БИОФИЗИКА, 2023, том 68, № 4, с. 629-639

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.3

ВЛИЯНИЕ ДИНАМИКИ МИКРООКРУЖЕНИЯ ТРИПТОФАНА

НА ПАРАМЕТРЫ ЕГО ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ В ЗАВИСИМОСТИ

ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ

С.Н. Горячев*, В.З. Пащенко*^{, #}, А.Б. Рубин*

*Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова,

Ленинские горы, 2/12, Москва, 119234, Россия

^#E-mail: vz.paschenko@gmail.com

Поступила в редакцию 21.12.2022 г.

После доработки 16.01.2023 г.

Принята к публикации 17.01.2023 г.

Исследованы температурные зависимости быстрых и медленных компонент затухания флуорес-

ценции водного раствора молекул триптофана в диапазоне -170°C÷20°C, замороженных на свету и

в темноте. Для количественного анализа использована модель прямых и обратных электронных пе-

реходов в молекуле триптофана из возбужденного состояния в основное состояние и в состояние с

переносом заряда. Выделены три основные спектральные области флуоресценции триптофана, от-

личающиеся различным поведением температурных зависимостей скоростей перехода из возбуж-

денного состояния триптофана в состояние с переносом заряда. Показана ключевая роль динамики

системы водородных связей, определяющих нелинейный характер изменения параметров флуорес-

ценции триптофана в выделенных спектральных областях. Нелинейное поведение длительности

флуоресценции и спектров флуоресценции при изменении температуры определяется характером

взаимодействия триптофана с водой и льдом. Показана важная роль, которую играют температур-

ные перестройки в системе водородных связей структурных конфигураций Н₂О, окружающей мо-

лекулу триптофана в возбужденном состоянии.

Ключевые слова: триптофан, кинетика затухания флуоресценции, температурная зависимость, водо-

родные связи, молекулярная динамика.

DOI: 10.31857/S0006302923040014, EDN: KIKARV

жет индуцировать зависимые от температуры

Флуоресценция триптофанилов в составе бел-

сдвиги их спектров поглощения и флуоресцен-

ков широко используется в качестве природного

индикатора их внутримолекулярной конформа-

ции [5, 8]. В частности, в результате сложного пе-

рераспределения электронной плотности в воз-

ционной динамики, тесно связанной с функцио-

бужденных молекулах Trp происходит красный

нальной активностью, в частности, при измене-

сдвиг максимума спектра флуоресценции. Тем-

нии температуры. Источником информации о

пература влияет на процессы сольватации, меняя

характере внутримолекулярной динамики бли-

состояние водородных связей - их жесткость и

жайшего окружения возбужденной молекулы

упорядоченность. Спектры и время жизни воз-

триптофана (Trp) являются температурные зави-

бужденных электронных состояний Trp при раз-

симости спектров и длительности флуоресцен-

ных температурах обусловлены процессом внут-

ции Trp [1-3]. Кинетика затухания флуоресцен-

римолекулярного переноса электрона от пироль-

ции Trp как в растворе, так и в составе полипеп-

ного кольца возбужденной молекулы на

тидов многокомпонентна. В зависимости от типа

индольную часть и на амидные группы основного

растворителя, фактора pH, регистрируют две-три

скелета молекулы. В этот процесс вовлекается

кинетики затухания компонент флуоресценции в

также система водородных связей (Н-связей)

интервале от сотен пикосекунд до ~10 нс [4-7].

между молекулами Trp и их водным окружением

Сольватация возбужденных молекул Trp в ходе

[8-11] с образованием состояния с переносом за-

взаимодействия с ближайшим окружением мо- ряда (CTS).

Сокращения: Trp - триптофан, Н-связи - водородные свя-

Согласно данным метода квазиупругого рассе-

зи, CTS - состояние с переносом заряда.

яния нейтронов [12, 13], можно выделить следую-

629

630

ГОРОХОВ и др.

щие температурные области, в которых динамика

еще остается меньше энергии взаимодействия

протонов водородных связей в водно-белковой

диполей Н-связей молекул, что позволяет сохра-

среде влияет на время жизни возбужденных

нять упорядоченность (T < T₂) [16]. В результате

электронных состояний Trp. При T < -150°C (об-

происходит перестройка системы водородных

ласть 1) происходят чисто гармонические колеба-

связей за счет диффузионного перескока прото-

ния протонов около равновесных положений. В

нов по Н-связям [13], что приводит к образова-

области II (-150°C ≤ T < -30°C) динамика водно-

нию суммарного дипольного момента, электри-

белковой среды характеризуется скачкообразной

ческое поле которого вызывает эффект дополни-

диффузией протонов по Н-связям в пикосекунд-

тельной сольватации возбужденной молекулы

ном временном диапазоне. При T > -30°C (об-

Trp. При этом изменение состояния системы во-

ласть III) динамика водно-белковой среды харак-

дородных связей в окрестности Trp* играет роль

теризуется более медленными масштабными дви-

мягкой моды, т.е. критической подсистемы, ис-

жениями крупных молекулярных фрагментов

пытывающей фазовый переход в результате взаи-

[12,13].

модействия дипольных моментов водородных

связей в области температур T₁ < T < T₂ [16]. Ку-

Исследованию динамики водородных связей в

лоновское взаимодействие Trp* с суммарным ди-

окружении возбужденных молекул Trp и их влия-

польным моментом системы водородных связей

нию на фотофизические и фотохимические пере-

будет вызывать значительный красный сдвиг

ходы в таких системах в последние годы уделяется

спектра флуоресценции триптофана в водно-бел-

большое внимание [8-11, 14, 15]. В частности, в

ковой среде.

работе [15] было показано, что в водном растворе

образуется стабильный цвиттерионный комплекс

В данной работе выполнено детальное изуче-

Н-связей с молекулой Trp. Вокруг этого комплек-

ние температурных зависимостей длительности

са формируется водная оболочка с частично упо-

флуоресценции замороженных в темноте и на

рядоченными Н-связями за счет их взаимодей-

свету водных растворов триптофана в различных

ствия с полярными группами Trp [14, 15]. В бли-

областях его спектра флуоресценции. Изучена

жайшем окружении возбужденной молекулы Trp

также динамика спектров флуоресценции в нано-

может происходить укорочение длин и, как след-

секундном временном интервале и обнаружено

ствие, усиление Н-связей молекул воды, взаимо-

увеличение скорости сольватационного сдвига

действующих с электрическим полем индольной

спектров флуоресценции в области фазового пе-

части молекул Trp. В результате увеличивается

рехода в системе водородных связей в диапазоне

жесткость и происходит их дополнительное упо-

температур от -80°C до 20°C. Анализ экспери-

рядочение [15]. В свою очередь, в упорядоченной

ментальных данных базировался на идее форми-

системе Н-связей может формироваться квазизо-

рования промежуточного состояния с переносом

на проводимости, на которую электрон перехо-

заряда в процессе дезактивации Trp* и опосредо-

дит от индольной части возбужденной молекулы

ванном влиянии динамики водородных связей

Trp и делокализуется. Затем делокализованный

ближайшего водного окружения на процессы

электрон может перейти на амидные группы и об-

дезактивации возбужденного состояния молекул

разовать состояние с переносом заряда [15]. Та-

триптофана. Настоящая статья является продол-

кой процесс наиболее вероятен в области доста-

жением и развитием опубликованных ранее ра-

точно низких температур (область I). При этом

бот [8-11].

при дальнейшем понижении температуры ско-

рость переноса электрона от индольной части

Trp* в систему водородных связей должна увели-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

чиваться. В области более высоких температур

В работе использовали триптофан фирмы Sig-

(области II и III) за счет тепловых флуктуаций мо-

ma (США). Измерения кинетики флуоресценции

лекул растворителя квазизона проводимости вы-

проводили на установке с коррелированным по

рождается. В результате перенос электрона с ин-

времени и длине волны счетом единичных фото-

дольной части на амидные группы будет идти уже

нов PML-16 (Becker & Hickl GmbH, Германия;

по термоактивационному механизму. В окрест-

http://www. becker-hickl.de/pdf/pml16c21.pdf2006).

ности возбужденной молекулы триптофана в си-

Данная установка оборудована

16-канальной

стеме водородных связей возможен также кон-

мультианодной трубкой Hamamatsu R5900, со-

формационный (фазовый) переход, приводящий

держащей 16 раздельных входных анодных эле-

к возникновению в этой системе электрического

ментов и общую катодную и динодную систему.

дипольного момента [16]. Этот процесс может

Получаемый сигнал флуоресценции направляет-

происходить в определенном интервале темпера-

ся в полихроматор с дифракционной решеткой

тур T₁ < T < T₂, когда энергия теплового движе-

600 штрихов/мм, обеспечивающей ширину спек-

ния протонов достаточно велика для их переско-

тральной полосы измерительной системы 200 нм

ков вдоль водородной связи (T > T₁), однако все

с разрешением 12.5 нм/канал. Это позволяет ре-

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

ВЛИЯНИЕ ДИНАМИКИ МИКРООКРУЖЕНИЯ ТРИПТОФАНА

631

гистрировать трехмерную картину флуоресцен-

фотонов, зарегистрированных в данной области

ции, отражающую изменения длительности (τ),

спектра.

длины волны (λ) и интенсивности (I) свечения.

Аппроксимацию экспериментальных кинетик

Флуоресценцию образца возбуждали при 280 нм с

флуоресценции проводили для каждого спек-

помощью пикосекундного полупроводникового

трального канала при помощи программы

диода EPLED 280 (Edinburg Photonics, Шотлан-

SPCImage (Becker & Hickl GmbH, Германия) по

дия), длительность импульса света составляла

формуле (1), позволяющей разлагать кинетики по

870 пс, спектральная ширина - 10 нм, частота

методу Марквардта-Левенберга на сумму от од-

следования импульсов 10 МГц. Для получения

ной до пяти экспонент, свернутых с аппаратной

хорошего отношения сигнал/шум время накоп-

функцией системы регистрации, измеряемой для

ления сигнала было выбрано равным 30 с. Таким

каждого спектрального канала.

образом, регистрируя трехмерное (τ, λ, I) изобра-

F(t, λ) = Σ_ia_i(λ)exp(-t/τ_i ), i = 1,2.

(1)

жение свечения триптофанилов, мы могли изме-

рять кинетики затухания флуоресценции в любом

Здесь a_i(λ) представляет собой зависящий от

спектральном канале. Одновременно мы имели

длины волны сигнала флуоресценции предэкспо-

возможность регистрировать динамику спектров

ненциальный множитель компоненты с време-

флуоресценции образца с различными времен-

нем жизни τ_i. При разложении эксперименталь-

ными задержками после возбуждения. В экспери-

ных кинетик мы ограничились двумя экспонен-

менте образец, содержащий триптофан при кон-

тами, так как дальнейшее увеличение числа

центрации 10 мМ, находился в охлаждаемой жид-

компонент не приводило к снижению χr2. Для

ким азотом кювете. Время охлаждения до -170°C

всех выбранных спектральных областей значение

составляло около 10 мин, скорость последующего

χr2 = не превышало величины 1.5.

нагревания была равной 5-7 град/мин.

Получаемый в результате измерений массив

спектрально-кинетических данных представляет

РЕЗУЛЬТАТЫ

собой набор кинетик затухания флуоресценции,

Процессы возбуждения и дезактивации воз-

зарегистрированных при разных λ в спектраль-

бужденного состояния молекулы Trp представим

ной области 286-425 нм с интервалом 12.5 нм.

в виде схемы 1. В соответствии с этой схемой ки-

Число экспериментальных точек при регистра-

нетика затухания флуоресценции Trp имеет двух-

ции каждой кинетики составляло 4096. Для каж-

компонентный характер: дезактивация возбуж-

дого спектрального канала измеряли также число

денного состояния триптофана происходит по

Схема 1. Модельная схема кинетических переходов в триптофане: n₁, n₂ - населенности возбужденного

состояния молекул Trp и состояния с переносом заряда; Trp⁺R^- - состояние с переносом заряда, где R может

обозначать как систему водородных связей в окружении молекулы Trp, так и амидные группы с электрон-

акцепторными свойствами, связанные с Trp; k_R1 - константа скорости зату хания возбужденного состояния Trp,

k_R1

включающая флуоресценцию (k_f1) и безызлучательную релаксацию (k_r1): Trp*

→ S₀, (k_R1 = k_f1 + k_r1); k₁₂ -

скорость перехода Trp* в состояние CTS; k₂₁ - скорость рекомбинации CTS → Trp*; k_R2 - скорость затухания

k_R2

CTS за счет флуоресценции и безызлучательной релаксации: CTS*

→ S₀, k_R2 = k_f2+ k_r2.

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

632

ГОРОХОВ и др.

двум каналам - с испусканием флуоресценции

спектра. Для адекватной аппроксимации экспе-

(k_f1) и безызлучательной релаксацией (k_r1) в ос-

риментальной температурной зависимости k₁₂ во

всей исследованной области температур предпо-

новное состояние

→S

(k_R1 = k_f1 + k_r1), а

лагалась зависимость энергии активации перехо-

также с переходом молекулы Trp в промежуточ-

да E_a от температуры в области -80°C < T < 20°C

ное состояние (состояние с переносом заряда)

в следующем виде [20]

Trp^* → Trp⁺R^- со скоростью k₁₂, рекомбинирую-

(-G

)

щего затем со скоростью k₂₁ обратно в S^*-состоя-

(2)

ние:

→CTS→S

→S

Согласно работе [17],

Здесь E_r - энергия реорганизации среды пре-

помимо обратного перехода в S*-состояние рас-

образования CTS, ΔG - разность уровней свобод-

пад CTS также может происходить с испусканием

ной энергии состояний Trp* и CTS (схема 1). При

флуоресценции и за счет безызлучательной

этом считалось, что процессы переноса электро-

на происходят в неинвертированной области па-

релаксации в основное состояние (

)

^R S0

CTS

раметров соотношения (2), для которой выпол-

(k_R2 = k_f2 + k_r2). В этом отношении интересно от-

няется условие ΔG ≤ E_r. В этом случае при умень-

метить, что релаксация ион-радикальной пары

шении энергии реорганизации E_r энергия

реакционного центра фотосистемы II в основное

активации перехода E_a также уменьшается и до-

состояние также сопровождается испусканием

стигает нуля при ΔG = E_r (безактивационный пе-

флуоресценции в длинноволновой области спек-

тра [18, 19].

реход). Водородные связи ближайшего окруже-

ния Trp* дают определенный вклад в энергию ре-

Мы детально исследовали кинетики затухания

организации среды и, согласно уравнению (2),

флуоресценции Trp в водном растворе в диапазо-

также влияют на величину энергии активации пе-

не температур от -170°С до 20°С для различных

рехода Trp* → CTS.

спектральных областей свечения при заморажи-

вании образцов в темноте (D) и на свету (L). Об-

работку экспериментальных кинетик проводили

ОБСУЖДЕНИЕ

так, как это описано в работе [11].

В работе [15] показано, что в окружении моле-

На рис. 1-3 показаны рассчитанные темпера-

кулы триптофана в водном растворе и льдах обра-

турные зависимости констант скоростей прямого

зуется упорядоченная система водородных свя-

перехода k₁₂ (Trp* → CTS) и обратного перехода

зей, имеющая вид цвиттерионного комплекса,

k₂₁ (CTS → Trp*). При аппроксимации кинетик

которая оказывает существенное влияние на ди-

затухания флуоресценции варьировали значения

намику возбуждений в системе. Показано также,

скоростей перехода k₁₂ и k₂₁. Остальные парамет-

что при электронном возбуждении молекулы

ры схемы 1 фиксировали. Из рис. 1-3 видно, что

триптофана происходит увеличение жесткости

температурная зависимость константы скорости

водородных связей, что приводит к делокализа-

перехода k₁₂ в области T < -125°С носит безакти-

ции электрона между индольной частью Trp и во-

вационный характер: с увеличением температуры

дородными связями цвиттерионного комплекса

k₁₂ уменьшается пропорционально величине

и вызывает значительный сдвиг спектра флуорес-

ценции триптофана в красную область. Однако в

1/ T

где T_K - абсолютная температура. Как

работе [15] рассмотрены только стационарные

видно из рис. 1-3, для Trp в водной среде образо-

спектры поглощения и флуоресценции трипто-

вание квазизоны проводимости системы Н-свя-

фана в водном растворе без учета их зависимости

зей может происходить уже при температурах

от температуры. Поэтому представляло интерес

(T < -125°C), что следует из безактивационного

исследовать динамику спектральных и кинетиче-

характера переноса электрона на амидные груп-

ских параметров, описывающих процессы зату-

пы по системе Н-связей. Видно также, что при

хания флуоресценции триптофана в водной среде

T > -90°C с ростом температуры происходит тер-

при импульсном фотовозбуждении в зависимо-

моактивационное увеличение константы скоро-

сти от температуры.

сти k₁₂ при постоянной энергии активации пере-

Анализ полученных в работе эксперименталь-

хода.

ных и теоретических кривых позволил выделить

Обработка экспериментальных результатов

три области в спектре флуоресценции Trp: корот-

выявляет различный характер температурной за-

коволновую область (B) (300 нм < λ < 386 нм),

висимости скоростей перехода k₁₂ и k₂₁ в той об-

промежуточную область (M) (386 нм < λ < 400 нм)

ласти, где предполагается нелинейный характер

и длинноволновую область (R) (400 нм < λ <

сольватации возбужденного состояния трипто-

< 470 нм), для которых температурная зависи-

фана (-80°С < T < 20°С) для различных участков

мость скорости образования CTS имеет различ-

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

ВЛИЯНИЕ ДИНАМИКИ МИКРООКРУЖЕНИЯ ТРИПТОФАНА

633

ный характер. Оказалось, что в области спектра

флуоресценции (B) при изменении температуры

от -80°C до 20°С наблюдается отступление тем-

пературной зависимости скорости перехода k₁₂

(рис. 1) от стандартного аррениусовского поведе-

ния с постоянной энергией активации. В

температурной области -80°С < T < -20°С ско-

рость перехода k₁₂ увеличивается до максимума

при T = -20°С. При дальнейшем росте температу-

ры до 20°С происходит уменьшение k₁₂ (рис. 1).

Нелинейную колоколообразную зависимость

скорости перехода возбужденного состояния Trp

в состояние CTS по сравнению со стандартной

реакцией с постоянной энергией активации E_a

можно связать с возможным структурным фа-

зовым переходом системы водородных связей в

окружении Trp* в области температур -80°C < T <

< 20°C. Действительно, система водородных свя-

зей в окружении возбужденной молекулы трип-

Рис. 1. Tемпературные зависимости констант скоро-

тофана при фазовом переходе в температурной

сти k₁₂ образования состояния с переносом заряда

области (T₁ < T < T₂) перестраивается и описыва-

Trp* → Trp⁺R^-, k₂₁ - обратной реакции Trp⁺R- →Trp*

ется критической, мягкой модой [16], при кото-

и энергии активации реакции ΔE_a для замороженных в

рой протоны водородных связей переходят в но-

вое положение равновесия. Возникающее элек-

темноте (D, j) и на свету (L, •) образцов в коротко-

трическое поле индольной части возбужденной

волновой спектральной области (B). Зависимости ΔE_a

молекулы триптофана способствует процессу фа-

от температуры для D- и L-образцов показаны в отно-

сительном масштабе. Среднеквадратичная ошибка

зового перехода в системе окружающих водород-

значения k₁₂ не превышала величины 0.01 нс^-1, значе-

ных связей, при этом важную роль играет их вза-

имное (mutual) взаимодействие.

ния k₂₁ - 0.015 нс^-1 для образцов, замороженных в

темноте и на свету соответственно. Сплошные

Характер температурных эффектов в спектраль-

линии построены согласно модели рис. 2 (система

ной области 300 нм <  < 386 нм. Коротковолно-

уравнений (2)), с зависящей от температуры энергией

вый участок спектра флуоресценции 300 нм < λ <

активации ΔE_a в температурной области -80°C ÷ 20°C.

< 386 нм (область B) соответствует излучению той

части возбужденных молекул триптофана, в

окрестности которых система водородных связей

зации процесса переноса электрона уменьшается

в находится в начале перестройки и испытывает

и энергия активации этого перехода E_a (уравне-

флуктуации положений протонов вдоль водород-

ние 2), так как при этом величина ΔG остается

ных связей. Известно, что потенциальная энер-

еще практически постоянной. С ростом темпера-

гия движения протонов вдоль водородных связей

туры количество взаимодействующих критиче-

имеет вид двухъямного потенциала [16]. Под воз-

ских водородных связей, теряющих часть жестко-

действием электрического поля индольной части

сти в начале фазового перехода, растет за счет

возбужденной молекулы триптофана энергия

увеличения числа эффективно взаимодействую-

движения протонов становится выше барьеров

щих протонов, в результате продолжает умень-

потенциальных ям, в результате они могут опре-

шаться энергия реорганизации перехода. Это

деленное время двигаться вдоль водородных свя-

зей практически свободно. Также возможен пе-

приводит к уменьшению энергии активации пе-

реход протона вдоль водородной связи из одной

рехода E_a для синего участка спектра с ростом

потенциальной ямы в более близкую к индольной

температуры, которая достигает минимума при

части потенциальную яму возбужденной молеку-

температуре T_m = -20°C. При этом скорость пе-

лы триптофана по туннельному механизму. Дан-

рехода k₁₂ возбужденного состояния триптофана

ный механизм рассмотрен в работах [21, 22]. В

в CTS состояние (рис. 1) увеличивается и дости-

этом участке спектра аномальный характер тем-

гает максимума при этой же температуре T_m

пературной зависимости скорости k₁₂ перехода

(рис. 1). При дальнейшем росте температуры от

Trp* в состояние CTS можно объяснить уменьше-

нием энергии реорганизации данной реакции за

Tm до T2 = 20°C растет тепловая энергия движе-

счет уменьшения коэффициента упругости

ния протонов, уменьшается количество взаимно

(жесткости) части водородных связей при их пе-

(mutual) взаимодействующих водородных связей

рестройке. При уменьшении энергии реоргани-

мягкой моды, участвующих в фазовом переходе,

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

634

ГОРОХОВ и др.

что приводит в результате к увеличению энергии

данных работы [15], в спектральной области (B)

реорганизации и соответствующему увеличению

динамика процессов прямого (k₁₂) и обратного

энергии активации. В результате при достижении

(k₂₁) переходов определяется, главным образом,

максимальной температуры фазового перехода T₂

процессом перестройки водородных связей в

энергия активации возвращается к постоянной

окрестности возбужденной молекулы триптофа-

величине стандартного термоактивационного пе-

на, сопровождающейся уменьшением их жест-

рехода. При этом скорость перехода Trp* → CTS

кости.

уменьшается до величины, наблюдаемой при

Характер температурных эффектов в спектраль-

стандартном переходе с постоянной энергией ак-

ной области 386 нм < < 400 нм. Средний участок

тивации (рис. 1). Отсюда следует подтверждение

спектра флуоресценции триптофана (386 нм < λ <

ранее высказанного предположения, что в начале

< 400 нм) соответствует излучению той части воз-

перестройки водородных связей в результате их

бужденных молекул триптофана, в окружении

взаимодействия, а также под воздействием элек-

которых уже произошел фазовый переход неко-

трического поля индольной части возбужденной

торого числа водородных связей, сопряженный с

молекулы Trp образуется виртуальная (времен-

возникновением дипольного момента системы

ная) зона проводимости системы водородных

водородных связей и восстановлением их жест-

связей, которая приводит к увеличенной скоро-

кости. Такой фазовый переход приводит к увели-

сти перехода возбужденного состояния Trp в со-

чению энергии реорганизации перехода E_r и

стояние с переносом заряда в коротковолновой

уменьшению свободной энергии переходаΔG,

области спектра (B).

что вызывает соответствующий рост энергии ак-

Температурная зависимость скорости обрат-

тивации E_a (уравнение (2)). В то же время для

ного перехода k₂₁ в спектральной области (B) хо-

оставшейся части возбужденных молекул система

рошо описывается следующим выражением с по-

водородных связей все еще находится в состоя-

стоянным значением свободной энергии перехо-

нии перестройки и вносит вклад в уменьшение

да ΔG:

энергии реорганизации перехода E_r и энергии ак-

k₂₁(T) = k₁₂(T)exp(-ΔG/k_BT_K),

(3)

тивации E_a. В результате в данной спектральной

области (M) увеличение энергии активации за

где k_B - постоянная Больцмана, T_K - абсолютная

счет фазового перехода и соответствующего

температура по шкале Кельвина. Оценка величи-

уменьшения свободной энергии перехода ΔG

ны ΔG для D-образцов дает значение 375 см^-1.

компенсируется снижением величины E_a за счет

Для L-образцов температурная область в участке

уменьшения E_r для той части молекул, в окрест-

спектра (B), в которой происходит увеличение

ности которых перестройка системы водородных

скорости перехода k₁₂, несколько шире, чем для

связей еще не завершена. При этом в спектраль-

D-образцов. При этом энергия активации для

ной области M энергия активации слабо зависит

L-образцов уменьшается на большую величину,

от температуры (рис. 2). Из этого рисунка видно

чем для D-образцов, что сопровождается соответ-

также, что для L-образцов константа скорости

ствующим увеличением скорости k₁₂ (рис. 1).

прямого перехода k₁₂ больше, чем для D-образ-

Данный эффект может быть связан с тем, что для

цов. При температуре T < -100°C увеличение

L-образцов в процессе замораживания на свету в

скорости k₁₂ для L-образцов происходит в резуль-

системе H-связей происходит предварительное

тате того, что при охлаждении в условиях посто-

накопление водородных связей в состоянии уве-

янного освещения образцы замораживаются с

личенной жесткости в окрестности молекулы

большей жесткостью и упорядоченностью водо-

триптофана. В результате при перестройке водо-

родных связей, что приводит к образованию зоны

родных связей их жесткость уменьшается на

проводимости. Такое явление способствует без-

большую величину, чем в D-образцах. Это вызы-

активационному переносу электрона с индоль-

вает дополнительное снижение энергии реорга-

ной части Trp* на водородные связи и амидные

низации перехода Trp* → CTS и соответствующее

группы. В области температур фазового перехода

уменьшение энергии активации (уравнение (2)).

(-80°C < T < 20°C) при замораживании на свету в

Температурная зависимость скорости обратного

системе водородных связей сохраняются микро-

перехода k₂₁ для образцов, замороженных на све-

конформационные смещения, благоприятствую-

ту, также описывается выражением (3). Оценка

щие развитию взаимодействия водородных свя-

величины G для L-образцов дает значение

зей в окружении молекул Trp. В результате растет

330 см^-1. При этом для L-образцов скорость об-

количество перестраиваемых H-связей, что вы-

ратного перехода k₂₁ в температурной области

зывает большее снижение энергии реорганиза-

ции E_r и соответствующее уменьшение энергии

-80°C < T < -20°C несколько больше, чем для

Dh-образцов (рис. 1). Таким образом, из полу-

активации E_a для L-образцов по сравнению с

ченных результатов следует, что, в отличие от

D-образцами (рис. 2). В результате скорость пере-

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

ВЛИЯНИЕ ДИНАМИКИ МИКРООКРУЖЕНИЯ ТРИПТОФАНА

635

Рис. 2. Tемпературные зависимости констант скоро-

Рис. 3. Tемпературные зависимости констант скоро-

сти k₁₂ образования состояния с переносом заряда

Trp* → Trp⁺R^-, k₂₁ - обратной реакции Trp⁺R^- → Trp*

Trp* → Trp⁺R^- и энергии активации реакции ΔE_a для

и энергии активации реакции ΔE_a для замороженных

замороженных в темноте (D, j) и на свету (L, •) об-

в темноте (D, j) и на свету (L, •) образцов в спек-

разцов в спектральной R-области. Зависимости ΔE_a

тральной области (M). Зависимости ΔE_a от темпера-

от температуры для D- и L-образцов показаны в от-

носительном масштабе. Среднеквадратичная ошибка

туры для D- и L-образцов показаны в относительном

масштабе. Среднеквадратичная ошибка значения k₁₂

значения k₁₂ не превышала величины 0.015 нс^-1, зна-

не превышала величины 0.012 нс^-1, значения k₂₁ -

чения k₂₁ - 0.025 нс^-1для образцов, замороженных в

темноте и на свету соответственно. Максимальное

0.018 нс^-1 для образцов, замороженных в темноте и

увеличение E_a для D-образцов в области -40°C равно

на свету соответственно. Максимальное изменение

ΔE_a для D- и L-образцов в области температуры

80 см^-1, для L-образцов - 85 см^-1.

-40°C не превышало величины 10 см^-1.

Характер температурных эффектов в спектраль-

хода Trp* в CTS для L-образцов больше, чем для

ной области 400 нм < < 470 нм. Для молекул Trp*,

D-образцов (рис. 2).

флуоресцирующих в длинноволновом участке

спектра 400 нм < λ < 470 нм (область R), фазовый

Для температурной зависимости константы

переход водородных связей в окружении возбуж-

скорости обратного перехода k₂₁ (CTS → Trp*) в

денных молекул триптофана в основном завер-

средней области спектра флуоресценции наблю-

шен, водородные связи находятся в новом устой-

дается минимум в районе -40°C для образцов, за-

чивом положении за счет затухания флуктуаций

мороженных в темноте и на свету. Можно сделать

движения протонов вдоль водородных связей.

вывод, что в окружении молекул Trp, находящих-

В результате увеличивается их жесткость, что

ся в CTS-состоянии в температурной области фа-

вызывает соответствующее увеличение энергии

зового перехода свободная энергия перехода ΔG

реорганизации перехода. При этом в данной

температурной области в окружении возбужден-

уменьшается на большую величину, чем энергия

реорганизации E_r в уравнении (2). Такой эффект

ных молекул Trp за счет смещения протонов воз-

никает дополнительный дипольный момент в си-

вызывает дополнительную сольватацию молекул

стеме водородных связей. В результате взаимо-

Trp, перешедших в CTS-состояние. В результате

действия электрического поля возникающего

происходит уменьшение константы скорости об-

дипольного момента системы элементарных яче-

ратного перехода k₂₁ (рис. 2). Видно также, что в

ек Н-связей с возбужденным электронным состо-

образцах, замороженных на свету, константа ско-

янием молекулы Trp происходит ее дополнитель-

рости обратного перехода k₂₁ превышает значе-

ная сольватация, которая достигает максимума

ние k₂₁ в образцах, замороженных в темноте

при T_s = -40°C. Как следствие, в данной области

(рис. 2). Это, возможно, обусловлено тем, что

температур происходит уменьшение свободной

свободная энергия перехода ΔG для L-образцов

энергии перехода ΔG(T) и увеличение энергии ак-

уменьшается на меньшую величину за счет боль-

тивации перехода E_a (рис. 3). В результате в тем-

шего числа «замороженных» микроконформаци-

пературной области -80°C < T < -40°C наблюда-

онных искажений в системе H-связей в окруже-

ется уменьшение скорости перехода (рис. 3) и со-

нии молекул Trp на свету, чем для D-образцов.

ответствующее увеличение времени жизни

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

636

ГОРОХОВ и др.

Рис. 4. Температурный сдвиг спектров флуоресценции триптофана с ростом температуры. Заметно увеличение скорости

сольватационного сдвига спектров флуоресценции с ростом температуры в области фазового перехода в системе

водородных связей в окружении Trp* (-70°C < T < 10°C).

возбужденного состояния Trp* относительно

няется часть микроконформационных смещений

стандартной аррениусовской зависимости дан-

в системе водородных связей, что приводит к

ных величин с постоянной энергией активации.

смещению минимума температурной зависимо-

При росте температуры выше -40°C увеличива-

сти константы скорости обратного перехода

ется тепловая энергия протонов водородных свя-

CTS → Trp* в область -50°C и ее уширение на

зей, нарушающая их взаимное (mutual) взаимо-

10°C (рис. 2).

действие и происходит уменьшение ΔG(T). Как

Температурная зависимость спектров флуорес-

следствие, происходит уменьшение энергии ак-

ценции триптофана. На рис. 4 показано поведение

тивации E_a до значения стандартного Аррениу-

спектров флуоресценции триптофана с ростом

совского перехода и, соответственно, увеличива-

температуры для образцов, замороженных в тем-

ется константа скорости k₁₂. Видно (рис. 2), что

ноте. Для образцов, замороженных на свету, по-

скорости прямого перехода k₁₂ для образцов, за-

лучены близкие результаты. Отчетливо видно

мороженных на свету и в темноте, имеют близкие

увеличение скорости сольватационного сдвига

температурные зависимости, так как после завер-

спектров флуоресценции с ростом температуры в

шения фазового перехода практически все допол-

области фазового перехода в системе водородных

нительные микроконформационные изменения

связей в окружении Trp* (-80°C < T < 20°C), что

водородных связей на свету нивелированы. Отме-

связано с возникновением электрического поля,

тим, однако, что после перехода Trp в CTS-состо-

дающего вклад в дополнительную сольватацию

яние, в L-образцах наблюдается сдвиг темпера-

возбужденного состояния молекулы триптофана.

турной зависимости минимума скорости обрат-

ного перехода в область -50°C по сравнению с

Для детального анализа особенностей спек-

-40°C для D-образцов. Следовательно, в окруже-

тров флуоресценции Trp на рис. 5 показаны спек-

нии возбужденной молекулы Trp в CTS-состоя-

тры флуоресценции триптофана для температур

нии для образцов, замороженных на свету, сохра-

-60°C, -40°C, -20°C и 0°C. Проведена аппрок-

Таблица 1. Параметры разложения спектров флуоресценции триптофана на сумму гауссовых компонент

T, °C

(1) -60°C

(2) -40°C

(3) -20°C

(4) 0°C

AC1

0.64

0.77

0.78

0.79

λ_C1, nm

365.1

373.4

380.6

382.8

W_C1, nm

19.3

23.97

26.0

26.5

AC2

0.59

0.45

0.36

0.34

λ_C2, nm

386.1

398.9

408.7

412

W_C2, nm

33.1

35.7

37.9

39.1

Примечание. ACj - амплитуда, λCj - длина волны максимума, WCj - ширина j-й гауссовой компоненты спектра, j = 1,2.

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

ВЛИЯНИЕ ДИНАМИКИ МИКРООКРУЖЕНИЯ ТРИПТОФАНА

637

Рис. 5. Спектры флуоресценции триптофана вводном растворе при температурах -60°C, -40°C, -20°C и 0°C.

Проведено разложение спектров флуоресценции на две гауссовых компоненты (S_i(C₁)) и (S_i(C₂)). S_i (i = 1,2,3,4)

обозначают аппроксимацию i-го спектра суммой гауссовых компонент (S_i = S_iC₁+S_iC₂, показаны жирными линиями).

Компоненты разложения спектра (4) не показаны. Параметры разложения представлены в таблице. Данные

приведены для образцов, замороженных в темноте. Для образцов, замороженных на свету, получены близкие

результаты.

симация данных спектров суммой двух гауссовых

-110°C ÷ -80°С молекула Trp* действительно

компонент, результаты разложения представле-

сольватируется быстрее, чем CTS, поэтому на-

ны в табл. 1. Данные получены для образцов, за-

блюдается минимум кривой ΔEC_1,2. С дальней-

мороженных в темноте. Для образцов, заморо-

шим ростом температуры уже CTS начинает соль-

женных на свету, были получены близкие резуль-

таты.

На рис. 6 показана температурная зависимость

положений максимумов спектральных гауссовых

компонент разложения спектров флуоресценции

триптофана, а также скорости изменения поло-

жений этих максимумов от температуры. Данные

показаны для D-образцов. Отчетливо видно, что

максимальное увеличение скорости сольватаци-

онного сдвига наблюдается в области -40°C

для обеих компонент разложения. При этом по-

ведение кривых Δλ_m/ΔT в области температур

-80°C ÷ 20°C близко к форме кривых τ₁ и τ₂ в этой

же области температур (данные не приведены).

По нашему мнению, этот результат подтверждает

уже сделанный ранее вывод, что в указанной об-

ласти температур происходят конформационные

(фазовые) перестройки систем H-связей в

окрестности возбужденной молекулы Trp. Была

определена также разность энергий спектраль-

Рис. 6. Температурная зависимость положений спек-

ных максимумов состояний Trp* и CTS в см^-1 в

тральных максимумов компонент разложения спек-

зависимости от температуры. Результаты пред-

тров флуоресценции триптофана на гауссовы компо-

ставлены на рис. 7. Видно, что в области темпера-

ненты. λ_mC1 (•) соответствует компоненте флуорес-

тур от -170°С до -110°С разность энергий спек-

ценции Trp*, λ_mC2

(•) соответствует компоненте

тральных максимумов состояний Trp* и CTS при-

флуоресценции CTS. Данные зависимости показаны

мерно постоянна. Это соответствует случаю

для образцов, замороженных в темноте. Для образ-

«замороженной» сольватационной координаты.

цов, замороженных на свету, получены близкие дан-

ные. Δλ_m1/ΔT (j) и Δλ_m2/ΔT ( ) - скорости измене-

В области -110°С ÷ -80°С разность энергий спек-

ния положений максимумов первого и второго гаус-

тральных максимумов состояний Trp* и CTS

совых

компонентов

разложения

спектров

уменьшается, а затем начинает увеличиваться.

флуоресценции от температуры. Данные зависимо-

Как предполагалось ранее, в области температур

сти показаны в относительном масштабе.

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

638

ГОРОХОВ и др.

нии Trp* и CTS.Такой подход может, очевидно,

быть полезен и при исследовании переходов воз-

бужденных пигментов в белковой среде, облада-

ющей упорядоченной системой водородных свя-

зей. Состояние системы водородных связей во

многом определяет характер внутримолекуляр-

ной микроконформационной динамики водно-

белковой среды, влияющей на функциональную

активность триптофана.

Полученные в работе результаты во многом

объясняются уникальными свойствами водной

среды, ее переходами в неравновесные состоя-

ния, а также способностью к самоорганизации

при внешнем воздействии. Такие структурные

особенности воды изучались разными авторами

во многих работах. В частности, в работе [23] изу-

чали модуляцию спектра спонтанной флуорес-

Рис. 7. Разность энергий спектральных максимумов

ценции триптофана, при этом авторы интерпре-

компонентов разложения спектров флуоресценции

тировали воду и водные растворы как неравно-

триптофана ΔE_C1,2 в зависимости от температуры.

весные системы, способные к самоорганизации.

В работе [24] было показано, что неравновесность

воды обеспечивается сильно неравновесным от-

ватироваться быстрее, чем Trp*, это приводит к

ношением орто/пара-спиновых изомеров Н₂О,

увеличению разности энергий спектральных мак-

симумов состояний Trp* и CTS (рис. 7). Макси-

вращательные спектры которых в терагерцовой

мальный прирост разности энергий спектраль-

области обнаружены в воде методом нелинейно-

ных максимумов состояний Trp* и CTS происхо-

оптической спектроскопии когерентного анти-

дит в области температуры

-40°C. Таким

стоксового рассеяния. Способность воды к само-

образом, мы отчетливо видим, что с увеличением

организации было подтверждено в эксперименте.

температуры от -80°C до 10°C CTS сольватирует-

Так устойчивое образование льдоподобных

ся быстрее, чем состояние Trp*, так как в этой об-

структур в воде наблюдалось в воде при комнат-

ласти температур в окружении CTS структурный

ной температуре в работе [25]. Также существен-

(фазовый) переход захватывает большее количе-

но, что эти структуры формируются и в гидрат-

ство водородных связей, чем в окружении Trp*.

ных оболочках водных растворов спиртов [26],

Этот результат подтверждает уже сделанное нами

что позволяет существенно расширить номенкла-

предположение о том, что в температурном диа-

туру исследуемых сред, в том числе водно-белко-

пазоне от -80°C до 10°C происходит отступление

вых фотобиологических структур.

температурной динамики переходов возбужден-

ной молекулы триптофана от стандартного арре-

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

ниусовского поведения с постоянной энергией

активации за счет фазового перехода в системе

Авторы заявляют об отсутствии конфликта

водородных связей в ее окружении.

интересов.

Отметим, что обнаруженные в работе темпера-

турные зависимости константы скорости прямо-

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

го перехода Trp* → CTS (k₁₂) и обратного перехо-

Настоящая работа не содержит описания ка-

да CTS → Trp* (k₂₁) наблюдаются только для за-

ких-либо исследований с использованием людей

мороженных водных растворов триптофана, для

и животных в качестве объектов.

которых возможно возникновение упорядочен-

ной сетки водородных связей, тогда как для трип-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

тофана, например, в глицерине, такие эффекты

не наблюдаются (данные не показаны).

1. J. L.Dashnau, B. Zelent, and J. M. Vanderkooi, Bio-

phys. Chem., 114, 71 (2005).

Использованный в работе спектрально-дина-

2. D. E. Schlamadinger, J. E. Gable, and J. E. Kim, J.

мический подход при исследовании температур-

Phys. Chem. B, 113, 14769 (2009).

ных зависимостей процессов переходов возбуж-

денных состояний Trp позволил обнаружить и

3. Э. А. Бурштейн, Молекуляр. биология, 17, 455

обосновать возникновение неравновесных фазо-

(1983).

вых переходов в системе водородных связей в

4. A. G. Szabo and D. M. Rayner, J. Am. Chem. Soc.,

определенном диапазоне температур в окруже-

102, 554 (1980).

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023

ВЛИЯНИЕ ДИНАМИКИ МИКРООКРУЖЕНИЯ ТРИПТОФАНА

639

5. J. R. Lakowicz, Principles of fluorescence spectroscopy,

16. Р. Блинц и Б. Жекш, Сегнетоэлектрики и антисе-

3^nd ed. (Springer, New York, 2006).

гнетоэлектрики. Динамика решетки (Мир, М.,

6. P. D. Adams, Y. Chen, K. Ma et al., J. Am. Chem. Soc.,

1975).

124, 9278 (2002).

17. K. Vandewal, Annu. Rev. Phys. Chem., 67, 113 (2016).

7. J. A. Ross and D. M. Jameson, Photochem. Photobiol.

18. M. G. Müller, K. Griebenow, and A. R. Holzwarth,

Sci., 7, 1301 (2008).

Chem. Phys. Lett., 199, 465 (1992).

8. P. P. Knox, E. P. Lukashev, V. V. Gorokhov, et al., J.

Photochem. Photobiol. B: Biology, 189, 145 (2018).

19. Y. Miloslavina, M. Szczepaniak, M. G. Muller, et al.

9. P. P. Knox, V. V. Gorokhov, B. N. Korvatovsky, et al. J.

Biochemistry, 45, 2436 (2006).

Photochem. Photobiol. A: Chemistry, 393, 112435

20. R. A. Marcus and N. Sutin, Biochim. Biophys. Acta,

(2020).

811, 265 (1985).

10. В. В. Горохов, Б. Н. Корватовский, П. П. Нокс и

21. P. M. Krasilnikov, P. P. Knox, and A. B. Rubin, Photo-

др., Докл. РАН. Науки о жизни, 498, 19 (2021).

chem. Photobiol. Sci., 8, 181 (2009).

11. В. З. Пащенко, В. В. Горохов, Б. Н. Корватовский

и др., Биофизика, 66, 354 (2021).

22. А. Б. Рубин, Биофизика (М., 2013), т. 3.

12. J. Pieper, Th. Hauss, A. Buchsteiner, et al., Biochemis-

23. В. И. Лобышев, Б. Д. Рыжиков и Р. Э. Шихлин-

try, 46, 11398 (2007).

ская, Биофизика, 43 (4), 710 (1998).

13. W. Doster, Eur. Biophys., J. 37, 591 (2008).

24. S. Pershin and A. Bunkin, Laser Physics, 19, 1410

14. K. L. Han and G. J. Zhao, Hydrogen Bonding and

(2009). DOI: 10.1134/ S1054660X0907007X

Transfer in the Excited State (John Wiley & Sons Ltd.,

25. K. B. Jinesh and J. W. M. Frenken, Appl. Phys. Lett.,

Chichester, UK, 2011).

101, 036101 (2008).

15. H. Liu, H. Zhang, and B. Jin. Spectrochim. Acta. Part

A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 106, 54

26. J. Davis, K. Gierszal, P. Wang, and D. Ben-Amotz,

(2013).

Nature, 491, 582 (2012). DOI: 10.1038/nature11570

Influence of the Microenvironment Dynamics of Tryptophan on Its Fluorescence

Parameters at Different Temperatures

V.V. Gorokhov*, P.P. Knox*, B.N. Korvatovsky*, S.N. Goryachev*, V.Z. Paschenko*, and A.B. Rubin*

*Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskie Gory 1/12, Moscow, 119991 Russia

The temperature dependences of the fast and slow fluorescence decay components of aqueous solution of

tryptophan molecules after freezing to -170°C ÷ 20°C under actinic light and in the dark were investigated.

A model of the direct and reverse electronic transitions from an excited state to the ground state and to the

state with charge transfer for a tryptophan molecule was used to perform quantitative analysis. Three main

spectral regions of tryptophan fluorescence are shown, they differ in the behavior of the temperature depen-

dences depicted for the rates of transition from the excited state of tryptophan to the state with charge transfer.

It has been shown that the dynamics of the hydrogen bonded system plays a key role in this transition. The

system of hydrogen bonding determines the nonlinear nature in tryptophan fluorescence in the selected spec-

tral regions. The non-linear behavior of the fluorescence lifetime and fluorescence spectra with temperature

change is determined by the type of the interaction of tryptophan with water and ice. It has been found that

temperature rearrangements play a critical role in hydrogen bonding structure of H₂O ₂ that surrounds a tryp-

tophan molecule in the excited state.

Keywords: tryptophan, fluorescence decay kinetics, temperature dependence, hydrogen bonds, molecular

dynamics

БИОФИЗИКА том 68

№ 4

2023