие про-

[44, 45], то ишемия в результате прекращения

фили перисинаптических отростков, содержа-

кровоснабжения или декапитации неанестезиро-

щих длинные (от 0.1 до 3 мкм и более) расширен-

ванного животного приводит к восполнению

ные цистерны sER, представляют собой тонкие

концентрации лактата в мозге за счет быстрой

протяженные веточки астроцита, проходящие

разборки гликогена в астроцитах [46, 47] и более

вблизи синапса. В большинстве же терминальных

чем десятикратному снижению его концентра-

отростков астроцита, как это будет показано в хо-

ции в течение одной-двух минут в результате

де дальнейшего изложения, органеллы представ-

взрывной посттравматической активации сен-

лены короткими фрагментами «нитевидных» ци-

сорных входов [48-53]. Фиксация путем тран-

стерн и/или группами малоразмерных структур,

скардиальной перфузии анестезированных жи-

сходных с поперечными сечениями таких ци-

вотных также сильно снижала количество глико-

стерн.

гена в мозге по сравнению с микроволновой

эвтаназией [23]. Но перфузии предшествовала от-

Если в высококонтрастных тонких цистернах

мывка в течение 5 мин, а первичный этап фикса-

sER аксонов липидный бислой и люмен цистер-

ции занимал не менее 10 мин. При том, что пери-

ны как правило хорошо прослеживается даже на

синаптические отростки астроцитов - очень по-

небольших увеличениях порядка ×8K с разреше-

движные структуры как in vitro, так и in vivo [54,

нием изображения 1.33 нм/пиксель (рис. 1б,

55], любая задержка химической фиксации может

врезка i), то несмотря на общее усиление контра-

значительно влиять на структуру как самих от-

ста мембран, органеллы с диаметрами сечений

ростков астроцитов, так и лабильных цистерн

12-22 нм, представленные на врезкe ii на рис. 1б,

sER. Поэтому, чтобы демаскировать цистерны

имеют едва ли прослеживаемые бислой и цен-

sER в астроцитарных отростках, освободив поле

тральный просвет. Данные органеллы не имеют

зрения от гликогена, мы воспользовались фено-

свойственных гликогеновым гранулам электрон-

меном быстрой посттравматической разборки

но-плотных частиц размером ~3-5 нм, но все же

гликогена в результате цервикальной дислокации

остается неясно, не являются ли они резистент-

с последующей быстрой фиксацией ткани мозга

ными к разборке «элементарными» бета-частица-

БИОФИЗИКА том 68

№ 2

2023

ДВА СУБКОМПАРТМЕНТА ГЛАДКОГО ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА

325

Рис. 2. Ультраструктура цистерн гладкого эндоплазматического ретикулума в отростках астроцитов и нейронов

гиппокампа. (а) - Изображение нейропиля молекулярного слоя CA1-области гиппокампа получено при прямом

увеличении микроскопа

×6K с финальным разрешением изображения

1.7 нм/пиксель. Внутри профилей

астроцитарных отростков (помечены звездочками) темные точки неотличимы по электронной плотности и размерам

от гранул гликогена. Увеличенные фрагменты i и ii получены при ×15K и ×30K с финальным разрешением

изображения

0.67 и

0.34 нм/пиксель соответственно. Увеличенные изображения дополнены диаграммами

относительной электронной плотности (ось Y, шкала серого от 0 до 100%), измеренной с усреднением по 10 пикселям

изображения, вблизи осей, проходящих через окончания пунктирных линий (ось X, шаг деления 5 нм). Наибольшие

и наименьшие диаметры органелл на увеличенных фрагментах врезок i и ii по осям X/Y составляют 17/25 и 24/16 нм

соответственно. Диаметры поперечных сечений органелл на врезках i и ii (в среднем ~20 нм) чуть меньше или

соответствуют поперечным диаметрам

(~20-30 нм) тонких электронно-плотных

«нитевидных» цистерн,

тангенциальные или продольные сечения которых можно наблюдать в соседних немиелинизированных аксонах. (б) -

Изображение из той же области гиппокампа получено при прямом увеличении микроскопа ×30K. Электронная

плотность просвета цистерн sER типа I и типа II и их элементарных мембран в астроцитах сходны с таковыми у

цистерн sER в аксонах, дендритах и шипиковом аппарате в нейронах. Условные обозначения и сокращения: i и ii -

области, представленные на большем увеличении; I - тонкие нитевидные контрастные цистерны типа I; II -

цистерны типа II с контрастной мембраной и расширенным до

30-60 нм люменом; а

- сечения

немиелинизированных аксонов; гЭР - гладкий эндоплазматический ретикулум; Д - дендриты; М - митохондрии;

мт - микротрубочки; Ш - головка дендритного шипика; ША - шипиковый аппарат; ЩК - щелевой контакт. Шкала

на основной панели (а) - 500 нм, на врезках i и ii панели (а) - 100 нм, на увеличенных фрагментах - 50 и 25 нм

соответственно увеличению; на основной панели (б) - 250 нм, на врезках панели (б) - 100 нм.

ми гликогена [59] с гидродинамическим радиу-

неотличимы от бета-гранул гликогена (увеличен-

сом ~12 нм и диаметром ~24 нм. Как отмечалось

ная область i), то более детальный их анализ на

ранее, интерпретация морфологии тонких ци-

изображениях с финальным рабочим разрешени-

стерн осложняется также и тем, что фиксация с

ем 0.67 и 0.34 нм/пиксель, что в 10-15 раз превы-

восстановленным осмием приводит как к волно-

шает стандартное разрешение SEM, позволил

образному искривлению мембран sER [31], так и

четко идентифицировать такие объекты как

к коллапсу люмена до столь малых размеров, что

структуры, имеющие мембранную природу. При

его уже невозможно идентифицировать с помо-

удачно прошедшем сечении через такие органел-

щью FIB-SEM с разрешением изображения в

лы можно отчетливо наблюдать центральный

4 нм/пиксель [7].

просвет цистерны и трехслойную элементарную

Чтобы убедиться, что наблюдаемые нами ма-

мембрану толщиной в 4 нм, с центральным свет-

лоразмерные органеллы в отростках астроцитов

лым слоем в ~1.5-2.0 нм, соответствующим слою

имеют мембранную природу, мы проанализиро-

гидрофобных липидных хвостов, и аморфным

вали их на больших увеличениях. Если на увели-

электронно-плотным материалом, декорирую-

чении ×6K (рис. 2а) такие органеллы ни по разме-

щим бислой как со стороны люмена, так и цито-

рам, ни по электронной плотности совершенно

плазмы. Несмотря на

«шум», создаваемый

БИОФИЗИКА том 68

№ 2

2023

326

ШИШКОВА, РОГАЧЕВСКИЙ

аморфным материалом по периферии мембраны,

ем ионов Ca²⁺ в более крупные веточки [3].

наличие бислоя отражается и в минимумах, и в

Поэтому весьма интригующим было бы предпо-

максимумах относительной электронной плотно-

ложить наличие таких цистерн в терминальных

сти по ходу осей, проходящих через центры орга-

астроцитарных отростках, которые могли бы

нелл (рис. 2а, увеличенные области на врезках i

обеспечивать центростремительное распростра-

и ii).

нение волны ионов Ca²⁺ от окончаний терми-

В результате усиления контраста мембран при

нальных отростков до узлов их ветвления или ве-

беглом осмотре нейропиля наибольшее внима-

точек. Однако неизвестно, имеют ли цистерны

ние привлекают электронно-плотные цистерны

типа I в астроцитах сходную организацию с ци-

sER в аксонах и в чуть меньшей степени в дендри-

стернами аксонов. При беглом просмотре изоб-

тах (рис. 2б). Для удобства дальнейшего анализа

ражений нейропиля можно обратить внимание

мы условно обозначили сечения тонких кон-

на наличие большого числа как строго попереч-

трастных цистерн в аксонах и в астроцитах как

ных сечений контрастных цистерн в немиелини-

цистерны типа I, а цистерны с расширенным про-

зированных аксонах, так и присутствие в них тан-

светом в отростках астроцитов и в дендритах,

генциальных или продольных сечений sER

включая их специализированную форму - шипи-

(рис. 2б). Но обнаружить такие же сечения ци-

ковый аппарат, мы отнесли к цистернам типа II

стерн в астроцитарных отростках не удается даже

(рис. 2б, врезки i и ii).

при просмотре большой площади среза. Поэтому

sER дендритов нейронов и шипиковый аппа-

остается неясным, являются ли цистерны типа I

рат вовлечены в развитие ключевых феноменов

астроцитов протяженными цистернами или ко-

синаптической пластичности мозга - потенциа-

роткими их фрагментами, или даже отдельными

ции и депрессии синаптической передачи, вы-

везикулами.

свобождая ионы Ca²⁺ через рецепторы инозитол

Для решения этого вопроса мы провели анализ

трифосфата (IP3Rs) [60, 61] или рианодина (RyR)

цистерн sER на серийных срезах. С использова-

[62] и обеспечивая обратный захват ионов каль-

нием оптического дисектора мы подсчитали

циевой АТФазой эндоплазматического ретикулу-

плотность синапсов в гомогенном нейропиле

ма (SERCA) [63, 64]. Иммунореактивность на

двух слоев сенсомоторной коры. В слоях I и II-III

RyR наблюдается и в немиелинизированных ак-

она составляла 188 ± 16 и 154 ± 8 (mean ± SE,

сонах [64, 65], проведение импульса по которым

n = 3) в 100 мкм³ соответственно. Несмотря на от-

сопровождается быстрыми всплесками Ca²⁺ в ак-

сутствие достоверных различий в плотности,

соплазме [66]. Весьма вероятно, что высокая

большее значение предполагало охват большего

электронная плотность цистерн как шипикового

числа синапсов в одном поле зрения, поэтому

аппарата, так и цистерн sER в аксонах и дендри-

дальнейший анализ цистерн sER мы проводили в

тах во многом определяется высокой концентра-

нейропиле слоя I коры. Анализ не менее 200 мкм³

цией в них мембранных белков, в том числе от-

нейропиля слоя I сенсомоторной коры показал

ветственных за Ca²⁺-регуляцию проведения сиг-

отсутствие в астроцитарных отростках протяжен-

нала и синаптической передачи. Как можно

ных цистерн типа I, сходных с теми, что наблюда-

видеть на рис. 2б, цистерны типа I и типа II в аст-

ются в немиелинизированных аксонах (белая

роцитарных отростках сходны по электронной

стрелка в правой части срезов 1-6 на рис. 3а;

плотности и контрасту с цистернами sER в от-

врезка ii на срезе 4 на рис. 3а). В данной работе мы

ростках нейронов - в немиелинизированных ак-

не проводили масштабного количественно ана-

сонах, дендритах и дендритных шипиках. Поэто-

лиза цистерн sER, но детальный качественный

му весьма вероятно, что электронная плотность

анализ даже ограниченного объема нейропиля

цистерн sER в перисинаптических отростках аст-

позволяет составить представление об организа-

роцитов также формируется за счет высокой кон-

ции и распределении цистерн типа I в терминаль-

центрации в них белков, в том числе связанных с

ных перисинаптических астроцитарных отрост-

ионным обменом и внутриклеточной сигнализа-

ках. Так, в результате 3D-реконструкции сегмен-

цией.

тов синапсов по шести серийным изображениям,

Пул мембранных органелл TAP представлен

представленным на рис. 3, в терминальных от-

микровезикулами и короткими фрагментами ци-

ростках вблизи шести синапсов мы обнаружили

стерн типа I. Ранее было показано, что «нитевид-

лишь восемь цистерн типа I (отмечены стрелками

ные» цистерны в немиелинизированных аксонах

на врезках i-iii на рис. 3б и 3в). Профили цистерн

имеют длину до нескольких микрон, соединяя

типа I можно было проследить лишь на двух-трех

en passant бутоны по ходу нервного волокна [7].

и редко на четырех срезах в серии, что при рас-

По данным флуоресцентной микроскопии ини-

считанной толщине срезов (42 нм) составляет не

циация спонтанных кальциевых событий в астро-

более ~130-170 нм (TAP справа от щелевого кон-

цитах происходит на уровне их перисинаптиче-

такта на четвертом-пятом срезах и врезка i на чет-

ских отростков с последующим распространени-

вертом-шестом срезах на рис. 3а). Мы не наблю-

БИОФИЗИКА том 68

№ 2

2023

ДВА СУБКОМПАРТМЕНТА ГЛАДКОГО ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА

327

дали проникновения в TAP ни цистерн типа II, ни

мембраны в форме кавеол. Поэтому непонятно,

цистерн ретикулума, ассоциированного с мито-

являются ли источником коротких цистерн типа I

хондриями (рис. 3б,в). Другие органеллы в TAP

более протяженные цистерны типа II, или же они

были представлены только одиночными везику-

образуются в результате захвата части плазмати-

лами или их группами.

ческой мембраны в форме микровезикул и их

слияния в трубчатые структуры, подобно тому,

Ранее с использованием иммуноэлектронной

как это происходит в эндосомах пресинаптиче-

микроскопии в перисинаптических отростках

ских бутонов [75]. Иными словами, вопрос состо-

астроцитов было показано наличие сходных с си-

ит в том, являются ли наблюдаемые нами цистер-

наптическими, но меньшего размера (~30 нм)

ны типа I производными протяженной эндоплаз-

микровезикул, иммунореактивных на антитела к

матической сети или представляют собой

везикулярным транспортерам глутамата, целлуб-

кавеосомы/эндосомы

[76], сходные по своей

ревину и коагонисту глутаматных NMDA рецеп-

морфологии с цистернами sER.

торов D-серину, который высвобождается Ca²⁺-

На изолированной культуре кортикальных

зависимым образом [16, 17, 67]. Вполне вероятно,

астроцитов и в переживающих срезах гиппокампа

что и наблюдаемые нами везикулы, обладая сход-

было показано, что доминантным источником

ными размерами, представляют собой пул мик-

ровезикул, содержащих глиотрансмиттеры.

ионов Ca²⁺ для запуска кальциевых событий и

высвобождения глиотрансмиттеров являются два

Анализ серий изображений отростков позво-

внутриклеточных депо ионов Ca²⁺: RyR- и IP3R-

ляет наблюдать микровезикулы прикрепленны-

зависимые [67, 77-79]. При этом значительное

ми к плазматической мембране, в том числе с об-

разованием омега-подобных профилей (не пока-

число работ свидетельствует о проявлении Ca²⁺-

зано) по типу частичного слияния синаптических

событий на периферии астроцитарного ветвле-

ния, в маленьких веточках астроцитарной сети

везикул с мембраной аксонального бутона. Одна-

(см. обзор [80]). Так же и фокусы деполяризации

ко неясно, отражают ли такие профили процесс

высвобождения их содержимого, или же интер-

наблюдаются в дистальных отростках в непосред-

нализацию фрагмента мембраны в форме кавео-

ственной близости от синапсов, при этом ско-

лы. В то же время на рис. 3а можно видеть посте-

рость нарастания потенциала в них в ответ на вы-

сокочастотную стимуляцию снижается почти на

пенное сужение цистерны типа II (черные стрел-

ки на срезах 6-1 слева) с диаметром ~40 нм в

40% в среде с двукратно сниженной [Ca²⁺]_o [4].

цистерну типа I с диаметром ~15-20 нм (врезки i

Все эти данные предполагают наличие в TAP ци-

на срезах 3-1 на рис.3а). Цистерны кортикального

стерн sER, несущих IP3R или RyR. Однако по на-

sER эукариот - динамичные структуры, подвер-

стоящее время данные о наличии RyR или IP3R в

женные непрерывной перестройке, слиянию и

PAP, подтвержденные методами иммуноэлек-

расщеплению [68, 69]. Наблюдаемое на рис.3а

тронной микроскопии, отсутствуют.

сужение цистерны с увеличением кривизны ли-

В работе [17] иммуноцитохимически было по-

пидного слоя может быть признаком отщепления

казано наличие в PAP специфического маркера

тонких коротких фрагментов sER от кончиков

цистерн [70] с формированием коротких цистерн

sER - Ca²⁺-связывающего белка кальретикули-

типа I. Сужение цистерны типа II можно наблю-

на. Интересно, что метки на кальретикулин не

дать и на врезке рис. 1г. В массе сужение цистерн

перекрывались с метками на транспортер глута-

до считанных нанометров можно наблюдать в

мата VGLUT1, а метки на VGLUT1 не были коло-

нейритах в развивающемся мозге, особенно в ко-

кализованы с метками на кавеолин-1. Отсутствие

нусах роста, в которых происходит активная пе-

колокализации предполагало наличие раздель-

рестройка sER [31]. Отщепление нанометровых

ных пулов везикул, несущих VGLUT1 и кавео-

везикулярных фрагментов («везикулярный» sER)

лин-1. Одновременного иммуномечения на каль-

от протяженных цистерн было показано в миели-

ретикулин и кавеолин-1 авторы не проводили, но

низированных аксонах на серийных срезах и по-

отмечали, что если метка на кавеолин-1 распола-

сле импрегнации sER тетроксидом осмия [5, 71].

галась на сходных с синаптическими микровези-

Способствовать расщеплению цистерн sER в аст-

кулах, то метка на кальретикулин - над трубчаты-

роцитах мог бы как высокий уровень экспрессии

ми структурами. Согласно рис. 3 в работе [17] и

ATL3 [72], c наиболее слабой среди атластинов

рис. 6 в дополнительном материале к ней метка на

способностью сшивать фрагменты sER [73], так и

кальретикулин располагалась над цистернами

значительная подвижность перисинаптических

шириной ~40-60 нм, над сужающимися их участ-

отростков [54, 55, 74]. Но c другой стороны, ре-

ками до ~20 нм и над короткими фрагментами

зультаты иммуноэлектронной микроскопии по-

цистерн с диаметром ~16 нм. Размеры таких

казывают наличие кавеолина-1 внутри периси-

фрагментов сходны с размерами наблюдаемых

наптических отростков астроцитов [17], что пред-

нами цистерн типа I. Также и в пресинаптических

полагает

интернализацию плазматической

бутонах иммунная метка на IP3R наблюдается

БИОФИЗИКА том 68

№ 2

2023

ДВА СУБКОМПАРТМЕНТА ГЛАДКОГО ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА

329

Рис. 3. Ультраструктура цистерн sER в астроцитарных отростках в нейропиле слоя I сенсомоторной коры мозга мыши.

(а) - Фрагмент из шести срезов (1-6) в серии, характеризующий морфологию и распределение цистерн sER в

терминальных астроцитарных отростках в непосредственной близости от активных зон синапсов. Фрагменты

изображений серийных срезов захватывают шесть синапсов в окружении двух отростков астроцита - тонкой веточки

с терминальным отростком вблизи синапсов Ш5-Ш6 слева и широкой веточки, содержащей митохондрию с

перимитохондриальными цистернами ретикулума, от которой отходят терминальные отростки вблизи синапсов Ш1-

Ш4. Астроцитарные отростки помечены звездочками. Стоит обратить внимание на то, что ни цистерна типа II из

тонкой веточки, ни одна из цистерн sER, ассоциированного с митохондрией, не распространяется в TAP, которые

содержат только микровезикулы и цистерны sER типа I. В центре правой части панели (а) выделена область

с цистерной типа I в терминальном отростке, которая прослеживается только на трех срезах (врезки i на срезах 4-6

панели (а); врезка i на панели (в)). Cправа от щелевого контакта цистерну типа I можно проследить только на двух

срезах (срезы 4 и 5 панели (а); врезка iii панели (в)). С учетом рассчитанной средней толщины срезов в серии (42 нм)

длина этих цистерн составляет 84 и 126 нм соответственно. См. детальное описание в основном тексте. (б) - 3D-

реконструкция фрагмента дистальной тонкой веточки и терминальной перисинаптической ламеллы астроцита.

Фрагмент тонкой веточки содержит цистерну sER типа II (II на врезке i), а также микровезикулы и цистерны типа I

(отмечены стрелками на врезках i-iii). Тонкий уплощенный участок терминального отростка, отходящий от веточки

к синапсу 5, лишен цистерн sER и микровезикул, но их можно наблюдать в расширении терминального отростка

вблизи интерфейса «аксон-шипик» (врезка ii). (в) - Фрагмент расширенной астроцитарной веточки или узла

ветвления терминальных перисинаптических отростков астроцита, содержащего митохондрию (не показана) и

ассоциированные с нею цистерны гладкого и шероховатого ER. Цистерны типа I и микровезикулы проявляют

дифференциальное распределение в TAP, которое коррелирует с морфологическими критериями активности

синапсов. См. детальное описание в основном тексте. Условные обозначения и сокращения: в - веточка астроцита,

Д1 и Д2 - дендриты, М - митохондрии, мЭР - ассоциированный с митохондриями эндоплазматический ретикулум,

СВ - синаптические везикулы, СЩ - синаптическая щель, то - терминальный отросток, Ш1-Ш6 - головки

дендритных шипиков, соответствуют номерам синапсов 1-6 на 3D-реконструкции; ША - шипиковый аппарат,

шЭР - фрагмент шероховатого компартмента эндоплазматического ретикулума, ЩК - щелевой контакт между TAP.

В электронной версии PAP окрашены серо-голубым, шипики - серым, sER шипиков и шипиковый аппарат - темно-

серым, пресинаптические бутоны - аквамариновым, PSD - красным, цистерны типа I и типа II и микровезикулы -

темно-коричневым. Шкала на основной панели (а) - 500 нм, на врезках - 50 нм; шкалы на панелях (б) и (в) - куб с

гранью 250 нм.

активности синапса. В TAP вблизи этого синапса

основу и первичное звено в развитии Ca²⁺-собы-

тий в TAP.

расположена единственная цистерна типа I, уда-

ленная от интерфейса «аксон-шипик» на 260 нм

Цистерны sER типа I и микровезикулы в TAP ко-

(врезки i на срезах 4-6 на рис. 3а и 3в). Шипик 5

локализованы с активными зонами активных си-

также лишен шипикового аппарата, но в его нож-

напсов. Подавляющее число спонтанных Ca²⁺-

ке расположена цистерна sER, доходящая до го-

событий в астроцитарной сети не распространя-

ловки с PSD диаметром ~275 нм (срезы 1-4 на

ется центростремительно по веточкам астроцита,

рис. 3а и 3б). Его пресинаптический бутон содер-

а локально затухает [3]. Также и стимуляция вхо-

жит большее число синаптических везикул, а в

дов к группе синапсов приводит к возникнове-

непосредственно прилегающем к синаптической

нию кратковременных разного размера фокусов

щели TAP (звездочка на срезе 1 на рис. 3а) можно

деполяризации TAP [4]. Это говорит о том, отве-

наблюдать две коротких цистерны типа I и не-

ты периферических астроцитарных отростков на

сколько микровезикул (врезка ii на срезе 3 на

синаптическую активность и спонтанная Ca²⁺-

рис. 3а, врезка ii на рис. 3б). В головке шипика 6 с

активность TAP могут быть связаны как с актив-

диаметром PSD ~270 нм можно видеть цистерны

ностью конкретного синапса, с которым контак-

слаборазвитого шипикового аппарата (срез 1 на

тирует отросток, так и со структурной организа-

рис. 3а и 3б), значительное число синаптических

цией самого TAP.

везикул в бутоне, а в прилегающей тонкой веточ-

Мы провели пилотный анализ распределения

ке PAP расположены микровезикулы, цистерны

цистерн sER и везикул в TAP, представленных на

типа I и длинная цистерна типа II, проходящая в

рис. 3. Если шесть реконструированных синапсов

непосредственной близости от синаптической

упорядочить по возрастанию признаков их зрело-

щели (черная стрелка в левой части серии изобра-

сти и функциональной активности, таких как

жений на рис. 3а, врезка i на рис. 3б). При том, что

размер постсинаптического уплотнения (PSD)

в головке шипика 3 можно наблюдать лишь от-

[82] или активной зоны синапса и степени орга-

дельные цистерны sER, в его ножке располагает-

низации цистерн sER и шипикового аппарата [6],

ся хорошо развитый шипиковый аппарат (не по-

можно обнаружить взаимосвязь между активно-

казан), а PSD диаметром ~340 нм свидетельствует

стью синапса и распределением цистерн типа I и

о значительно большей его активности по сравне-

микровезикул. Так, дендритный шипик 4 лишен

нию с синапсами 4-6. В перисинаптическом аст-

не только шипикового аппарата, но и отдельных

роцитарном отростке справа от щелевого контак-

цистерн sER, что наряду с макулярной формой и

та расположена короткая цистерна типа I, тогда

диаметром PSD ~250 нм свидетельствует о слабой

как в отростке с большей площадью контакта с

БИОФИЗИКА том 68

№ 2

2023

330

ШИШКОВА, РОГАЧЕВСКИЙ

синаптической щелью (слева от щелевого кон-

са приводит к увеличению его изоляции астроци-

такта) можно наблюдать как цистерну типа I, так

тарными ламеллами [55], что объясняется высо-

и не менее 10 микровезикул (врезки ii на рис. 3в и

кой аффинностью глиальных клеток к

срезе 2 на рис. 3а). Также и вблизи интерфейсов

нейротрансмиттерам [88] и селективной ассоциа-

«аксон-шипик» высокоактивных синапсов 1 и 2,

цией PAP с наиболее активными синапсами [10].

один из которых обладает высокоразвитым ши-

Если в шипиках транспорт цистерн sER и везикул

пиковым аппаратом и наибольшей площадью

осуществляется миозинами II, VI, V [89], то о ме-

PSD, можно наблюдать скопления микровезикул

ханизмах транспорта эндомембран в PAP ничего

и цистерн типа I (врезка ii на срезе 4 на рис. 3а;

не известно. Поскольку кортикальный sER свя-

врезка iii на рис. 3в). Синапсы 1 и 2 на смежных

зан с цитоскелетом [68], то в отсутствие активно-

срезах в серии (не показано) имеют большую пло-

го транспорта мембранные органеллы могли бы

щадь контакта с TAP по сравнению с синапсами

затягиваться в ламеллы пассивным образом од-

3-6, соответственно и большее число микровези-

новременно с их ростом в окружении синапса.

кул и цистерн типа I вблизи с границами интер-

Однако тенденция цистерн типа I и микровези-

фейсов «аксон-шипик».

кул располагаться группами вблизи синаптиче-

ской щели активных синапсов позволяет предпо-

Очевидно, что распределение цистерн sER в

лагать существование механизма активного на-

TAP не случайно и результат пилотного анализа

правленного транспорта мембранных органелл в

всего лишь шести близлежащих синапсов свиде-

TAP. Потенциальным мотором в этом процессе

тельствует о тенденции микровезикул и цистерн

мог бы служить немышечный миозин Vа, кото-

типа I располагаться вблизи синаптических ще-

рый в культивируемых астроцитах осуществляет

лей или интерфейсов «аксон-шипик» тех синап-

направленный везикулярный транспорт [90].

сов, которые имеют характерные признаки высо-

кой активности. Такое распределение мембран-

Выше мы отмечали отсутствие в TAP расши-

ных органелл в PAP согласуется с относительным

ренных цистерн типа II. При том, что TAP часто

числом деполяризуемых TAP в результате высо-

имеют форму сильно уплощенных ламелл, про-

тиснутых между отростками нейронов, затяги-

кочастотной стимуляции и пропорцией грибо-

видных дендритных шипиков. Простой расчет по

вать крупные цистерны типа II в TAP, как это

рис. 4 в работе [4] показывает, что если в фокаль-

происходит в шипиках, в минутных временных

ной плоскости толщиной 1 мкм и площадью

интервалах было бы энергетически невыгодно. В

то же время нанометровые размеры элементар-

100 мкм² наблюдается ~25 фокусов деполяриза-

ных цистерн sER могут способствовать их мо-

ции, то с учетом плотности синапсов в слоях II-

бильности, облегчая направленную транспорти-

III коры (см. выше) отношение числа спотов де-

ровку через уплощенные участки. Если движение

поляризации к плотности синапсов составит

ламелл к активированному синапсу занимает ми-

25/154 (~1/6 или ~16%). Это значение приблизи-

нуты [55], то перестройка структуры кортикаль-

тельно соответствует или чуть больше пропорции

ного sER занимает считанные секунды [68, 69].

наиболее активных синапсов, образованных на

Пластичность TAP в совокупности с быстрой пе-

грибовидных шипиках (см., например, работы

рестройкой sER и мобильностью его элементов

[83, 84]). На рис. 3 из шести синапсов лишь один

могли бы обеспечивать быструю тонкую настрой-

имеет высокоразвитый шипиковый аппарат, а

ку нейрон-глиального взаимодействия в синап-

два из шести синапсов имеют большую площадь

сах в зависимости от пресинаптической актив-

PSD. Вероятно, при нормальных физиологиче-

ности.

ских условиях только TAP этих наиболее крупных

синапсов могли бы проявлять деполяризацию,

тогда как активация TAP менее активных синап-

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

сов могла бы происходить в результате развития

судорожных состояний. В этом отношении инте-

В данной работе мы предприняли первую по-

пытку более детально исследовать sER в отрост-

ресно было бы исследовать ультраструктуру и пе-

ках астроцитов, ультраструктурные детали кото-

рераспределение sER в TAP в состоянии эпилеп-

рого лежат не только за пределами оптического

сии, поскольку при развитии эпилептического

разрешения SEM-методов, широко используе-

статуса наблюдается как снижение величины

мых в анализе синапсов, но и за пределом разре-

Ca²⁺-событий, так и сопряжения астроцитов по-

шений просвечивающей электронной микроско-

средством щелевых контактов [85].

пии, обычно используемых при анализе нервной

В отличие от дендритных шипиков, которые

ткани посредством 3D-реконструкций. В послед-

сохраняют форму часы, дни и месяцы [86, 87],

ние несколько лет были опубликованы работы по

PAP - это очень пластичные структуры, меняю-

определению количества и распределению гра-

щие свою форму как in vitro, со скоростью до

нул гликогена в окружении синапсов на основе

500 нм в минуту, так и in vivo [54, 55, 74]. Локаль-

SEM (FIB-SEM - [47, 91]; SBF-SEM - [92]). На-

ный фотолиз связанного глутамата вблизи синап-

ши результаты показывают, что по крайней мере

БИОФИЗИКА том 68

№ 2

2023

ДВА СУБКОМПАРТМЕНТА ГЛАДКОГО ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА

331

часть органелл в PAP, воспринимаемых на SEM-

напсов, тогда как другие требуют интеграции

изображениях как гранулы гликогена, в действи-

комплементарных экспериментальных подходов.

тельности имеют мембранную природу и пред-

В целом факты, представленные в данной ра-

ставляют собой микровезикулы или сечения ко-

боте, могут служить основой для смены парадиг-

ротких фрагментов sER. С учетом того, что число

мы «отсутствия органелл в терминальных отрост-

микровезикул и цистерн sER может быть значи-

ках астроцитов» на парадигму, которая предпола-

тельно меньше числа гранул гликогена, наблюда-

гает динамическую регуляцию состава и числа

емых в условиях анестезии, полученные нами

органелл в перисинаптических ламеллах в зави-

данные не подвергают сомнению значимость ис-

симости от активности синапса, и открывает но-

следований гликогена в PAP методами SEM, но

вые перспективы в исследованиях нейрон-гли-

предостерегают от возможности получения при

ального взаимодействия и понимании функцио-

подсчете числа гранул преувеличенных значений.

нальной роли астроцитарного микроокружения в

пластичности трехчастного синапса и развитии

патологических процессов в мозге.

Мы не уделяли достаточного внимания эндо-

плазматическому ретикулуму в веточках астроци-

тов и ассоциированному с митохондриями, как

БЛАГОДАРНОСТИ

впрочем и другим органеллам, имеющим мем-

Работа выполнена на оборудовании ЦКП

бранную природу, таким как эндосомы, мульти-

ПНЦБИ РАН

(№670266, http://www.ckp-

везикулярные тела, и органеллам, связанным с

rf.ru/ckp/670266/).

лизосомальной деградацией, фокусируясь лишь

на упущенном по настоящее время звене в разви-

тии Ca²⁺-событий и в индукции Ca²⁺-зависимого

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

высвобождения глиотрансмиттеров - на потен-

Исследование проведено в рамках выполне-

циальном депо ионов Ca²⁺ в астроцитах в непо-

ния государственного задания ПНЦБИ РАН

средственной близости от пре- и постсинаптиче-

(№075-00957-23-01) при финансовой поддержке

ских компартментов. Результаты показывают,

Российского фонда фундаментальных исследова-

что хотя TAP и лишены вышеперечисленных ор-

ний (грант № 20-34-90068).

ганелл, в них присутствуют мембранные органел-

лы нанометровых размеров, которые разрешимы

только на увеличениях, позволяющих четко

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

идентифицировать элементарные мембраны. На-

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

нометровые размеры и концентрация этих орга-

интересов.

нелл вблизи интерфейсов «аксон-шипик» пред-

полагают их активный транспорт в тончайшие

отростки астроцитов и динамическое перерас-

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ НОРМ

пределение между синапсами с разной функцио-

Эксперименты на анестезированных и неане-

нальной активностью.

стезированных животных проведены в соответ-

ствии с требованиями Европейской конвенции

Наличие таких органелл поднимает как мини-

по защите животных 2010/63/EU. Все примени-

мум несколько технических и фундаментальных

мые международные, национальные и институ-

вопросов. Можно ли облегчить визуализацию на-

циональные принципы ухода и использования

норазмерных органелл в PAP в условиях анесте-

животных при выполнении работы были соблю-

зии, без элиминации гранул гликогена? Как эти

дены.

органеллы распределены в окружении синапсов

различных типов, форм и размеров? Могут ли ци-

стерны sER расщепляться до микровезикул и ге-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

терогенен ли пул последних? Какова буферная

1. A. Reichenbach, A. Derouiche, and F. Kirchhoff,

емкость для ионов Ca²⁺ у тонких коротких фраг-

Brain Res. Rev., 63, 11 (2010).

ментов sER и достаточна ли она для запуска Ca²⁺-

2. B. S. Khakh and M. V. Sofroniew, Nature Neurosci-

событий? В какой степени физическая изоляция

ence, 18, 942 (2015).

интерфейса «аксон-шипик» функционально бо-

3. M. Arizono, V. V. G. K. Inavalli, A. Panatier, et al., Na-

лее значима, чем присутствие в TAP цистерн sER

ture Commun., 11, 1906 (2020).

и микровезикул с глиотрансмиттерами? Некото-

4. M. Armbruster, S. Naskar, J. P. Garcia, et al., Nature

рые из этих вопросов можно решить как усовер-

Neurosci., 25, 607 (2022).

шенствованием протоколов фиксации ткани и

5. J. Špaček and A. R. Lieberman, J. Cell Sci., 46, 129

контрастирования ультратонких срезов, так и де-

(1980).

тальным количественным анализом sER и мик-

6. J. Špaček and K. M. Harris, J. Neurosci., 17, 190

ровезикул в TAP на основе 3D-реконструкций си-

(1997).

БИОФИЗИКА том 68

№ 2

2023

332

ШИШКОВА, РОГАЧЕВСКИЙ

7. Y. Wu, C. Whiteus, C. S. Xue, et al., Proc. Natl. Acad.

42. C. W. Scouten, R. O'Connor, and M. Cunningham, J.

Sci. USA, 114, E4859 (2017).

Microsc. Today, 14, 3, 26 (2006).

8. J. Špaček, Anat. Embryol., 171, 235 (1985).

43. R. Kasukurthi, M. J. Brenner, Amy M. Moore, et al., J.

9. J. Špaček and K. M. Harris, J. Comp. Neurol., 393, 58

Neurosci. Methods, 184, 303 (2009).

(1998).

44. S. R. Nelson, D. W. Schulz, J V. Passonneau, et al., J.

10. R. Ventura and K. M. Harris, J. Neurosci., 19, 6897

Neurochem., 15, 1271 (1968).

(1999).

45. F. D. Morgenthaler, D. M. Koski, R. Kraftsik, et al.,

11. M. A. Xu-Friedman, K. M. Harris, and W. G. Regehr,

Neurochem. Int., 48, 616 (2006).

J. Neurosci., 21, 6666 (2001).

46. L. F. Obel, M. S. Müller , A. B. Walls, et al., Front.

12. C. Genoud, C. Quairiaux, and P. Steiner, PLoS Biol.,

Neuroenergetics, 4, 3, 1 (2012).

4, e343 (2006).

47. J. S. Coggan, D. Keller, C. Calõ, et al., PLoS Comput.

13. M. R. Witcher, S. A. Kirov, and K. M. Harris, Glia, 55,

Biol., 14, 8, e1006392 (2018).

13 (2007).

48. O. H. Lowry, J. V. Passonneau, F. X. Hasselberger,

14. K. Chounlamountry and J.-P. Kessler, Glia, 59, 655

et al., J. Biol. Chem., 239, 18 (1964).

(2011).

49. H. Watanabe and J. V. Passonneau, Brain Res., 66, 147

15. M. Bellesi, L. de Vivo, G. Tononi, et al., BMC Biol.,

(1974).

13, 66 (2015).

50. R. A. Swanson, S. M. Sagar, and F. R. Sharp, Neurol.

16. P. Bezzi, V. Gundersen, J. L. Galbete, et al., Nature

Res., 11, 24 (1989).

Neurosci., 7, 613 (2004).

51. R. A. Swanson, M. M. Morton, S. M. Sagar, et al.,

17. L. H. Bergersen, C. Morland, L. Ormel, et al., Cereb

Neuroscience, 51, 2, 451 (1992).

Cortex, 22, 1690 (2012).

52. T. Matsui, T. Ishikawa, H. Ito, et al., J. Physiol., 590,

18. I. Patrushev, N. Gavrilov, V. Turlapov, et al., Cell Cal-

607 (2012).

cium, 54, 343 (2013).

53. M. K. Brewer and M. S. Gentry, in Advances in Neuro-

19. M. J. Karnovsky, In Abstr. Book of the 11^th Annual Meet.

biology, 23: Brain Glycogen Metabolism (Springer Na-

of the American Society for Cell Biology, Abstracts 284,

ture Switzerland AG, 2019), pp. 17-81.

146 (1971).

54. J. Hirrlinger, S. Hulsmann, and F. Kirchhoff, Eur. J.

20. A. M. Seligman, H. L. Wasserkrug, and J. S. Hanker, J.

Neurosci., 20, 2235 (2004).

Cell Biol., 30, 424 (1966).

55. Y. Bernardinelli, J. Randall, E. Janett et al., Curr. Biol.,

21. B. Fernandez, I. Suarez, and G. Gonzalez, Anat. Anz.,

24, 1679 (2014).

156, 31 (1984).

56. G. R. Login and A. M. Dvorak, Histochem. J., 20, 373

22. A. Semyanov and A. Verkhratsky, Trends Neurosci.,

(1988).

44, 781 (2021).

57. G. R. Login and A. M. Dvorak, The Microwave Tool

23. Y. Oe, O. Baba, H. Ashida, et al., Glia, 64, 1532 (2016).

Book (Beth Israel Hospital, 1994).

24. N. Benmeradi, B. Payre, and S. L. Goodman, Microsc.

58. F.E. Jensen and K.M. Harris, J. Neurosci. Methods,

Microanal. 21 (Suppl. 3), 721 (2015).

29, 217 (1989).

25. T. Hanaichi, T. Sato, T. Iwamoto, et al., J. Electron

59. M. A. Sullivan, S. T. N. Aroney, S. Li, et al., Biomac-

Microsc. (Tokyo), 35, 304 (1986).

romolecules, 15, 660 (2014).

26. S. Saalfeld, R. Fetter, A. Cardona, et al., Nature Meth-

60. T. Satoh, C. A. Ross, A. Villa, et al., J. Cell Biol., 111,

ods, 9, 717 (2012).

615 (1990).

27. J. C. Fiala, K. M. Harris, J. Microsc., 202, Pt 3, 468

61. N. Holbro, Å. Grunditz, and T. G. Oertner, Proc. Natl.

(2001).

Acad. Sci. USA, 106, 15055 (2009).

28. J. C. Fiala, J. Microsc., 218 (Pt 1), 52 (2005).

62. P. Jedlicka, A. Vlachos, S. W. Schwarzacher, et al., Be-

29. W. C. De Bruijn, J. Ultrastruct. Res., 42, 29 (1973).

hav. Brain Res., 192, 12 (2008).

30. L. A. Langford and R. E. Coggeshall, Anat. Rec., 197,

63. K. Takei, H. Stukenbrok, A. Metcalf, et al., J. Neuros-

297 (1980).

ci., 12, 489 (1992).

31. E. A. Shishkova, I. V. Kraev, and V. V. Rogachevsky,

64. A. H. Sharp, P. S. McPherson, T. M. Dawson, et al., J.

Biophysics, 67, 5, 752 (2022).

Neurosci., 13, 3051 (1993).

32. P. Drochmans, J. Ultrastruct. Res., 6, 141 (1962).

65. H. Shimizu, M. Fukaya, and M. Yamasaki, Proc. Natl.

33. J. P. Revel, J. Histochem. Cytochem., 12, 104 (1964).

Acad. Sci. USA, 105, 11998 (2008).

34. L.-E. Thornell, J. Ultrastruct. Res., 49, 157 (1974).

66. R. Barzan, F. Pfeiffer, and M. Kukley, Front. Neuros-

35. C. Prats, T. E. Graham, and J. Shearer, J. Biol. Chem.,

ci., 10, 135 (2016).

293, 19, 7089 (2018).

67. J.-P. Mothet, L. Pollegioni, G. Ouanounou, et al.,

36. K. K. Rybicka, Tissue Cell, 28, 3, 253 (1996).

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 5606 (2005).

37. M. L. Entman, S. S. Keslensky, A. Chu, et al., J. Biol.

68. Y. Du, S. Ferro-Novick, and P. Novick, J. Cell Sci.,

Chem., 255, 13, 6245 (1980).

117, 2871 (2004).

38. Y. Hirata, M. Atsumi, Y. Ohizumi, et al., Biochem. J.,

69. J. Espadas, D. Pendin, R. Bocanegra, et al., Nature

371, 81 (2003).

Commun., 10, 5327 (2019).

39. C. Lavoie, L. Roy, J. Lanoix, et al., Prog Histochem

70. S. Wang, H. Tukachinsky, F. B. Romano, et al., eLife,

Cytochem., 46, 1 (2011).

5, e18605 (2016).

40. M. S. Muller, R. Fox, A. Schousboe, et al., Glia, 62,

71. J. D. Lindsey and M. H. Ellisman, J. Neurosci., 5, 12,

526 (2014).

3135 (1985).

41. S. P. J. Brooks, B. J. Lampi, and C. G. Bihun, Con-

72. N. Rismanchi, C. Soderblom, J. Stadler, et al., Hum.

temp. Top. Lab. Anim. Sci., 38, 19 (1999).

Mol. Genet., 17, 11, 1591 (2008).

БИОФИЗИКА том 68

№ 2

2023

ДВА СУБКОМПАРТМЕНТА ГЛАДКОГО ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА

333

73. X. Hu and F. Wu, Prot. Cell, 6, 4, 307 (2015).

83. M. G. Stewart, N. I. Medvedev, V. I. Popov, et al., Eur.

J. Neurosci., 21, 3368 (2005).

74. M. Krzisch, S. G. Temprana, L. A. Mongiat, et al.,

Brain Struct. Funct., 220, 4, 2027 (2015).

84. V. I. Popov, N. I. Medvedev, I. V. Patrushev, et al.,

Neuroscience, 149, 549 (2007).

75. G. Mattews, Neuron, 44, 223 (2004).

85. A. Plata, A. Lebedeva, P. Denisov, et al., Front. Mol.

76. R. G. Parton and K. Simons, Nat. Rev. Mol. Cell Biol.,

Neurosci., 11, 215 (2018).

8, 185 (2007).

86. A. Matus, Curr. Opin. Neurobiol., 15, 76 (2005).

77. N. J. Willmott, K. Wong, and A. J. Strong, J. Neurosci.,

87. A. J. G. D. Holtmaat, J. T. Trachtenberg, L. Wilbrecht,

20, 5, 1767 (2000).

et al., Neuron, 45, 279 (2005).

78. X. Hua, E. B. Malarkey, V. Sunjara, et al., J. Neurosci.

88. A. H. Cornell-Bell, P. G. Thomas, and S. J. Smith,

Res., 76, 86 (2004).

Glia, 3, 322 (1990).

79. M. W. Sherwood, M. Arizono, C. Hisatsune, et al.,

89. M. E. Brown and P. C. Bridgman, J. Neurobiol., 58, 1,

Glia, 65, 3, 502 (2017).

118 (2004).

80. E. Shigetomi, S. Patel, and B. S. Khakh, Trends Cell

90. S. J. Stachelek, R. A. Tuft, L. M. Lifschitz, J. Biol.

Biol., 26, 4, 300 (2016).

Chem., 276, 35652 (2001).

81. J. Meldolesi and T. Pozzan, J. Cell Biol., 21, 142, 1395

91. C. Calì, J. Baghabra, D.J. Boges, et al., J. Comp. Neu-

(1998).

rol., 524, 23 (2016).

82. Y. Takumi, V. Ramírez-León, P. Laake, et al., Nature

92. M. Bellesi, L. de Vivo, S. Koebe, et al., Front. Cell

Neurosci., 2, 7, 618 (1999).

Neurosci., 12, 308 (2018).

Two Subcompartments of the Smooth Endoplasmic Reticulum in Perisynaptic

Astrocytic Processes: Ultrastructure and Distribution in Hippocampal

and Neocortical Synapses

E.A. Shishkova* and V.V. Rogachevsky*

*Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, Institutskaya ul. 3, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia

Perisynaptic astrocytic processes involved in the tripartite synapse functioning respond to its activation by lo-

cal depolarization with calcium release from the intracellular stores inside nodes of astrocytic processes and

develop local and generalized calcium events. However, based on the first electron microscopy studies a point

of view was formed that terminal astrocytic lamellae are devoid of any organelles, including the main astro-

cytic calcium store - the cisternae of the smooth endoplasmic reticulum. Indeed, analysis of smooth endo-

plasmic reticulum cisternae could be limited by their weak electron contrast, the studying of astrocytic pro-

cesses on single sections, and insufficient optical resolution of the equipment used. Here, by using serial sec-

tion transmission electron microscopy and 3D reconstructions, we analyzed astrocytic processes in murine

hippocampal and cortical synapses. As a result of unit membranes contrast enhancement, it was shown for

the first time that perisynaptic processes of astrocytes with a morphology of thin branchlets contain two types

of smooth endoplasmic reticulum cisternae and microvesicles. Unlike branchlets, membrane organelles in-

side terminal lamellae were comprised by only short fragments of thin smooth endoplasmic reticulum cister-

nae and microvesicles, whose groups tend to be located in close proximity to active zones of the most active

synapses. We speculate both on reliability of the alternative methods in electron microscopy while studying

astrocytic microenvironment of synapses and structure-function aspects of smooth endoplasmic reticulum

cisternae compartmentalization inside the perisynaptic processes of astrocytes.

Keywords: perisynaptic and terminal astrocytic processes, smooth endoplasmic reticulum, glycogen, transmission

electron microscopy, scanning electron microscopy, 3D reconstruction

БИОФИЗИКА том 68

№ 2

2023